방법 논문

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측 전의 VIVO

DOI:

10.3791/52991

⸱

2015년 7월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Science and Medical Bioscience, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi

이 논문에서

요약

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본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

초록

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맥락막신경총은 뇌실벽에 위치하고 있으며, 뇌척수액의 생산이 주요 기능인 것으로 여겨집니다. 맥락막 신경총 조직의 표면을 덮고 있는 맥락막신경총 상피세포(CPEC)는 여러 개의 고유한 섬모를 가지고 있지만 이러한 섬모의 대부분의 기능은 아직 연구가 남아 있습니다. CPEC 섬모의 운동성과 관련된 기능을 밝히기 위해 배아, 주산기 및 출생 후 기간 동안 섬모 운동성을 모니터링하기 위해 생체 외 관찰 시스템이 개발되었습니다. 맥락막신경총을 뇌심실에서 절개하여 미분 간섭 대비 광학 장치가 장착된 비디오 강화 조영 현미경으로 관찰했습니다. 이러한 조건하에서, 생체 외 몇 시간 동안 CPEC 섬모의 운동성 프로파일을 분석하기 위한 간단하고 정량적인 방법이 개발되었습니다. 다음으로, 발달 중 섬모의 형태학적 변화를 주사 전자 현미경으로 관찰하여 섬모의 형태학적 성숙도와 운동성 사이의 관계를 규명했습니다. 흥미롭게도, 이 방법은 섬모의 수와 길이의 변화를 설명할 수 있었는데, 이는 산후 일(P) 2에서 최고조에 달한 반면, 박동 빈도는 P10에서 최대에 도달한 후 P14에서 갑작스럽게 멈췄습니다. 이러한 기술은 다양한 조직에서 섬모의 기능을 설명할 수 있습니다. 관련 기술은 이전 보고서1에서 발표되었지만, 현재 연구는 생체 외 CPEC 섬모의 운동성과 형태를 관찰하기 위한 세부 기술에 중점을 둡니다.

서론

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Cilia 는 대부분의 척추 동물 세포 표면에 있는 머리카락 모양의 돌기로, 섬모병증 2-4라고 불리는 질병 부류 때문에 의학 연구자들의 관심을 끌었습니다. 세포 소기관의 유비쿼터스 발현에도 불구하고, 운동성과 생체 감지를 포함한 다양한 섬모 기능이 보고되었습니다. 예를 들어, 점막상피 표면의 운동성 섬모는 점액5과 상피 파편을 관의 출구로 운반하여 상피 표면을 청소하여 질병을 예방합니다. 더욱이, 초기 발달 시기와 배아 단계에서 섬모는 줄기세포의 증식을 조절하고6 척추동물의 좌우 비대칭 결정에 관여한다7.

맥락막총상피세포(CPEC)는 뇌의 맥락막신경총 조직 표면을 덮고 있는 신경상피세포의 파생물로, 뇌척수액(CSF)을 생성하여 두개내 환경의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. CPEC는 섬모에 특이적으로 집중되어 있는 G-단백질 결합 수용체를 통해 CSF의 생산을 조절하는 여러 개의 비운동성 섬모를 가지고 있음이 이전에 입증되었습니다8. 이러한 섬모는 정지된 비운동성 섬모로 간주되었지만, 일부 CPEC 섬모는 신생아 기간 동안 일시적인 운동성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다1. 이 발견은 소위 비운동성 섬모(non-motile cilia)가 발달 초기부터 반드시 운동성이 있는 것은 아니며 특정 생리학적 요구와 기능에 대한 반응으로 특정 시간 동안 일시적인 운동성을 나타낼 수 있음을 밝혔기 때문에 매우 중요합니다9. CPEC 섬모의 운동성 특성을 정확하게 설명하기 위해서는 CPEC 섬모에 고유한 운동 프로파일 분석을 포함하는 체외 관찰 시스템을 개발해야 합니다.

운동성과 관련하여, 여러 기술 보고서에서 기관 상피5,10, 운동성 단세포 편모11, 소위 기존 운동성 섬모12 및 결절 섬모13의 운동성 섬모에 대한 관찰을 설명했지만, 맥락막신경총과 같은 상대적으로 물결 모양의 구조에 적용할 수 있는 상세한 분석 방법은 지금까지 잘 문서화되지 않았습니다. 또한 CPEC의 섬모 이동을 분석하기 위해서는 고가의 고속 카메라가 필수적입니다. 이러한 필요성을 회피하고 다양한 세포 유형의 섬모 운동성 모니터링을 단순화하기 위해 저비용의 고속 카메라가 도입되었으며, 특히 각 섬모의 운동 속도와 패턴을 설명하기 위해 운동성 섬모의 운동성을 기록하기 위해 쉽게 접근할 수 있고 편리한 방법이 개발되었습니다1. 또한 독창적인 이미지 분석 소프트웨어인 "TI Workbench"가 여기에 사용되어 운동성에 대한 자세한 분석을 용이하게 했습니다. 총체적으로, 이 방법은 광범위한 섬모 연구에 채택될 수 있는 상관 주사 전자 현미경(SEM)과 함께 섬모 운동을 분석하기 위한 새롭고 간결한 전략을 제공합니다.

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프로토콜

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프로토콜과 실험 동물의 사용은 야마나시와 와세다 대학의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다.

1. CPEC 준비

  1. 다음 장치 및 재료 준비 : 바닥에서 조명을 전송하는 것이 바람직 할 수있는 스테레오 현미경,; 시계 포셉 한 쌍의 (뒤몽 # 3, # 4), 화염 멸균, 직선 운영 가위, 화염 멸균; 20 ml의 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 두 멸균 10cm 플라스틱 접시; 2 ml의 RT Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 요리; 70 % 에탄올을 함유하는 100 ml의 비이커; 신생아 마우스 새끼.
  2. 간단히 70 % 에탄올에 신생아 마우스를 담그고 운영 가위를 사용하여 잘린 빠르게 안락사.
  3. 멸균 10cm 디에 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 배지에서 즉시 머리를 배치SH.
  4. 뇌를 노출하기 위해 두개골을 열 절단, 시계 포셉의 쌍을 사용하여 덮개 뼈의 피부를 제거하고 뇌 전체를 분리 두개골 신경을 잘라.
  5. 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 새 접시에 두뇌를 전송하고 뇌가 완전히 매체에 몰입되어 있는지 확인하고, 스테레오 현미경으로 관찰한다.
  6. 이 위를 향하도록 뇌의 등 부분을 설정하고 후각 전구 (오른 손잡이 인 경우) 세시 방향에 상주하도록 뇌의 방향. 왼쪽 손에 집게로 부드럽게 뇌를 잡습니다.
  7. 미세 해부 포셉 (뒤몽 # 3, # 4) 오른쪽 손을 사용하여, 대뇌의 종 방향 균열을 따라 대뇌 반구를 연결하는 뇌량과 실질 아래를 잘라.
  8. 부드럽게 멀리 측면에 대뇌 반구를 밀어 가로 대뇌 균열을 노출.
  9. 일을 곤란하게하여 반구를 분리반구과 시상 사이의 전자 실질.
  10. 조심스럽게 라미 affixa에 의해 해마의 측면에 부착 된 측면 심실 맥락총을 잡아 당깁니다.
  11. 신선한 Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 접시에 고립 된 맥락총 이동, 중량 (자료 목록) 조심스럽게 제자리에 조직을 유지하는 오버레이.

CPEC 섬모 2. 라이브 영상

  1. 400 nm 내지 이상 700 nm의, 그 감광 (ND) 필터 (25 %, 6 %)보다 짧은 광 광로에 삽입 차단하는 적절한 자외선 (UV) 및 추론 (IR) 차단 필터 (들)를 확인 거꾸로 현미경의.
  2. 거의 눈에 의해 대물 렌즈의 초점을 조절하고, 중심 및 포커스 쾰러 조명에 적합 할 수 있도록 한 다음 콘덴서를 조정한다. 적절한 미분 간섭 대비를 삽입 (DIC) 프리즘, 리튬의 DIC 요소뿐만 아니라, 분석 및 편광판 요소GHT 경로는 DIC 광학을 준수합니다.
  3. 조직 표면의 구조가 가장 인식되도록 DIC 프리즘 위치하여 뷰의 콘트라스트를 조정한다. 표적 세포의 운동성 모든 속눈썹이 경우, 운동성 섬모의 클리어 뷰 인해 안구 운동에 의해 얻을 수 없다.
  4. 비디오 카메라에 빛의 경로를 변경하고, 광 전력을 증가시키는 ND 필터를 제거한다.
  5. 보기와 초점 분야를 조정 초점 모드에서 카메라를 사용합니다. 하는 영상이 모니터에 실시간으로 표시됩니다, 집중하는 동안, 운동성 섬모의 밝은 전망을 사용할 수 없습니다.
  6. 원하는 기간 (분 초) 0.1 밀리의 노출 시간 200 Hz에서 카메라를 사용합니다. 이미지 스택의 취득 후, 하나의 프레임은 분명 섬모 구조를 표시합니다. 섬모 가장자리 흐리게 경우, 프레임 레이트를 증가 시키거나 더 짧은 노출 시간을 사용한다.
  7. Leibovitz의 안락사 후 25-60 분 이내에 CPEC의 섬모의 움직임을 기록L-15 매체.

섬모 운동 3. 분석

  1. 수동으로 컴퓨터 모니터에 각각의 섬모의 패턴을 치고 추적 할 수 있습니다. 각각의 섬모의 궤적 정보 조립 마우스 포인터, 각 프레임의 표시 모양체 선단 위치. 어느 쪽의 추가 분석을 위해 다른 일반적인 응용 프로그램에 동일한 소프트웨어 또는 내보내기를 사용하여 궤도 정보를 분석 할 수 있습니다. 이러한 분석 단계의 효율의 논의에서 설명된다.
  2. 눈으로 운동의 두 가지 모드, 앞뒤로 또는 회전으로 ​​궤도를 분류.
  3. 다음 식을 사용 모양체 비팅 주파수 (CBF)를 계산 : [CBF = (초당 프레임 수) / (하나의 비트에 대한 프레임의 평균 개수)] 모양체 팁 움직임도 얻을 수있다 (14) (도 3 ). 동일한 셀에 다른 섬모 각 ciliu의 움직임을 방해 할 수 있기 때문에, 다수의 섬모 박동주기위한이 계산을 반복M, 불규칙성의 결과.
  4. 단일 셀 내에서 축 치고 섬모의 각도 균일 성을 분석하기 위해, 각각의 궤도 (그림 4)의 박동 각도 θ를 정의합니다. 전후 궤적 들어 직선 섬모 팁의 위치 맞춤, 및 X 선을 이동시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 회전 궤도를 들어, 타원에 위치를 맞춘 타원의 장축이 X시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 피팅의 세부 사항은 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
  5. 각 궤도의 정량적 설명은 일반화 종횡비 AR을 계산한다. 간단히에 의해 궤도를 회전 - θ과 X를 따라 분포의 폭 사이의 비율로 AR을 정의 -와 y -axes (그림 4B). 세부 사항은 대표 결과 섹션에 표시하고, 해석된다유의성은, 상기 매개 변수의 제한은 논의에서 설명된다.

SEM 4. 샘플 준비

주 : SEM이 종합적으로 CPECs상의 섬모의 상태를 평가하는 중요한 방법이다. 현미경에 대한 표본을 준비하기 위해, 표준 절차는 이전에 (15)는 약간의 수정으로 사용된다보고했다.

  1. 뇌로부터 조직을 절개하기 전에, 폴리에틸렌 캡 5 mL 유리 바이알에 정착액을 준비한다. 정착은 2 % 파라 포름 알데히드, 0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4에서 2.5 % 글루 타르 알데히드 (반 Karnovsky의 솔루션 16)로 구성되어 있습니다.
  2. 단계 1에 기재된 바와 같이 뇌로부터 조직을 해부.
  3. 간단히 새로운 접시에 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 격리 된 조직을 린스 한 다음, 실온에서 1 시간 동안 유리 바이알에 정착액의 조직을 고정한다. 일회용 전송 피펫을 사용하여 표본 GE를 처리ntly. HBSS로 세척 후 조직 접착된다.
    1. 정착액 용액에 시편을 전송하기 위해 천천히 방울로 전달 피펫 조직을 함유하는 용액을 소량 배출 및 고정액에 추가.
  4. 정착 후, 고정액을 폐기하고 인산 완충액으로 세 번 조직을 헹군다.
  5. 나머지 알데히드를 씻어 10 % 자당 용액에 조직을 담근다. 알데히드를 완전히 제거되도록 10 분 동안 용액에 샘플이 담궈하고 신선한 10 % 수크로오스로 두 번 반복한다. 이 단계는 후속 단계에 적절한 포스트 고정을 달성하는 것이 중요하다.
  6. 30 분 동안 인산염 완충액 1 % 오스뮴 테트 록 사이드의 용액에 담가 조직하고 이후 정용 얼음 위에 놓는다. 샘플에 의한 색 osmification 정도 판사 : 알데히드가 완전히 제거 될 때, 샘플은 흑색이다.
  7. 더블 distille 광범위 후 고정 조직 샘플을 씻으십시오D 물을 여러 번.
  8. 에탄올의 농도 구배에 의해 샘플을 침지 탈수, 보통 65 %, 75 %, 85 %, 95 %, 99 %, 100 %, 10 분마다. 새로 구입 한 병에서 99.5 %의 에탄올로 분 자체를 배치하여 무수 에탄올을 얻습니다. 무수 에탄올로 3 회 탈수를 반복합니다.
  9. 10 분 동안, 이소 아밀 아세테이트, 임계점 건조를위한 대체 시약으로 탈수 샘플을 놓습니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 이 시약은 급속히 증발 샘플은 표면 장력에 의해 파괴의 결과로 건조 될 수있다. 따라서, 완전히 샘플을 건조하지 않습니다.
  10. 이소 아밀 아세테이트의 최종 교환 후, 바로, 용매의 대부분을 제거 알루미늄 호일로 열려있는 유리 병을 포장하고, 드라이 아이스에 병을 놓습니다. 액체 이산화탄소가 임계점 건조기에서 유리 병에 쉽게 흐르도록 바늘 또는 미세 집게를 사용하여, 유리 병의 입구를 덮고있는 호일에 여러 구멍을 확인합니다. 다음 단계로 진행가능한 한 빨리.
  11. 이 단계에서, 건조기의 챔버로 이소 아밀 아세테이트 이월을 최소화하지만, 시료가 완전히 임계점 건조 전에 건조시키지 않는다. 또한, 유리 병에 서리의 형성을 피하기 위해 불필요하게 오랜 시간 동안 드라이 아이스에 샘플을 두지 마십시오.
  12. 물 제거는 조직에 포함되는 동안 조직의 표면 구조는 그대로 남아 있도록 임계점 건조기로 조직 샘플을 함유하는 호일 - 래핑 유리 바이알을 전송. 임계점 건조기를 동작에 대한 자세한 정보는 제조업체의 지침에서 얻을 수있다.
  13. 신중하게 기계적 손상을 최소화하기 위해 이쑤시개를 사용하여 샘​​플을 처리합니다. 그 결과 건조 조직 샘플은 약합니다. 이온 스퍼터를 이용하여 금 - 팔라듐 금속 스텁과 코트에 샘플을 탑재합니다.

SEM 5. 관측

  1. SEM에 의해 관찰하고, 디지털 카메라로 화상을 기록주사 전자 현미경에 장착.
  2. 분석을 위해 PC에 디지털 화상 데이터를 전송.

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결과

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흐름의 개요는 이미지 장치를 포함하여,도 1에 도시된다.

CPECs의 라이브 모션 관측

영화 1 산기 마우스로부터 단리 CPECs의 동영상을 도시하고, 동영상이 동영상 1 이미지의 확대도를 도시한다. 그것은 개별 섬모 팁 영화와 비교 정지 화상 불명확하다는 것을 알아야한다.이 프로그램을도 동영상 1 및도 2에 도시 된 데이터로부터 움직임의 다른 모드, 전후 및 회전 운동 두 섬모 운동 추적.도 3은 섬모의 궤적의 간단한 분석을 보여주는 위상차 두 좌표 회전 운동에 명백하다.

CPEC 섬모 팁 궤적의 분석

드 정량적 각 궤도를 분석하...

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토론

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이 방법의 관점

여기에 설명 된 기술은 이전에 발행 된 방법보다 섬모의 더 상세한 분석을 제공하지 않지만,이 기술의 중요성은 쉽게 섬모 운동 생체의 종류를 선별에 적용 할 수있는 시스템 및 비용 효율성의 단순성에있다. 특히, TI 워크 벤치 관찰하고 더 쉽게 섬모의 운동성을 분석하는 연구를 할 수있는 간단하고 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 효과적인 자동화 된 추적 방법은 비디오 강화 된 반면-DIC의 흠없는 섬모의 낮은 대비 개체에 대한 개발되지 않았다. 섬모 운동을 추적하는 방법은, 수동이 기술되어 있지만, 섬모 운동 추적 분석 노력의 양은 최적 화상 분석을 위해 범용 소프트웨어 패키지를 사용하는 것과 비교하여 감소된다.

샘플 해부

전자를 준비하려면X 생체 CPEC 샘플, 신속하고 부드러운 조작은 섬모 생체의 운...

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 논문은 고립 된 맥락총 조직에서 섬모의 운동성을 관찰하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신는 이전의 연구 1,8에서보고되었다.

감사의 글

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이 작업은 사립대학을 위한 프로젝트(Project for Private Universities)의 지원을 받았습니다: 일본 문부과학성(MEXT)의 매칭 펀드 보조금(T.I.)과 문부과학성(Mext)의 과학 연구 보조금(C)

의 보조금(C)을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
필요한 시약
생세포 이미징
ethanolWako Chemicals057-00456
Leibovitz L-15 mediumLife Technologies11415-064
SEM 준비
ethanolWako Chemicals057-00456
행크의 균형 잡힌 소금 용액Life Technologies14170112
파라포름알데히드 머크1040051000
글루타르알데히드 Nacalai tesque17003-05
isoamyl acetateNacalai tesque02710-95
분자 체 4A 1/8 Wako Chemicals130-08655무수 에탄올
인산염 완충액 식염수 (PBS)Sigma-AldrichD1408
인산염 완충액, 0.1 M100 ml를 만들기 위해, 0.1  19.0 ml를 섞어; M NaH2PO4 및 0.1 의 81.0 ml; M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)Nacalai tesque31718-15
disodium phosphate (무수)Nacalai tesque31801-05
sucloseNacalai tesque30406-25
오스뮴 테트록사이드Nisshin EM300
드라이 아이스
[header]
해부용 도구 및 재료
라이브 이미징 및 SEM 준비용
stereo microscopeOlympusSZX7
플랫 페이퍼 타월
Φ 10cm 플라스틱 접시
100ml 비커
스트레이트 작동 가위SansyoS-2B
시계 제작자 겸자DumontNo.DU-3 또는 -4, INOX
라이브 셀 이미징
glass 바닥 접시Matsunami GlassD110300
SEM 준비용
alminum 호일
5ml 유리 바이알(폴리에틸렌 캡 포함니치덴 Rika-GlassPS-5A
전사 피펫Samco ScientificSM251-1S표본 전송
이쑤시개체 전사
이온 스퍼터용 금-팔라듐히타치E-1030
임계점 건조기HitachiHCP-2
[header]
현미경 장비 및 재료
라이브 셀 이미징용
inverted microscopeOlympusIX81
100W 수은 덩어리 하우징 및 전원 공급 장치OlympusU-ULH 및 BH2-RFL-T3
100W 수은 램프UshioUSH103D
DIC 집광기, n.a. 0.55OlympusIX-LWUCD
전동 셔터Vincent AssociatesVS35S22M1R3-24 및 VMM-D1수동 셔터를 사용할 수 있습니다.
대역 통과 필터(400-700  nm, &파이; 45  mm)Koshin KagakuC10-110621-1
ND 필터 (Φ 45 mm)올림푸스45ND6, 25%와 6% ND 여과기의
올림푸스UApo 40XW/340, n.a., 1.15와 IX-DPAO40가진 사용된 대물 렌즈 (물 침수)
; 200Hz 프레임 속도 및 1msec의 노출 시간
이미지 획득/분석 소프트웨어인하우스 소프트웨어TI Workbench는 높은 프레임 속도로 획득할 수 있습니다.
카메라 제어 / 분석을위한 PC애플맥 프로
진동 차단 테이블Meiritsu SeikiAD0806
티슈워너 인스트루먼트슬라이스 앵커 키트에대한 무게 그것은 U 자형 찌그러진 &Phi에 접착 된 나일론 메쉬로 만들 수 있습니다; 0.5  mm 백금 와이어.
커버 유리(티슈용 대체 중량)마츠나미주문 제작커버 글라스는 티슈 웨이트로 사용할 수 있습니다.
SEM
inverted microscopeOlympusIX81
주사 전자 현미경JEOLJSM-6510
) 용 검용 45ND25 조합은DIC 성분 고속 비데오 카메라 연합군 시각 기술 GE680≥를입니다

참고문헌

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