호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
호중구 순환 모든 인간 백혈구의 가장 풍부한는 침입 미생물에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을한다. 또한, 호중구는 종양 세포의 면역 감시에서 중심적 역할을한다. 이들은 어느 과산화수소 또는 항체 - 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 통해 관련된 세포 의존성 접촉 메커니즘을 통해 종양 세포의 사멸을 종양 세포를 인식하고 유도 할 수있는 능력을 가지고있다. 항암 활성을 갖는 호중구 암 환자의 종양 - 함유 마우스의 말초 혈액으로부터 분리 할 수있다. 이러한 호중구는 현저한 종양 세포 상해 활성을 보여 정상인 또는 나이브 마우스의 호중구 구별하는 종양 혼입 호중구 (TEN)를 지칭한다. 다른 백혈구에 비해 호중구 밀도 구배 실시 때 실현> 98 % 순수 호중구 집단을 얻을 수있다 다른 부력을 나타낸다. 그러나, 또한통상 고밀도 호중구 인구 (HDN)에, 암 환자에서 종양 - 함유 마우스에서뿐만 아니라 만성 염증성 조건 하에서 구별 저밀도 호중구 인구 (LDN)는 순환 나타난다. LDN는 단핵구 분획 공동 정제 및 양성 또는 음성 선별 전략을 사용하여 단핵 세포로부터 분리 될 수있다. 절연 호중구 순도 유동 세포 계측법에 의해 결정되면, 이들은 시험 관내 및 생체 기능 분석에 사용될 수있다. 우리는 호중구의 항 종양 활성을 모니터링하는 능력 마이그레이션 및 반응성 산소 종을 생성 할뿐만 아니라 생체 탐식 능력을 모니터링하는 방법을 설명한다. 우리는 또한 생체 내 추적 호중구 레이블을 기술을 설명하고 생체 내에서 자신의 안티 전이성 용량을 확인할 수 있습니다. 이러한 모든 기술은 획득 및 항 종양 호중구를 특성화하는 방법을 이해하는데 필수적기능.
서론
호중구는 처음에 침입하는 미생물에 대한 첫 번째 줄에 방어 역할을 타고난 면역 세포 특징했다. 오늘은, 호중구가 더 많은 기능을 광범위한 것으로 알려져있다가, 외국 항원 1, 2에 적응 면역 반응을 장착 조혈 3, 4 혈관 신생을 조절하는 5 상처 치유에 관여된다. 또한, 호중구는 프로 및 항 종양 활동 -6,7-의 덕에 의해 종양의 성장 및 전이성 진행에 영향을 미칠 수있다. 호중구는 다형성 분할 핵을 특징으로한다 (따라서 다형 (PMN) 백혈구라고합니다) 적어도 세 과립의 별개의 서브 클래스뿐만 아니라 분비 소포 8 (그림 1A-C)를 포함한다.
호중구는 식균 높은 용량 및 미생물 제거를위한 임계 높은 NADPH 옥시 다제 활성을 갖는 한에 중요한 케모카인의 다양한 분비추가 호중구 염증 8,9의 사이트에 다른 면역 세포의 견인. 호중구는 수신자와 같은 수용체 (TLR들)을 포함한 표면 수용체의 대량 발현을 특징으로, C 형 렉틴 수용기 (CLRS)는, 수용체 3 (하여 CD11b / CD18)과 다른 부착 분자 (예를 들어, L 셀....
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프로토콜
동물 5-7 주령 BALB / c 마우스는 할란 (이스라엘)에서 구입. 동물과 관련된 모든 실험은 히브리 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 인간의 샘플 : 암 환자와 건강한 자원자에서 혈액의 컬렉션을하다 사 병원 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인을 받았다.
유방암 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 항암 특성을 가진 호중구 1. 유도.
주 : 모든 단계 층류 (LAF) 바이오 안전 캐비넷 멸균 용액을 사용하여 수행되어야한다.
- 10 둘 베코 변성 이글 배지 ㎖ (DMEM), 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 4.5 g / L D- 글루코스를 함유하는, 2 mM의 D-에서 100mm 조직 배양 플레이트에 시드 5 × 5 4T1 세포 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 U / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트. 일을 품어3-4일 대해 5 % CO 2를 함유하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 E 세포. 실험의 날에 100 % 합류 - 세포가 50 있는지 확인합니다.
- 조직 배양 플레이트에서 ....
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결과
최근의 연구에서 우리는 호중구 6 항 전이 기능을 확인 하였다. 종양 베어링 마우스에서 호중구는 세포 독성 표현형을 획득하고 종양 세포 (6)를 죽일 수있는 능력을 가지고있다. 이는 현저한 항 종양 효과가없는 6 나이브 마우스의 호중구는 대조적이다. 프로토콜 절에 설명 된 여러 기술은 시험 관내 및 생체 내 6 항 종양 호중구 기능 연구를 위해 사용되어왔다.
종양 세포 독성은 호중구 종양 - 함유 마우스 (6)로부터 획득 될 수있다. 이 목적을 달성하기 위하여, 생쥐는 동소 좌측 서혜부 유방 지방 패드로 4T1 세포 (1 프로토콜)로 주입 하였다. 2 CM 3 (도 3 - - 종양 좌하 복부 분명) 21 일 후 종양 접종하여 1 차 종양의 크기에 도달 하였다. 이때, 마우스를 안락사시키고, 1 mL의 혈액 (마우스.......
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토론
호중구는 모든 백혈구 가장 풍부하며, 감염 및 염증의 경우 최초 대응한다. 이와 같이, 이들은 외부 큐에 매우 민감하고 쉽게 활성화된다. 또한, 호중구는 매우 짧은 반감기 및 빠른 회전율을 갖는다. 함께, 이러한 특성은 독특한 실험적인 전략이 필요되도록 호중구, 작업에 여러 가지 어려움을 올립니다. 예를 들어, 여러 호중구 정화 전략은 자신의 장점과 단점 각이있다.
호중구 작업에서 중요한 단계는 전체 혈액에서 자신의 정화입니다. 호중구 효율적 밀도 구배 또는 항체 기반 전략 (양 또는 음의 선택)을 사용하여 정제 할 수있다. 그것은 최소 비특이적 활성화와 고순도 호중구 높은 수치를 산출 이후 우리가 선택한 방법은 밀도 구배를 사용하는 것이다. 그러나, 우리는 최근의 연구 (21)에 표시로, 재치H 종양 진행 호중구 단핵 저밀도 분획 높은 번호에 축적된다. 밀도 구배의 사용은 고순도, 고밀도 호중구 분획을 제공하는 이러한 조건에서 그 전체를 순환하는 호중구 .......
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공개 사항
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감사의 글
ZG는 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 11분의 41)의 I-CORE 프로그램에서 보조금 지원, Abisch-Frenkel 재단, Rosetrees 신뢰, 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상) 및 관심사 재단. ZGF가 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상)에서 보조금 지원, 건강의 이스라엘 정부와 이스라엘 폐 협회의 수석 과학자.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포주 | |||
| 마우스 4T1 유방암 세포 | ADCC | CRL-2539 | 성장 매체: DMEM + 10 % 열-비활성화 FBS |
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| 24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | 멸균 |
| 100mm 조직 배양 플레이트 | Corning | 430167 | 멸균 |
| 25 cm2 조직 배양 플라스크 | Nunc | 156340 | 멸균 |
| 90 mm 세균 등급 배양 접시 | Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘 | 20090-01-017 | 멸균 |
| 15 ml 멸균 원추형 원추형 원심분리기 튜브 | Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘 | 835015-40-111 | 멸 |
| 균 50ml 멸균 원추형 원심분리기 튜브 | Miniplast, Ein Shemer, 이스라엘 | 835050-21-111 | Sterile |
| Falcon 12 x 75 mm 라운드-바텀 폴리스티렌 튜브 | Becton Dickinson | 352058 | 멸균 |
| Millicell 24 마이그레이션 플레이트는 5&mu의 기공 크기를 가지고 있습니다; 엠 | Merck Millipore | PSMT010R1 | 멸균 |
| 화이트 96-플랫-바텀 웰 플레이트 | Costar | 3917 | 멸균 |
| 세포 여과기 (40 mm) | BD Falcon | 352340 | 멸균 |
| 20G x 1.5" 바늘 | BD Microlance 3 | 301300 | 멸균 |
| 23G x 1" 바늘 | BD Microlance 4 | 300800 | 멸균 |
| 25G x 5/8" 바늘 | BD Microlance 5 | 300600 | 멸균 |
| 0.3 ml 주사기와 30G x 8mm 바늘 | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | 멸균 |
| 9 mm 클립 | BD, 오토클립 | 427631 | 멸균 |
| EasySep 자석 | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS 분리 컬럼 | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | 멸균 |
| MidiMACS 분리기 자석 | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| 현미경 유리 슬라이드 | 멘젤-Gl ä ser 슈퍼프로스트 플러스 써모 | J1800AMNZ | |
| 오비탈 쉐이커 | 스카이 라인, ELMI | S-3.02.10L | |
| 플레이트 리더 | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POWDER | |||
| 소 혈청 알부민(BSA), 분획 V | 시그마 | A7906 | |
| 브로모데옥시우리딘(BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | 멸균 |
| CFSE (5-(및 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | 분자 프로브 | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| 돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염 | Sigma | H3149 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | 고독성, 조심해서 다루세요 |
| Thioglycollate 분말 | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| 미디어 및 보충제 | |||
| Dulbecco의 수정된 이글 매체 (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® 나는 세럼을 중간 줄였습니다 | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovine serum (FBS), 열 비활성화 | Sigma | F9665 | Sterile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
| Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | 멸균 |
| 페니실린 스트렙토마이신 x 1000 용액 | Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘 | 03-031-5 | |
| Mg2+ 및 Ca2+ 가 없는 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) | Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘 | 02-023-1 | |
| Ca2+ 및 Mg2+ 없이 멸균 PBS x 10 | Biological Industries, Beth HaEmek, 이스라엘 | 02-023-5A | 멸균 |
| HPLC 등급 물 | J.T. Baker | 4218-03 | 오토클레이브 |
| 솔루션 | |||
| ACK – 암모늄-염화물-칼륨 | 생명 기술 | A10492-01 | |
| PBS에 Bromodeoxyuridine(BrdU) 용액(10mg/ml) | 1ml PBS 및 멸균 필터에 BrdU 10mg을 용해합니다. | ||
| CFSE, DMSO | 1ml DMSO에 CFSE 2.8mg을 용해합니다. 멸균 200ml 튜브에 10ml 분취량으로 나누어 -20oC의 어두운 곳에 보관합니다. | ||
| Eosin Y 솔루션 | Sigma | HT110-2-32 | |
| Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | 멸균 |
| 헤파린, PBS | 100mg 헤파린을 5ml 멸균 PBS에 용해하고, 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 사용합니다. | ||
| 히스토파크-1119 | Sigma | 11191 | 0.2mm 필터를 통한 제균 필터. |
| 히스토파크-1077 | Sigma | 10771 | 0.2mm 필터를 통한 멸균 필터. |
| Luciferase 세포 배양 용해 완충액 x5 | Promega | E153A | 사용 직전에 멸균수에 1:5로 희석합니다. |
| Luciferase 분석 솔루션 | Promega | E1501 | luciferase 분석 기질 분말(E151A)과 luciferase 분석 버퍼(E152A)를 포함합니다. |
| Sigma | MHS-32 | ||
| PBS + 0.5% BSA | 2.5g BSA를 500ml PBS에 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 사용합니다. | ||
| PBS + 1% BSA | 100ml PBS에 BSA 1g을 용해하고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 만듭니다. | ||
| 2.5% BSA | 250ml 멸균 HPLC 등급 물과 250ml PBSx10의 혼합물에 12.5g BSA를 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 멸균 필터를 통과합니다. | ||
| 0.5% BSA 및 2mM EDTA | 50ml 멸균 PBS에 250mg BSA를 용해시키고 0.2mm 필터를 통해 200mL의 0.5M EDTA pH 8.0 멸균 필터를 추가합니다. | ||
| FACS 완충액(0.5% BSA, 2mM EDTA 및 0.02% NaN3을 함유한 PBS) | 는 50ml 멸균 PBS에 250mg BSA를 용해하고 0.5M EDTA pH 8.0 200ml 및 2% NaN3 500ml, 멸균 필터를 0.2mm 필터를 통해 추가합니다. | ||
| 식염수 (0.9 % NaCl) | 9g NaCl을 1,000 ml ddw에 용해, 오토 클레이브 | ||
| 0.2 % NaCl 용액 | 2 g NaCl을 1,000 ml ddw에 용해, 오토 클레이브 | ||
| 1.6 % NaCl 용액 | 1,000 ml ddw에 16 g NaCl 용해, 오토 클레이브 | ||
| 2 % 아지드 | 50 ml 멸균 ddw에 1g 아 지드 화 나트륨을 용해하고 4o< / sup>C에 보관하십시오. 독성이 강합니다. | ||
| 3% 티오글리콜레이트 용액 | 티오글리콜레이트 분말 3g을 100ml ddw에 녹입니다. 용액이 노랗게 변할 때까지 끓이고 오토클레이브합니다. | ||
| 트리판 블루 용액(0.4%) | Sigma | T8154 | PBS에서 1:10으로 희석하여 0.04% 용액을 얻습니다. |
| 트립신 용액 B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | 멸균 |
| 1 mg/ml Zymosan A | Eppendorf 튜브의 1 ml 멸균 PBS에 1 mg Zymosan A를 재현탁합니다. Vortex를 격렬하게 배양하고 30분 동안 37 oC에서 튜브를 배양합니다. 오토클레이브하지 마십시오. 사용하기 전에 용액을 새로 준비하십시오. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE 선택 키트 | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE 선택 칵테일 | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| EasySep 자기 나노 입자 | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G 마우스 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep 마우스 호중구 강화 키트 | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep 인간 호중구 강화 키트 | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU 플로우 키트 | BD Pharmingen | ||
| MACS 호중구 분리 키트 | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| 식세포작용 분석 키트 | 케이맨 화학 회사 | 500290 | |
| 항체 FcR | |||
| 차단 항체 | Biolegend | 101302 | |
| 정제된 쥐 anti-Ly6G 항체 | BD 파밍겐 | 551459 | 클론 1A8 |
| PE 결합 쥐 ly6G 항체 | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | 클론 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 쥐 안티-마우스 Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | 클론 1A8 |
| violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | 클론 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | 클론 M1/70 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G 및 Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | 클론 RB6-8C5 |
| PE 결합 쥐 안티 마우스 CD45 | BD Pharmingen | 553081 | 클론 30-F11 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | 클론 BM8 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| 정제된 쥐 동형 제어 항체 (IgG2a, k) | BD 파밍겐 | 553927 | 클론 R35-95 |
| LEAF 정제 아르메니아 햄스터 안티 마우스 CD3e 항체 | BioLegend | 100314 | 클론 145-2C11 |
참고문헌
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immun....
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