방법 논문

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

DOI:

10.3791/52919

⸱

2015년 5월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

이 논문에서

요약

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우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

초록

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인산화 된 세포 외 조절 키나아제 (PERK)의 유도는 학습에 의존하는 신경 활성화의 안정적인 분자 판독입니다. 여기, 우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하는 특권 면역 프로토콜을 설명합니다. 마우스, 자폐증 스펙트럼 장애의 모델 (ASD) 특히, 우리는 모리스 물 미로 Engrailed-2 녹아웃에 (MWM, 고전 해마에 의존하는 학습 과제) (- - / EN2) 다음 신경 세포의 활성화를 연구하는 특권 면역 염색을 사용했다. 야생형 (WT) 대조군과 비교 된 바와 같이, EN2 ​​- / - 마우스는 MWM 상당한 공간 학습 결핍을 보였다. WT 동물과 비교하여, 마우스 - / - MWM 후에 특권 양성 뉴런의 수에 큰 차이가 특정 해마 EN2의 서브 필드에서 검출된다. 따라서, 우리는 견고하게 프로토콜의 차이를 검출 할 수있다ASD의 마우스 모델에서 해마에 의존하는 학습 장애에 관련된 특권 양성 신경 세포. 보다 일반적으로, 우리는 프로토콜인지 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에서 해마의 신경 세포 활성의 프로파일을 조사하기 위해 적용될 수있다.

서론

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신경 발달 장애와 같은 중추 신경계 (CNS)의 발달 및 성숙은 초기의 교란되는 다운 증후군, 깨지기 X 증후군 (FXS), 레트 증후군, 신경 섬유종증, 결절성 경화증 ASD 같은 장애의 다양한 이기종 기가 포함 산전 기간 1. 이러한 발달 뇌 기능 장애는 운동 기능, 언어, 학습과 기억 과정에 깊은, 평생 효과가 발생할 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 과다는 지난 몇 년 동안 2,3- 신경 발달 장애의 병인에 연루되어왔다. 임상 적 표현형을 기본 분자 메커니즘은 알려지지 남아 있더라도, 상술 한 결과는 이런 질환의 여러 마우스 모델의 개발을 허용했다. 학습 및 기억 결핍은 이러한 TSC1 +/- +/-, TSC2 이러한 마우스 모델에서 식별 번호되었습니다NF1 + 및 EN2 - / - 마우스 2,4-7. 신경 발달 장애의 분야에서 중요한 과제는 세포 및 분자 적 프로세스 메모리를 기본 및 학습의 기능 장애를 식별한다. 학습 또는 메모리 동안 활성화 선택한 신호 경로는 특정 유전자의 전사를 유도하고 궁극적으로 드 노보 단백질 합성으로 이어질 수 있습니다. 즉시 - 초기 유전자 (IEGs) 활성화 및 단백질에 의존하는 시냅스 수정은 빠르게 연결 활동 및 행동 훈련 8,9에 대한 응답으로 뇌의 신경 세포에서 유도된다.

neurofibromin을 포함하는 신호 전달 경로의 적자는 신경 발달 장애의 장애 학습과 관련이있다. Neurofibromin 누구의 변이 신경 섬유종증 제 1 형, 복잡한 유전 적 증후군은 신경계 종양, 행동 및 모터 지연,인지 DISA 특징으로 원인 NF1 유전자의 제품이다bilities 10. 억제 뉴런에 제한 NF1 삭제에 대한 마우스의 이형은 MWM 5,11,12의 장기 강화의 초기 단계 (LTP)뿐만 아니라 손상된 공간 학습 결손을 보여줍니다. 흥미롭게도,이 마우스 모델에서 NF1 결핍이 증가 ERK의 인산화에 마지막으로 이러한 뉴런 5에서 GABA 릴리스의 이상 향상의 결과로 학습하는 동안 억제의 interneurons에서 라스 신호의 오버 활성화로 연결됩니다.

이러한 발견에 기초하여, 행동 작업 후 신경 활성의 시각화는 신경 발달 질​​환에 관여하는 특정 회로를 재구성 할 수있는 방법을 나타낸다. 여기에 설명 된 면역 프로토콜은 평가하고인지 결핍과 ASD 마우스 모델을 MWM 다음 해마 ERK 인산화 수준을 정량화하는 것이다. MWM 널리 설치류 13, 14의 해마에 의존 공간 학습과 기억을 조사하는 데 사용됩니다 까지. 우리는 ERK는 학습과 기억 형성 (15)에 필수적인 역할을하는 것으로 되었기 때문에, 작업에 의존하는 해마 학습의 분자 판독으로 ERK의 인산화를 사용하기로 결정. 또한, ERK 경로는 개발 시각 피질 (16)의 경험에 의존하는 소성 필요합니다. 마지막으로, CNS 쇼 두 ERK 이성체 (ERK2) 중 하나가 결여 된 마우스는 ERK 신호는 ASD 같은 신경 발달 장애의 발병 기전에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타내는,인지 감정적 사회적 행동 (17)에 이상을 표시했다.

신경 발달 장애의 모델로 마우스 (- - / EN2) 우리는 Engrailed 2 녹아웃을 사용했다. EN2 - / - 마우스는 전뇌의 interneurons (18)의 손실을 포함하여 해부학 적 및 행동 "ASD 같은"기능, ASD 관련 유전자 (19)의 감소 표현을 보여, 사교성을 감소하고, 장애인지 적 유연성 6,7,20. 공간 learniNG 및 MWM에서 검출 된 것과 같은 메모리 결함, EN2 ​​특히 견고 - / - 마우스 6,7 및 ASD 환자 21에서 관찰 된인지 장애와 관련이 있습니다. - / - 성인 마우스 (7) 또한, 우리는 MWM에 손상 공간 학습이 감소 neurofibromin의 발현과 연관 EN2의 hilus의 특권 레벨을 증가 것으로 나타났다. 여기에서 우리는이 ASD 마우스 모델에서 MWM을 다음과 특권의 면역 조직 화학적 특성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

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프로토콜

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모든 실험은 유럽 공동체 지침 63분의 2,010 / 유럽 연합 (EU)에 부합 실시하고, 건강의 이탈리아 교육부에 의해 승인되었다.

1. 동물 관리, 주택 및 치료

  1. 각각의 기관 동물 관리의 지침에 따라 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜을 수행합니다.
  2. 음식과 물을 사용할 수 임의로와 12 시간의 빛 / 어둠주기에서 동물을 유지한다.
  3. 하우스는 톱밥과 침구 재료와 표준 크기의 폴리 카보네이트 마우스 케이지에서 2-4의 그룹에서 마우스는 매주 변경.
  4. 질병에 대한 감수성이 신경 발달 장애의 다른 마우스 모델에서 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에, 연령과 성별 일치 마우스를 사용합니다.
  5. 통계적 유의성 (행동 연구에 대한 유전자형 당 10 마우스 및 면역 조직 화학 실험에 대한 유전자형 당 4 마우스의 최소)에 도달하는 동물의 적절한 수를 선택합니다.

2. 모리스 물 미로 (MWM)

  1. 원형 탱크 (지름 100cm, 높이 50cm)를 사용합니다.
    1. 탱크 주위의 객실 디바이더에 시각적 단서를 놓습니다.
    2. 4 개의 상상의 사분면 (quadrant) 중 하나의 중심에 고정 된 위치에서 탱크로 10cm 직경 플랫폼을 놓는다. 모든 교육 세션에 걸쳐 모든 시험에 대해 동일한 사분면에 숨겨진 플랫폼을 유지합니다.
    3. 플랫폼이 수면 위에 1cm 때까지 수돗물로 풀을 입력합니다. 평형 물 온도는 22 ° C에 가까워 야합니다; 이 단계는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 물 온도가 평형에 요구되는 시간을 단축하는 것이 온수를 추가한다.
    4. 물이 불투명하기 위해 흰색, 무독성 페인트의 약 1.5-2 L을 추가합니다.
  2. 트랙 취득 절차
    1. 표준 CCD 카메라와 비디오 보드와의 MWM 추적 시스템을 설정한다. 이러한 경로 길이와 같은 여러 변수를 모니터링하고 분석하는 비디오 추적 시스템을 선택 ESCA체육 대기 시간 및 시간은 각 사분면에 보냈다.
    2. 네 사분면에 경기장을 나누고 라이브 추적을위한 동물과 배경 사이의 최적의 대비를 보장하기 위해 탐지 설정을 조정합니다.
    3. 플랫폼 영역을 지정합니다.
    4. 60 초와 최대 시험 시간을 설정합니다.
  3. MWM 테스트
    1. 행동 테스트에 앞서, 쥐에게이 풀 또는 공간 큐를 볼 수없는 지역에서 20 ~ 25 분의 적응 기간을 허용합니다.
    2. (그들 사이에 20 ~ 30 분 간격으로, 하루에 두 개의 연속적인 시련을) 구일 각 마우스를 훈련.
    3. 컴퓨터와 카메라를 켜고 비디오 추적 시스템 소프트웨어를 시작합니다.
    4. 꼬리로 마우스를 가지고 머리가 네 시작 위치 (북쪽, 남쪽, 동쪽, 서쪽) 중 하나에서 시작, 풀의 측면으로 지적으로, 물에 넣습니다. 각 마우스의 경우, 시작 위치는 다른과 시련을 통해 pseudorandomized해야한다.
    5. 마우스 수영을하자 platf 검색60 초의 최대 ORM. 동물이 플랫폼에 도달하면, 그것은 20 초 동안 플랫폼에 머물 수 있습니다.
    6. 마우스가 그 시간 내에 플랫폼의 위치를​​ 실패하면, 부드럽게 꼬리를 잡고, 플랫폼에 마우스를 안내하고 20 초 동안 거기에 머물 수 있습니다. 동물이 모두이 시험을 완료하면, 수건으로 닦아 건조와 케이지에 다시 넣어.
    7. 훈련 기간 매일, 동일한 절차 (단계를 2.3.4-2.3.6) 반복합니다.
    8. 마지막 훈련 흔적 후 9 일에 프로브 테스트를 수행합니다.
    9. 풀에서 플랫폼을 제거합니다.
    10. 마우스 수영을하자 60 초 최대의 플랫폼을 검색합니다.
    11. 주기적으로, 그것은 동일한 (22 ° C)이어야되도록 수온을 확인 풀을 청소.

관류 동물에서 섹션 3. 준비

  1. MWM의 끝에서 마우스를 희생한다. 유전자형 당 네 개의 마우스는 euthaniz하기 전에 마취해야지역 및 국제 가이드 라인에 따라 ATION.
  2. (출혈을 허용하는 가위 auriclewith 권리를 잘라 관류하는 좌심실에 나비 정맥을 소개)로 transcardially 동물을 관류 10 ~ 15를위한 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 다음 인산염 완충 생리 식염수 4-5 분 (PBS)로 분 (22).
  3. 해부 적어도 12 시간 동안 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 머리를 포스트 - 수정.
  4. 슬라이스에 필요한까지 4 ℃에서 15 0.1 M PBS에서 0.02 % 아 지드 화 나트륨 ml의 저장을 포함하는 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 튜브의 두뇌를 놓습니다.
  5. 잘라 vibratome 절단하기 전에 소뇌를 제거합니다.
  6. vibratome의 홀더 판에, superglue를 사용하여 절단 사이트와 뇌를 똑바로 접착제.
  7. 적절한 vibratome에, 지느러미 해마에 걸쳐 일련 위해, 20 ~ 40 μm의 두께 코로나 섹션으로 뇌를 잘라.
  8. 페인트 브러시와 vibratome 슬라이스를 수집하고 2로 전송각 웰에 0.1 M PBS 1 ㎖를 함유하는 4 멀티 웰 플레이트.
  9. 4 ºC에서 PBS에서 0.02 % 아 지드 화 나트륨의 PBS에 단기 또는 장기 저장 섹션 (조직은 최대 1 년까지 사용할 수 있습니다).

4. 면역 조직 화학

  1. 전송 각 웰에 0.1 M PBS 500 μL를 포함하는 24 멀티 웰 플레이트에 각 마우스 3-5 등의 해마 부분.
  2. 0.1 M PBS 500 μL (5 분, 부드러운 떨고 3 회) 잘 각각에 포함 된 부분을 씻으십시오.
  3. 교반과 함께 20 분 동안 PBS에서 1 % H 2 O 2 섹션을 배양하여 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 켄 칭하고.
  4. 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오.
  5. 조직 투과성으로는 : PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 5 분 동안 배양 섹션.
  6. 위의 단계 (4.4, 4.5) 동안, (한 접점 전체 실험에​​ 대한 충분한 차단 버퍼 (PBS에서 10 % 염소 혈청과 0.1 % 트리톤-X100)를 만들섹션의 R × 100 μL × 3 단계).
  7. 주 : (비오틴에 접합) 이차 시종되었다되는 동일한 종으로부터의 혈청을 사용.
  8. 교반과 함께, 실온 (RT)에서 1 시간 동안의 버퍼 (100 μL / 제)를 차단 섹션을 배양하여 비 특이 적 항체의 결합을 방지.
  9. 교반과 함께, 4 ° C에서 하룻밤, 버퍼를 차단에 희석 차 Ab의 (PERK)에서 섹션을 품어.
  10. 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오.
  11. 교반과 함께 RT에서 1 시간 동안 (단계 4.6에서 사용 된 것과 동일)를 차단 완충액에 희석 : 바이오틴 (250 1)와 접합 이차 Ab의 함께 인큐베이션.
  12. 아비딘 및 비오틴 복잡한 실온에서 적어도 30 분을 필요로하기 때문에, 동시에 ABC 시약을 준비한다.
  13. 제조 업체의 프로토콜에 따라 ABC 시약의 필요한 양을 준비합니다.
  14. 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오.
  15. IncubatABC 시약을 실온에서 45 분 동안 전자 섹션.
  16. 교반과 (3 × 5 분)와 0.1 M PBS로 섹션을 씻으십시오.
  17. DAB 솔루션 작업 준비 DAB 발암 및 기형이기 때문에, DAB와 관련된 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야합니다.
  18. 플라스틱 전송 피펫으로 새로운 판에 DAB 솔루션을 전송합니다.
  19. 손으로 솔루션 천천히 소용돌이 판을 작업 DAB를 포함하는 판에있는 장소 섹션, 섹션에 최대 노출을 허용합니다.
  20. 적절한 신호가 개발 될 때까지 현미경에 DAB 반응 (2-5 분)을 모니터링합니다.
  21. 0.1 M PBS (3 × 5 분)에 조직을 세척하여 원하는 색상 강도로 반응을 정지.
  22. 하룻밤 흄 후드에 남아있는 DAB 기판 솔루션을 비활성화하고 실험실 규정에 따라 폐기하기 위해 표백제를 사용합니다.
  23. 젤라틴의 마운트 부분은 PBS에 부유하여 슬라이드를 코팅. 실온에서 3-4 시간 이상에서 말린다.
  24. 50 %의 부분을 순차적으로 탈수, 70 %, 95 %100 % 2 분마다 에탄올, 5 분 동안 100 % 크실렌 명확하고.
  25. 설치 매체를 사용하여 coverslip에 밤새 건조 흄 후드에 둡니다.

5. 세포 수

  1. 카운트 특권 양성 세포는 등쪽 해마의 수준에서 3-5 절은 동물별로 분석해야한다.
  2. 적당한 현미경을 사용하여 200 배의 배율로 각 섹션에서 여러 명 시야 이미지를 수집하고, 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 조립한다.
  3. ImageJ에 무료 소프트웨어를 사용하여 TIFF 변환 모자이크 이미지에 세포 수를 수행합니다.
  4. 100 × 100 ㎛ 각의 2-3 계산 상자를 통해 hilus 및 과립 세포층의 특권 - 염색 된 세포를 계산합니다.
  5. 세포 밀도는 카운팅 창 (100 × 100 ㎛) 당 표지화 된 세포의 수로서 표현 될 것이다.
  6. 유전자형 사이에 유의 한 차이를 평가하기 위해 통계 분석을 수행합니다. 이것은 스튜던트 t로 달성 될 수있다테스트 또는 ANOVA 상용 소프트웨어를 사용하여 해당 게시물을 임시 테​​스트 하였다. P <0.05에서 설정 통계적 유의 수준.

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결과

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여기에 설명 된 프로토콜이 면역 조직 화학에 의해, 가시화하기 위해 설계되었으며, 신경 발달 장애의 마우스 모델에서 MWM 후에 해마의 신경 세포 활성의 특이 마커의 발현. 여기에 기술 된 모든 실험 데이터는 우리의 최근 연구 7에서 촬영되었다. 남성과 여성 (WT) 및 EN2 - / - (3-5개월 된 중량 = 25-35g) 연령대 성인 한배 새끼 이형 교배에서 얻은 사용 하였다. 스물 두 마우스 (유전자형 당 11) MWM에 사용 하였다. 여덟 마우스 (유전자형 당 4) MWM 프로브 시험의 끝에 희생 면역 실험에 사용 하였다.

EN2의 공간 학습 결손의 평가 - / - 마우스

- / - 특히 EN2의 공간 학습 결손의 존재 검사하려면 마우스를, 우리는 MWM 테스트, 고전 해마에 의존하는 공간 학습 작업

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토론

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- / - 마우스, 신경 발달 장애의 마우스 모델 여기서 우리는 신경 EN2에 MWM을 다음 활성화를 공개하기위한 특권 면역 조직 화학 프로토콜을 제공합니다. - / - 특권 레벨의 감소 EN2 CA3의 서브 필드에서 검출 된 돌연변이 WT에 비해. 다르게 CA3 서브 필드, 특권 양성 신경 세포의 일반적인 증가에서 관찰 된 것과 대신 모두 hilus에서 검출되었고, EN2의 GCL - / - 마우스 (WT)에 비해. ERK의 인산화 수준이 반대 경향의 가능한 설명은 MWM 다음과 같은 특권 유도의 서브 필드 고유의 메커니즘에 의존하고 있습니다.

프로토콜은 데이터 MWM 뇌 정착, 선택과 항체의 교정 세척 절차, 신호 검출 및 셀 카운팅 절차의 평가와 같은 여러 가지 중요한 단계를 포함한다. 이러한 모든 중요한 단계 신중 고품질 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 수행되어야한다. 예를 들어, 뇌가 N이면(3.2 및 3....

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 도움을 CIBIO (트 렌토 대학)과 CNR 신경 과학 연구소의 행정 직원을 감사드립니다. 조반니 Provenzano는 Fondazione Veronesi (밀라노, 이탈리아)에서 박사 후 친교에 의해 지원됩니다. 이 작품은 이탈리아 대학의 연구부 (PRIN 2008 부여 # YB에 200894SYW2_002 및 PRIN 2,010에서 2,011 사이 부여 # 2010N8PBAA_002), 트 렌토 대학교 (YB에 CIBIO 스타트 업 허가) 및 텔레 톤 재단 (에 부여 # 1 GGP13034에 의해 투자되었다 YB).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EthoVision XT 8Noldus 정보 기술이 소프트웨어 플랫폼은 요구 사항이 아니며 시장에는 다른 많은 행동 소프트웨어가 있습니다.
템페라 페인트조토 - Fila Group Company백색 및 액체, 무독성. Morris 물 미로에서 불투명한 물을 준비하는 데 사용됩니다.
VibratomeLeicaVT1200타사의 동급 모델을 사용할 수 있습니다.
24웰 플레이트시그마CLS3524
100% 에탄올Fisher ScientificA406-20슬라이드 장착 전에 탈수를 위한 에탄올 그라디언트를 만드는 데 사용됩니다.
XyleneVWR66004-950독성 - 후드 아래에서 사용됩니다. 용도에 따라 매월 자일렌을 변경하십시오. 
아지드나트륨시그마  S2002
PBS시그마P3813-10PAK
ddH2O
트리톤 X-100시그마 T-8787
수소 과산화물시그마H1009-100ML
일반 염소 세럼AbcamG9023-10ML
ABC 키트 Vectastain Vector LaboratoriesPK-6100PBS 5ml의 용량에 시약 A 2방울을 넣고 섞은 다음 시약 B 2방울을 넣고 섞습니다.
DAB peroxidase substrateVector LaboratoriesSK-41005 ml ddH2O의 부피를 추가합니다: 완충액 저장 용액 2방울 및 혼합; DAB 및 혼합물 4방울; H2O2 2방울 및 혼합합니다.
[헤더]
pERK 항체세포 신호 기술 4370희석 1:500
Biotinylated 염소 안티-토끼 IgG 항체벡터 연구소BA-1000 희석 1:250
SuperFrost 슬라이드 Carl Roth1879
CoverslipsFisher12-548-B
DPXSigma317616슬라이드용 마운팅 매체. 동등한 장착 매체를 사용할 수 있습니다.
현미경  자이스 Axio Imager.M2동급 현미경을 사용할 수 있습니다.
어도비 포토샵어도비 시스템즈, 산호세, 캘리포니아이미지를 조립합니다.
ImageJ SoftwareNational Institute of Health무료 소프트웨어를 다운로드할 수 있습니다 http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (USA)분석을 위한 동등한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
Prism 6GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)통계 분석을 위한 동등한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
에서 통계

참고문헌

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