여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 - 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.
서론
많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비.
아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 - 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14
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프로토콜
관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대
- 열 - 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco's은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크에 넣고 피펫 1ml를 14 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 혈구를 이용하여 세포 수를 분석한다.
- 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 HEK293 세포는 24 시간 동안 배양한다.
- 형질 감염을 위해 형질 전환 시약의 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용한다. 형질 전환 시약을 사용하여있는 pEGFP-C2 나있는 pEGFP-C2-CaeB와 세포를 형질. 사용 형질 reag을 따뜻하게 이전ENT과 RT에 필요한 매체. DNA로 형질 전환 시약 : 1 비율 3을 사용합니다.
- 구체적으로는, 피펫 직접 무 혈청 DMEM 배지 50 ㎕를 형질 감염 시약....
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결과
먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP - CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP - CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 없습니다. 따라서, 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주는 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 양쪽 세포주에서 세포의 90 % 이상은 GFP를 발현. 따라서, 이들 안정적인 세포주는 또한 CaeB의 기능을 분석하는데 사용될 수있다. 다음 단계에서, CaeB의 세포 자멸 억제 활성은 PARP 절단에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석으로 측정 하였다. 핵 PARP의 단백질 분해 절단은 DN.......
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토론
많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도구 개발하는 데 도움이 될 수있다. 더욱이, 효과기 단백질 자주 숙주 세포 활동을 모방하여 그 기능을 발휘하는 것처럼, 이들은 또한 하나의 진핵 세포 생물학에 대한 자세한 내용을 사용할 수있다. 효과기 단백질 중 1) 기능의 중복, 효과기 단백질의 결합, 2) 시간 조절 및 3) effec : 그러나, 단일 이펙터 단백질의 생화학 적 활성을 연구하는 것은 여러 가지 이유로 복잡 할 입증그 기능을 방해, 다른 이펙터 단백질과 문맥에서 작업 토르 단백질. 따라서, 이펙터 단백질의 활성은 일반적으로 과발현 연구가 검토되고있다. 불행하게도, 이.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)의 지원을 받았으며, A.L. 및 C.B.에 대한 Collaborative Research Initiative 796(SFB796)을 통해, 그리고 A.L.에 대한 ERA-NET PathoGenoMics 3차 호출을 통해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | 생명 과학 기술 | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| 펜/연쇄상 구균 | 생명 과학 기술 | 15140-122 | |
| OptiMEM | 생명 공학 | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF 멤브레인 | Millipore | 는 | |
| 있습니다 | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 | Thermo Scientific | 46428 |
참고문헌
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death member....
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재인쇄 및 허가
