공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

요약

우리는 차등 디지토닌 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포에서 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium의 정량화를 설명합니다.

초록

세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.

서론

세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 ^하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 ^2,3로 탈출. 이는 액포 파열 ^2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 ^{5 시그널링} 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francis....

프로토콜

살모넬라 균을 mCherry가 발현 1. 디기 토닌 분석 (분석 FACS 기반)

1. 준비 박테리아
   주 : 플라스미드 (PFPV가 rpsM 프로모터하에 mCherry을 코딩)에서 mCherry 발현 살모넬라 야생형 SL1344은 (스트렙토 마이신 내성)이 분석에 사용된다. mCherry의 구성 적 발현에 의해 변경되지 세균 증식 식세포 ¹⁶ (데이터는 보이지 않음).
   1. 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (100 ㎍ / ml의 mCherry 발현 벡터)와 보충 LB 배지 3 ㎖에 감염되기 전에 변형 일일 접종.
2. 감염 세포를 도금.
   1. 1.25 × ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시드 야생형 BMDMs / 웰 주 식세포 배지 1 ㎖에가 (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 - 불 활성화 된 56 ° C, 30 분간으로 보충 ), 1 % HEPES, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L 글루타민, 10 % L929 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF로부터의 조정 배지) L929 세포를 제조). 표 1에 따른 ....

결과

도 1 및도 2는도 1 및 프로토콜이 프로토콜은 프로토콜의 중요한 단계 및 수득 한 결과를 나타내는 디기 토닌에 기재된 분석법의 회로도를 도시한다. 3 FACS 전형적인 결과를 나타낸다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 mCherry + / FITC- 박테리아 (액포 살모넬라) 및 mCherry + / FITC + 박테리아 (세포질 살모넬라 균)의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 이들 게이트에 근거 세포질과 액포 세균의 비율은 실험 샘플에서 결정될 수있다. 이 예에서 우리는 야생 형 및 ΔsifA 살모넬라 균을 비교했다. 그림 3은 mCherry ⁺ 살모넬라 티피 무리 움 야생형 및 골수 유래 쥐의 대 식세포에 ΔsifA 돌연변이로 얻은 대표적인 데이터를 보여줍니다. 그림 4는 일반적인 Calnexin (A)와

토론

차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida ^2,4와 시겔 flexneri ⁽¹²⁾ 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이다. 해야 할 수 있습니다 사용되는 병원체 또는 셀 라인에 측면에서 분석의 미세 조정. 분석은 단지 감염 생물에 한정되지 않고, 또한 세포 사멸이 ^{17,18 시그널링} 같은 다른 세포 생물학적 응용에 사용될 수있다.

이 분석의 핵심은 특정 세포 내 세포막 덜 CHO를 포함에서 세포막과 세포 막은, 다른 지질 조성물을 가지고있다lesterol. 디기 토닌 복잡한 콜레스테롤 따라서 리드 투과성으로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
디지토닌	시그마	D5628	50 μ g/ml
PFA	mpbio	219998380
Hepes	Life Technologies	15630
칼륨 아세테이트	시그마	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	시그마	A2153
안티 살모넬라 CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield 마운팅 매체	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit 항체-488	분자 프로브	A-11070	1/500
글리신	시그마	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100 μ g/ml 및 10 μ g/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 컨포칼 현미경	Zeiss		이미징 63X
FACS Fortessa	BD 기술		검출 mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD 기술		검출 FITC 530 nm