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방법 논문

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

12.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52951

⸱

2016년 5월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

이 논문에서

요약

여기에서는 손상된 혈관 재건에 응용하기 위해 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)를 자성화하는 프로토콜을 제시합니다. BNC는 G. xylinus 균주에 의해 합성되었습니다. 한편, BNC의 자화는 BNC 메쉬 내부의 Fe2+ 및 Fe3+ 철 이온의 현장 침전을 통해 실현되었습니다.

초록

본 연구에서는, 박테리아의 Gluconacetobacter xylinus 의해 생산 세균 nanocellulose (BNC)의 합성 및 자성 박테리아 nanocellulose (MBNC)을 수득 산화철 나노 입자 (IONP) (4의 Fe 3 O)와 동일계 함침. MBNC의 합성은 정확하고 설계된 다단계 공정이다. 간단히, 박테리아 nanocellulose은 (BNC) 펠리클이 유지 G.에서 형성된다 크기와 형태의 우리의 실험 요구 사항에 따라 xylinus 변형. 철 (III) 클로라이드 헥사 하이드레이트 (의 FeCl3 · 6H 2 O)과이 철 (II) 클로라이드 수화물 (50ml을 2 · 4H 2 O) 용액 : 1의 몰비로 준비하여 탈산 소화 고순도 물로 희석한다. BNC 펠리클이어서 반응물 용기에 도입된다. 이 혼합물을 침전 적하하여 교반 한 후, 첨가되는 실리콘 오일 욕 암모늄 하이드 록 사이드 (14 %)에서 80 ° C로 가열철은 BNC 메쉬에 이온. 이 마지막 단계는 BNC 펠리클에 자기 특성을 부여하는 박테리아 nanocellulose 메쉬 내부 현장 마그네타이트 나노 입자 (O 4의 Fe 3)에 형성 허용한다. 독성 분석은 BNC-IONP 펠리클의 생체 적합성을 평가하기 위해 사용되었다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 생체 적합성을 향상시키기 위해 IONPs을 커버하는데 사용되었다. 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지는 IONP가 BNC 매트릭스의 공간을 인터레이스 피 브릴에 우선적으로 위치했지만, 그들 중 일부는 또한 BNC 리본을 따라 발견 된 것으로 나타났다. MBNC에서 수행 자기 현미경 측정은 MBNC의 박막의 자기 특성을 확인, 높은 약한 강도의 자기장이 존재 자구를 발견했습니다. 이 연구에서 얻어진 영률 값이 이전의 연구에서 여러 가지 혈관보고 그와 잘 일치도이다.

서론

bacterian nanocellulose (BNC)도 Gluconacetobacter의 xylinus라고도 아세토 xylinum 균주에 의해 합성하고, 정치 배양 동안 공기 - 액체 계면에서 필름 또는 펠리클의 형태로 증착된다. 이러한 BNC의 펠리클은 재배 용기의 형태를 채용하고, 그 두께는 배양의 일수에 의존한다. A.을 xylinus 중합 후속 결정화 과정 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 합성 배지 중의 글루코스를 사용한다. 글루코오스 잔기의 중합은 사슬 글루칸은 세포 외피 분산 단일 기공 압출 박테리아 세포 막에서 수행된다. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 결정화는 H-1 본딩 시트의 적층이어서 반 데르 발스 결합하여 글루칸 체인 시트의 형성, 세포 외 공간에서 일어난다.

자석BNC 매트릭스 집적 IC 나노은 동맥 벽의 손상된 부위에서 자성 나노 입자를 포함하는 지시 및 평활근 세포를 한정하는 데 필요한 힘 (SMCs)을 증가시키기 위하여 외부 자기장에 의해 쉽게 조작 될 수있다. 이 전략은 SMCs 떨어진 다른 조직에서 유지하고, 혈류에 의해 가해진 힘에 대항 장소에서 세포를 유지한다. SMCs 그들이 중막이 주로있는 풍부한 층을 형성하는 혈관의 vasoelasticity에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다.

MBNC의 합성에 사용 된 방법은 BNC 펠리클을 침지하고, 80 ℃에서 철 (III) 클로라이드 수화물 및 철 (II) 클로라이드 수화물의 용액에 교반 포함한다. 수산화 암모늄은 BN​​C 메쉬 내부에 산화철 나노 입자를 형성하기 위해 첨가된다. 수산화 암모늄의 첨가는 블랙 오렌지색의 용액의 색상을 변경한다. 함께 BNC 피 브릴을 따라 IONPs 컴팩트불균일 한 분포의.

이 프로토콜은 누락, 손상 또는 부상 작은 직경의 혈관을 대체 사용하기위한 것입니다 우리가 자기 박테리아 nanocellulose (MBNC)라는 이름의 한 세균 nanocellulose 자성 나노 입자 박막, 설계에 초점을 맞추고있다. HS Barud 동료 최근 PEG 및 초상 자성 산화철 나노 입자 (3)의 안정한 수성 분산액 BNC의 펠리클을 혼합하여 BNC 기반 플렉시블 자기 종이를 생산하는 유사한 연구를 발표했다. 여기, 우리는 박테리아 셀룰로오스의 생산 및 자성 나노 입자와 현장에서의 함침을 설명합니다. 하나의 DNA 가닥 나누기의 검출에 기초하여 세포 독성 분석은 BNC와 MBNC 펠리클의 생체 적합성을 테스트하기 위해 사용되었다.

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프로토콜

세균 Nanocellulose 1. 준비 (BNC)

주 : 달리 지시되지 않는 한 모든 단계는 무균 조건 하에서 수행된다.

  1. 문화 매체를 준비합니다.
    1. 효모 추출물 25 g, 펩톤 15 g, 만니톨 125.0 g 및 고순도 물 500㎖를 결합하여 액체 배지 500㎖의 준비. 4 ℃에서 20 분 및 저장을위한 120 ° C에서이 혼합물을 압력솥.
    2. 효모 추출물 5.0 g, 펩톤 3.0 g, 만니톨 25.0 g 및 고순도 물 100ml에 한천 15 g을 첨가하여 반고체 매체 100㎖를 준비. 20 분 동안 120 ℃에서 상기 혼합물을 오토 클레이브. 일단 90mm X 16mm 플라스틱 페트리 접시에 예금 혼합물을 5 ml를 멸균. 더 사용할 때까지이 온도에서 4 ° C에서 젤에 솔루션 및 저장을 할 수 있습니다.
  2. G.을 재수 xylinus 변형 액체 배지 1 ㎖를 첨가하고, 피펫 팅하여 최대 동결 건조 바이알에 보존아래로 제조업체의 지침에 의해 표시.
  3. 접종 루프를 사용하여 세균 현탁액의 작은 방울 반고체 미디어를 포함하는 배양 접시에 접종. 접종은 접시의 중앙에 가장자리에서 지그재그 방향으로 루프를 이동하여 전체 페트리 접시를 다루고 있는지 확인합니다.
  4. CO 2없이 배양기에서 72 시간 동안 26 ° C에서 배양 접시를 품어. 배양 기간이 완료되면, 작은 흰색 콜로니를 볼 수 있습니다. 식민지 즉시 사용하지 않을 경우, 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉하고 거꾸로 요리를 배치하여 4 ℃에서 페트리 접시를 저장합니다. 콜로니 최대 6 개월 동안 그 방법에 저장 될 수있다.
  5. 전송 24- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 상기 (1.1.1)에서 제조 된 배양액 2 ㎖. 단계에서 접종 배양 접시에서 접종 바늘 (1.3) 두 개의 식민지를 가지고 조직 배양 판의 첫 ​​우물에 배치합니다. 아르 자형나머지 23 웰에 대해 동일한 절차를 EPEAT.
  6. 7 일간 30 ℃에서 조직 배양 플레이트를 인큐베이션. 도 1에 도시 된 바와 같이이 16mm 직경 약 2-3mm의 직경, 두께 24 BNC 펠리클의 합계를 산출한다.
    주 : 판을 흔들어 예를 들어, 배양 기간 중 어느 시점에서 세균 배양을 방해하지 마십시오. 잠복기, G. 중 xylinus 정적 배양 조건 하에서 형상 플라스크의 크기를 채용 공기 - 액체 계면에서 중합체 성 망을 형성하는 글루 코피 라노스 당 분자를 압출한다. 세균 nanocellulose (BNC)로 알려진이 고분자 매트릭스는 잠복기의 끝에서 눈에 띄는입니다.
  7. 성장 배지에서 BNC의 펠리클 모아서 G. 모든 흔적을 제거하기 위해 50 ℃에서 1 시간 동안 1 % NaOH 용액 200㎖에 이들을 살균 xylinus. 선택적으로, 자기 막대를 사용하여 300 rpm에서이 솔루션을 저어및 교반 판. NaOH 용액을 버리고 새로 제조 1 % NaOH 용액 200 ㎖를 추가합니다. 번 같은 과정을 반복하거나 솔루션에서 BNC의 펠리클 때까지 반투명 모양을 취득한다.
  8. 물에 세 번 BNC의 펠리클을 씻어 RT에서 고순도의 물을 저장할 수 있습니다. 의 BNC 펠리클 완전히 물에 잠긴 것으로, 어떤 시간에 건조 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오.
  9. 20 분 동안 121 ° C에서 BNC의 펠리클을 압력솥.
    참고 : Märtson 및 동료에 의해 ​​수행 된 쥐의 생체 피하 연구 60 주 주입 후 BNC의 비 저하의 징후를 보였다. 사실, BNC는 포유 동물에서 결석 미생물 및 곰팡이 효소에 의해 자연 분해입니다. 한편, BNC의 생분해 기계, 화학 및 생체 내 (4)의 마이크로 피 브릴 네트워크 약화 생물학적 과정의 결과 일 수있다.

2. 합성 고분자 코팅철 산화물 나노 입자와 세균 Nanocellulose 막에있는 그것의 증착

  1. 버블 물에 용해 된 산소를 제거하고 질소로 대체​​하기 위하여 질소 가스를 고순도를 1,000 ml의 물.
  2. 2의 용액을 조제 3 구 둥근 바닥 플라스크를 사용하여 철 (III) 클로라이드 헥사 하이드레이트 (의 FeCl3 · 6H 2 O), 철 (II), 염화 테트라 한 몰비 (50ml을 2 · 4H 2 O)로 희석 탈산 소화 고순도 물. 예를 들어, 50ml을 5.4 g을 사용 · 6H 2 O 및 탈산 소화 된 고순도의 물 10ml에서 50ml을 2 · 4H 2 O 1.98 g. 이 준비 저어 너무 점성이 어려운 켜지면, 탈산 소화 된 고순도의 물 20ml에 50ml을 0.54 g · 50ml을 2 6H 2 O 및 0.198 g · 4H 2 O를 사용합니다.
    참고 :이 채널의 무게에 의해 2 O 공기에 50ml을 2 · 4H의 노출 시간을 감소가능한 한 빨리 emical 화합물. 이 질소 가스 공급 장치와 냉각 관에 접속 될 때까지 일단 3 구 둥근 바닥 플라스크에 도입 격벽 스토퍼와 3 구 둥근 바닥 플라스크를 닫는다.
  3. 용기의 목에 격벽 스토퍼 펀칭 고정 바늘에 질소 가스 공급원을 접속하여 일정한 입구와 질소 가스의 출력을 제공하는 용기의 두 목을 사용한다.
  4. 반응물과 용기에 이전 단계 1.5 (직경 15.6 mm, 두께 2-3 mm)를 제조 하였다 1 BNC 펠리클를 놓습니다. 시료가 완전히 액체에 잠긴되어 있는지 확인합니다.
  5. 응축기 튜브 용기의 나머지 목 연결한다. 또한, 냉각 관의 상단에 무수 황산 칼슘 가득 건조 튜브를 사용합니다. 응축기 튜브를 통해 물을 실행합니다.
  6. 진공 그리스와 유리 관절의 모든 인감.
  7. 교반기를 이용하여 80 ℃의 실리콘 오일 욕의 용액을 가열핫 플레이트 단계 2.10까지이 온도를 유지. 5 분 동안 350 rpm에서 반응물을 혼합 작은 자기 교반 막대를 사용합니다. 있는지 확인 BNC 적절 철 용액을 함침하고, 반응물을 완전히 용해시킨다. 실험이 종료 될 때까지 교반을 유지한다.
    주 : 실리콘 오일의 온도를 확인하는 온도계 활용. 그것은 80 ° C까지 안정해야한다.
  8. 해온 피펫 팅 니들을 이용하여 철 용액 10 ㎖에 5 분, 수산화 암모늄 5 ㎖의 시간 간격 (NH 4 OH 14 %)에서 700 rpm으로 교반 속도를 증가시키고 (적하) 추가 또한 격막 마개에 펀칭. 암모늄 하이드 록 사이드를 첨가 한 후, 용액의 색은 검은 색으로 황색 / 오렌지로 변경합니다.
  9. 또 다른 5 분 동안 80 ° C에서 상기 용액을 계속 교반 하였다. 샘플의 무결성을 유지하기 위하여 고속 되찾은 피한다. 높은 속도, 즉보다 높은 1,000 rpm으로, 파괴 할 수있다샘플.
  10. 교반 열판의 온도를 제어하여 바닥을 30 ℃까지 용액의 온도를 낮추고 또 다른 5 분 동안 교반하면서 유지한다. 그 후, 핫 플레이트를 끕니다. 이때, IONP는 BNC 메쉬로 통합되었다.
  11. RT까지 혼합물을 냉각시키고, 강한 영구 자석 (예를 들면, 1 테 슬러)를 이용하여 자성 나노 입자 (MNP) 및 BNC 분리. 이를 위해 선박 플라스크에 혼합물을 옮기고, 용기 부근에 자석을 유지하면서 상청액을 경사시키면서, 대신에 MNPS 및 BNC 개최.
    참고 : 잘못 사용했을 때 그들은 해가 될 수 있기 때문에 강력한 자석을 처리 할 때주의해야합니다. 단계 (2.12)의 경우 - (2.14)과 (2.16) 산화에서 입자를 방지하기 위해 (2.1) 이전에 제조 된 환원 된 고순도의 물을 사용합니다.
  12. 100 ml의 물에 MNPS와 BNC를 재현 탁. 부드럽게 강하게 BNC에 포함되지 않은 모든 MNPS을 제거 할 수있는 솔루션을 흔들. 의 S를 가만히 따르다자석을 사용하는 대신에 MNPS 및 BNC 채 다시 upernatant.
  13. 상등액 중성 pH (약 pH 7)에 도달 할 때까지 비색 스트립을 이용하여 측정 한 물을 MNPS 및 BNC 수회 세척 하였다.
  14. 핀셋을 사용하여 MNPS에서 BNC 작용 - 자기 또는 자기 박테리아 nanocellulose (MBNC)를 분리하고 물이 맑은 실행까지 물을 MBNC 여러 번 헹군다.
  15. UV (110-280 ㎚)로 MBNC O / N을 노출시킴으로써 MBNC 멸균.
  16. 20 분 동안 120 ℃에서 환원 된 고순도의 물 500 mL 및 압력솥이 물 20ml에 MBNC 저장한다.
  17. 무균는 PEG의 1 %에 샘플을 담그고 실온에서 2 시간 (37 ° C) 동안 교반한다. 이 절차는 BNC 증착 산화철 나노 입자 표면에 노출 5-7 특히 이들의 생체 적합성 및 안정성을 향상시킨다. 페그 코팅은 MBNC 차원 네트워크를 통해 배포된다.
    참고 : 벌거 벗은 IONP 쉽게 공기 중에 산화높은 화학적 활동 (8) 때문이다. PEG는 비 생분해 성 재료로 간주되는 경우에도 그것의 화학적 안정성은 수분량의 pH, 온도, 효소의 존재하에 활성 산소 반응성 질소 종 및 기타 9로인가 생물학적 조건에 의존한다.

의 BNC 및 MBNC 펠리클의 3 특성

  1. 기계적 성질
    1. 정상로드와 베르 코 비치 압자를 사용하여 하역 나노 압입 시험을 수행합니다. 바코 비치 압자 다이아몬드의 반경은 20 ㎚이다.
    2. RT에서 압입 깊이의 함수로서 접촉 면적을 조정하는 용융 실리카 및 텅스텐을 사용한다. 시험하는 동안, 접착제를 사용하여 들여 쓰기에 샘플을 탑재합니다. 압자는 두께 방향으로 시료 접근했다.
    3. 샘플 표면에 무작위로 선택 들여 쓰기 위치. 200-300mm 사이에 2 들여 쓰기 사이의 간격을 유지합니다.
    4. 받는 하중을 적용단계 샘플은 압자의 해당 변위를 기록한다. 영률을 찾기 위해 깊이 대 부하의 그래프를 분석한다.
    5. 0.01 Mn 및 0.60 MN 사이의 최대 부하로, 0.0001 MN / 초 0.005 MN / 초 사이의 하중 비율을 적용하여 탈 이온수 (DI 수), 테스트의 존재 하에서 시료의 나노 압입 테스트를 수행한다.
    6. 액체 셀을 사용하고 액체 환경에서 샘플을 유지합니다. 유체 환경에 몰입 나노 기계 특성에 대한이 독특한 설정을 효과적으로 BNC 및 MBNC 세포막의 손이 닿지 생체 역학적 기능을 시뮬레이션하는 데 이상적이다.
  2. SEM에 의해 구조 특성
    1. 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 nanocellulose 섬유 구조를 특성화.
    2. -80 ° C에서 24 시간 동안 샘플을 동결 건조. 그런 다음, SEM 스터드에 장착 10 초 동안 금 - 팔라듐 필름 스퍼터 및 SEM을 사용하여 분석 할 수 있습니다.
    3. 22,000X의 배율로 이미지를 이동합니다및 60,000X 5 kV의 가속 전압.
  3. 자기 도메인
    1. 실온에서 완전히 건조에 MBNC의 펠리클을 허용하고,이어서 영구 자석 (1 테슬라)에 5 분 동안 노출.
    2. 즉시, 제조자의 프로토콜에 따라 바이오 AFM을 이용한 자력 측정을 수행한다.
    3. 각각의 측정을 위해 제 지형 기능을 캡처하고 두 번째 패스 동안에 자구를 획득. 비접촉 모드에서 바이오 AFM으로 모두 측정을 얻습니다.
    4. 나노 입자의 자기 특성이 -10,000 10,000 오에 범위의 자기장, RT (300 K)에서의 물성 측정 시스템 양자 디자인 (PPMS)에 진동하는 샘플 자력계 (VSM)를 이용하여 수행된다.
  4. Cytocompatibility
    1. 1.0 ×의 밀도로 6 웰 조직 배양 접시에 종 인간 대동맥 평활근 세포 (HASMC) 3 세포 / cm 2 및 시험 시료의 존재하에 24 시간 동안 배양 : BNC와 MBNC 펠리클 (직경 15.6 mm 각).
    2. 각각 음성 및 양성 대조군으로 치료와 과산화수소 처리 된 세포의 인구를 사용합니다.
    3. 제조 업체의 프로토콜과 A. Azqueta 및 AR 콜린스 (10)에 의해 제안 된 지침에 따라 혜성 분석을 수행합니다.
    4. 층간 삽입이 분석에서 핵산 염료 SYBR 금을 사용하여 형광 제조사의 프로토콜에 따라 전기 영동 시료에 함유 된 DNA 라벨.
      참고 : BNC 및 MBNC 샘플의 존재에있는 DNA 손상을받지 않는 세포를 DNA 손상 세포가 긴 혜성해야합니다 반면, 형광 라운드 녹색 핵 양체를 표시합니다 - 긍정적 인 샘플 nucleoids (혜성의 머리)가됩니다 다음 (꼬리에서 DNA의 비율) 조각난 DNA 물질을 포함 꼬리.

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결과

G.의 잠복기 xylinus 9 일 총했지만, 펠리클 앞서 형성되기 시작하고 약 2 주 후에 분명했다. 의 BNC의 거시적 인 외관은 그림 1에 표시됩니다, 그 접시 성장 문화의 어떤 모방의 형태.이 그림뿐만 아니라 위의 프로토콜과 관련된 주요 단계를 요약하고있는 BNC-IONP의 펠리클의 제조 방법을 설명합니다 주요 구성 요소의 구성.

SEM 이미지는 미세 구조, 형태, 및 BNC (도 3)에 작용 BNC IONP 분포 섬유의 공간적 분포 (도 4)을 확인하는 데 사용 하였다. 의 BNC는 정의 된 패턴없이 전체 네트워크에 걸쳐 열린 기공을 형성 미세 리본 (직경 약 50 ㎚)...

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토론

의 BNC 펠리클의 두께 및 크기를 쉽게 배양 시간과 정적 배양 중에 성장시킨 플라스크의 크기를 변경함으로써 조작 될 수있다. 의 BNC의 microproperties, 예컨대 기공률 같이, 정적 배양에서의 산소 비율을 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 높은 산소 농도는 BNC 11 강하다 얻을. A. 보댕 및 동료 G. 발효 과정에서 100 %의 산소 분위기에서 산소의 산소 비율을 변화시킴으로써 880mm 수은 최대 파열 압력 BNC의 튜브를 제조 xylinus 12. 마찬가지로, BNC의 다공성은 또한 발효 공정에 파라핀 왁스 등의 미소 포로 겐을 포함하여 도입 될 수있다. 이 경우, 생성 된 다공성 및 기공 상호은 기공 크기 (13)에 의존 할 것이다.

의 BNC의 다공성 네트워크는 약물 전달을 위해 그들을 예를 들면 나노 입자로 작용 화 될 수 있도록자치령 대표. ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 계약 번호 W81XWH-11-2-0067에 따라 국방부에서 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Glucoacetobacter xylinusATCC700178
AgarSigma AldrichA1296-500G 
D-Mannitol BioxtraSigma AldrichM9546-250G 
효모 추출물BD Biosciences212750
세균학 펩톤시그마 알드리치P0556
수산화나트륨, 물 속 50% 용액시그마 알드리치158127-100G
철(III) 염화 헥사하이드레이트시그마 알드리치236489-100G 
수산화암모늄 마크롱 파인 케미컬6665-46
폴리(에틸렌 글리콜), 평균 Mn 400시그마 알드리치202398-250G 
철 (II) 염화물 테트라하이드레이트Sigma Aldrich44939-250G
일회용 페트리 디쉬Sigma AldrichBR452000
일회용 접종 루프Fisher Scientific22-363-604 
무수 황산칼슘W.A. Hammond Drierite 13001
고진공 그리스Sigma AldrichZ273554-1EA
실험실용 피펫팅 바늘 90도; 무딘 끝Sigma AldrichCAD7937-12EA
pH 테스트 스트립   Sigma AldrichP4786-100EA
둥근 바닥 세 목 각도 타입 증류 플라스크Sigma-AldrichCLS4965250
오일 목욕용 실리콘 오일Sigma-Aldrich85409-250ML 
건조 튜브ChemglassCG-1295-01
격막 마개, 슬리브 유형ChemglassCG-3022-98
자기 교반 막대ChemglassCG-2001-05
콘덴서ChemglassCG-1218-01
온도 조절기BriskHeatSDC120JC-A
교반 핫 플레이트피셔 사이언티픽11-100-49SH 
Comet Assay KitTrevigen4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainLife TechnologiesS-11494
bio-AFMJPK InstrumentsNanoWizard 4a BioScience AFM
NanoindenterMicro Materials Ltd다중 모듈 기계 테스터 
주사 전자 현미경 (SEM)Hitachi High Technologies AmericaHitachi S-4800

참고문헌

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