방법 논문

도구로 미주 신경 자극은 멸종 학습을위한 관련 진학 가소성을 유도

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⸱

DOI:

10.3791/53032

⸱

2015년 8월 21일

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

이 논문에서

요약

미주 신경 자극 (VNS)는 행동의 범위를 수정하는 전뇌에 타겟 시냅스 가소성을 유도하기위한 도구로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 공포 멸종 메모리의 통합을 용이하게하기 위해 VNS를 구현하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Extinction은 중립적 자극이 행동을 유지해 왔던 강화를 더 이상 제공하지 않을 때 중립적 자극에 대한 행동 반응을 약화시키는 과정을 설명합니다. 두려움과 인간의 불안 사이에는 밀접한 상관관계가 있으므로 소멸 학습에 대한 연구는 외상 후 스트레스 장애와 같은 불안 관련 장애의 생물학적 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 이를 치료하기 위한 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전임상 연구는 멸종 학습을 돕고 멸종 회로에서 표적 가소성을 유도하여 새로 형성된 기억을 통합하는 것을 목표로 합니다. 미주신경 자극(VNS)은 신경 전달 물질의 긴밀한 시간적 및 회로별 방출을 제공하여 진행 중인 작업에 관여하는 신경 네트워크의 조절을 초래하는 강력한 접근 방식입니다. VNS는 쥐와 인간 모두의 기억 통합을 향상시키며, VNS를 조건화된 신호에 대한 노출과 짝을 이루면 쥐의 멸종 학습의 통합이 향상됩니다. 여기에서는 쥐의 VNS에 필요한 맞춤형 부품 준비 및 수술 절차에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 VNS가 청각적 공포 조건화 작업에서 조건화된 공포 반응의 소멸을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 또한, VNS가 소멸 기억의 발현 및 조절에 관여하는 근전두엽(infralimbic, IL) 내측 전전두엽 피질(medial prefrontal cortex)과 편도체(amygdala)의 기저측 복합체(basolateral complex) 사이의 경로에서 시냅스 가소성을 조절한다는 증거를 제공합니다.

서론

고전 공포 조건화는 불안 장애의 생물학적 기초를 공부하는 널리 사용되는 동물 모델을 제공합니다. 공포 조건화 동안, 혐오 자극 (무조건 자극, 미국, 예를 들면, footshock)은 같은 톤 및 / 또는 컨텍스트 (; CS 조건 자극)와 같은 중립적 인 자극과 함께 제공됩니다. 공포 조건화 동안, CS 및 US 간의 연결이 형성된다. 결국 연사의 발표는 혼자 공포 응답 (; CR 조건 반응)을 이끌어 낸다. 공포 멸종, CS 서서히 1 감소시키는 CR 일으키는 US의 부재 하에서 반복되게된다. 따라서, 조절 된 공포의 멸종은 더 이상 혐오 결과를 예측할 수없는 경우 중립 자극에 무서운 행동 반응이 감쇠되는 활성 프로세스입니다. 조건 반응의 멸종 배운 협회와 경쟁 새로운 기억의 통합이 필요합니다. 불안 장애의 특징은 IMPA입니다IRED 멸종 2-4. 따라서, 동물 모델에서 컨디셔닝 두려움의 멸종은 억제 학습과 인간의 불안 장애 5,6에 대한 행동 치료의 모델로 모두 중요한 패러다임 역할을합니다.

두려움과 인간 불안 간의 긴밀한 대응이 있기 때문에, 이는 이러한 연구는 외상 후 스트레스 장애와 같은 불안 관련 장애의 생물학적 특성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있고 그것들을 치료하기위한 전략을 개발하는데 도움 것이라고 생각된다. 전임상 연구의 중요한 목표는 멸종 학습을 돕기 위해 멸종 학습을 통합 멸종 회로의 타겟 가소성을 유도하는 것입니다. 미주 신경 자극 (VNS)은 뇌 영역과 지속적인 업무에 종사하는 시냅스의 꽉 시간적, 회로 별 변조를 제공하는 데 사용할 수있는 최소 침습 neuroprosthetic 접근 방법이다. 이 달라스 텍사스 대학의 마이클 Kilgard 씨의 그룹에서 최근 일련의 연구이산 감각 모터 자극과 그 페어링 VNS을 표시 (예, 톤 또는 레버를 당겨) 이명 (7)을 치료하기 위해, 또는 뇌졸중 8-10 다음 모터 적자를 극복하기 위해 대뇌 피질 가소성을 증진에 매우 효과적이다. 또한, VNS 비 조건부 유사하게 대뇌 피질 가소성을 촉진하고 쥐에서 인간 11-13 메모리 통합을 향상 학습 후 짧은 시간 창 내에서 발생하는.

부교감 통로에서 미주 신경의 역할을 고려할 때, 그것이 메모리와 시냅스를 변조에 참여할 수있는 것은 당연하다. 매우 감정적 인 이벤트가 아닌 감정적 인 기억보다 더 강한 기억을 생산하는 경향이있다. 이는 메모리에 통합 스트레스 호르몬의 영향으로 보인다. 스트레스 호르몬 아드레날린의 Posttraining 관리는 인간과 인간이 아닌 동물에서 메모리 통합을 강화하지만, 아드레날린, 15 혈액 - 뇌 장벽 (14)을 통과하지 않습니다 . 따라서 스트레스에 의한 아드레날린의 방출은 메모리 통합을 강화하기 위해 간접적으로 뇌에 영향을해야합니다. 강력한 증거는 미주 신경은 아드레날린 순환과 뇌 사이의 연결 고리가 될 수 있음을 시사한다. 미야 시타와 윌리엄스 (16)는 아드레날린의 전신 투여가 미주 신경 발사를 증가하고, 편도 17 노르 에피네프린의 수준을 증가 것으로 나타났습니다. β - 아드레날린 수용체는 미주 신경이 장기 기억으로 감정적으로 불러 일으키는 경험을 전환 경로에서 역할을 제안 편도 18에서 차단 될 때 아드레날린의 전신 투여는 메모리 통합을 강화하지 않습니다.

따라서, 훈련 VNS 페어링 19,20 쥐에서 흡광 학습의 통합을 향상 보강 부재 에어컨 큐 메모리에 통합 및 노출을 지원 뇌 변화를 향상시킬 가능성이있다. 여기에 우리의 VNS의 사용을 설명SA 도구는 대뇌 피질 가소성을 촉진하고 컨디셔닝 공포 응답의 소멸을 촉진한다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행하고, 그들은 달라스에있는 텍사스 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

VNS 소맷 부리 1. 건설

  1. 22 ½ G 바늘의 날카로운 끝을 절단하여 드릴링 도구를 만듭니다.
  2. 금속 파일 위를 평평하게 여러 번 22 ½ G 바늘의 지금 뭉툭한 끝을 실행합니다. 파일에 45도 각도로 바늘을 잡고, 회전하면서 파일을 통해 그것을 여러 번 실행합니다. 이 금속은 안쪽으로 얇고 감다가 원인이됩니다. 주의 : 바늘의 절단 끝으로 메스의 끝을 삽입하고 금속을 펴다 일부 하향 힘으로 회전합니다.
  3. 섹션 1의 나머지 단계를 확대 쌍안경을 사용합니다.
  4. 메스를 사용하여 (10 또는 15 블레이드) 튜브 4mm 세그먼트를 잘라.
  5. 이상 하나 4mm 세그먼트를 배치작은 드릴 비트 또는 다른 유사하게 모양의 도구입니다. 이것은이 조작되고있는 동안 위치에 호스를 유지하는 것이다.
  6. 튜브 (그림 1A)에 4 구멍을 드릴. 구멍 2mm 제곱으로 2mm의 네 점을 확인해야없이 거친 가장자리 청소해야합니다.
    참고 : 드릴링 도구 (단계 1.2) 매 2 또는 3 홀 resharpened 될 필요가있다. 이 단계의 어려움으로 인해 충분히 선명하지 않은 드릴링 도구에 거의 확실하다.
  7. 두 개의 구멍이 컷 (그림 1B)의 양쪽에 끝낼 수 있도록 드릴 비트에 여전히 튜브로, 구멍 사이에 길이 튜브를 잘라 메스를 사용합니다.
  8. 재봉 바늘과 봉합 실을 이용하여, 미주 신경 주위 커프스의 궁극적 배치 담합 만들 관통 구멍을 통과 봉합사. 팔목 안쪽에 바늘로 시작하고 외부 (그림 1C)에서 인접한 구멍을 통해 다시 이동, 구멍 중 하나를 통해 전달합니다. threa 타이D 플라스틱에서 함께 ~ 2cm가되도록 튜브 및 스레드는 삼각형을 만든다. 매듭 후 스레드의 ~ 8cm 허용하고 트림. 절단 반대측 구멍 대한 프로세스를 반복한다. 튜브는 이제 배선 할 준비가되어 있습니다.
  9. 수갑을 위해 와이어를 준비합니다.
    1. 70mm 세그먼트로 백금 이리듐 와이어를 잘라.
    2. 보석 토치를위한 최고의 팁을 사용하여, 가능한 한 세련 블루 센터와 날카로운 불꽃을 만들고 ~ 와이어에서 플라스틱 코팅의 1cm를 제거하는 데 사용합니다. 작은 공을 만드는 와이어의 제거 끝으로 불꽃의 블루 센터를 적용합니다. 함께 일곱 가닥을 융합 제거 부분의 여러 지점에 화염의 블루 센터를 적용합니다. 이러한 점에서 와이어를 꼬 나타납니다.
    3. 와이어의 대향 단부에서, 작은 공을 만드는 단부에 화염 블루 센터를 적용. 이 말의 플라스틱을 제거 최소화합니다.
  10. 커프 (그림 1D)를 연결할.
    참고 : 인트섹션 1.10에서 PS는 확대 쌍안경에 따라 수행해야합니다.
    1. 이 컷은 수평으로 실행하는 방향이되도록 스레드를 사용하여 아래로 커프를 테이프입니다. 커프가 열려 뽑아 다음 스레드를 테이프되도록 꽉 스레드를 당깁니다.
    2. # 5 집게로 제조 된 와이어의 제거 측의 고사리 끝을 잡고 오른쪽 아래 구멍을 통해 밀어 넣습니다. 커프의 중앙에 와이어의 끝을두고 구멍의 집게를 당겨.
    3. (현재 커프의 중간에) 제거 와이어의 고사리 끝을 다시 잡고 오른쪽 상단 구멍에 밀어 넣습니다. 커프의 위쪽에 커프 느슨한을 통해 완전히 전달 된 와이어를 떠나, 구멍의 집게를 잡아 당깁니다.
    4. (현재 위쪽에 커프 외부) 제거 와이어의 고사리 끝을 다시 잡고 안쪽에서 오른쪽 상단 구멍에 다시 밀어 넣습니다. 와이어의 반대편에 잡아 당 겼에 의해 시험 : 와이어가 제 위치에 단단히 고정 될 때까지 그렇게 계속합니다.
      노트 :이 과정에서 그 와이어의 벗겨진 / 절연 부분을 구별하는 것이 중요하다. 궁극적으로 커프의 '통'에 위치 와이어는 제거되어야하지만, (하단에 커프 외부) 바닥 구멍 아래 모든 것이 절연해야합니다. 이는 미주 신경에 현재의 배달을 보장합니다.
    5. 절연 측의 고사리 끝을 잡고 주위를 한 번 반복, 커프의 내부에서 오른쪽 아래 구멍을 통해 밀어 넣습니다.
    6. 두 개의 와이어가 튜브, 우측에 하나, 왼쪽에 하나의 고정 결국되도록 커프의 좌측 1.10.5 - 반복 1.10.2 단계.
    7. 구멍이 위를 향하도록 도움의 손길의 팔에 금 핀을 놓습니다. 플럭스로 구멍을 채 웁니다.
    8. 핀으로 와이어 (지금 팔목에 부착)의 절연 끝을 납땜.
    9. 솔더가 냉각되도록 한 다음 다시 용융. 이는 와이어의 단부와 I 사이 양호한 연결을 보장핀의 nside. 필요한 경우 더 솔더를 적용합니다. 제 2 와이어에 대해 반복합니다.
    10. 리드가 오른쪽으로 실행으로, 영구 마커 커프의 상단을 표시합니다. 또한 상단 리드에 부착 된 금 핀을 표시합니다.

VNS 입력 사이트에 대한 Headcap 2. 건설

  1. 26 AWG 구리 와이어의 30mm 세그먼트를 잘라. 양쪽 끝의 작은 부분을 벗겨.
  2. 느슨한 골드 핀을 좁은 끝을 잘라 골드 핀의 절단 끝으로 전선의 피복을 벗긴 끝을 납땜. 각각의 원하는 입력 사이트에 대한 두 개의 와이어 / 핀 화합물을 생성합니다. 돕는 손에 커넥터를 배치하고 커넥터 (도 2G)의 두 흐를 치아의 각 전선 / 핀 화합물 와이어 단부를 납땜.
  3. 마크 샤피와 와이어가. 수술하는 동안, 표시되지 않은 와이어에 표시된 와이어 주동이와 임플란트를 놓습니다.

3. VNS 수술

  1. vagu의 처리에 대한 사용자 지정 유리 도구 만들기수술 중의 신경.
    1. 이 긴 테이퍼 팁을 가질 수 있도록 마이크로 피펫을 끌어 붕규산 유리를 사용합니다. 더 피펫 풀러가 없다면, 긴 에지를 만드는 유리 휴식.
    2. 테이퍼 끝으로 보석 토치에서 푸른 불꽃을 적용하는 동안 두꺼운 천으로 피펫의 비 테이퍼 끝을 잡고 (화상을 방지하기 위해)과 부드러운 화재 방지 표면에 테이퍼 / 깨진 끝을 누릅니다. 이 표면으로 누르고있는 유리 구부 것입니다. 후크 또는 J 모양이 형성 될 때까지 불꽃을 적용합니다.
  2. VNS 수술
    1. 수집 및 모든 도구를 소독. 위생, 난방 수술 영역을 준비합니다.
    2. 케타민 / 자일 라진 (85 ​​㎎ / ㎏, 5 ㎎ / kg, IP)으로 마취 동물. TOE 및 / 또는 테일 핀치에 응답하여 동물의 발성과 빠짐 반사를 모니터하여 마취면의 깊이를 평가한다.
    3. 동물의 목의 머리의 상단과 왼쪽을 면도. 광부와 동물의 눈을 보호알 오일 또는 안연고. 면도 부위에 거즈에 알코올 다음 요오드 클렌징 거즈와 솔루션을 적용합니다. 한 번 반복합니다.
    4. 마르케 피하 머리의 상단에 0.05 ml에 주입하고, 정위 계기로 동물을 배치하는 동안 러스는 분산 할 수 있습니다.
    5. 람다와 브레 그마 모두 노출 두개골에 피부에 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 목의 왼쪽 귀 앞의 왼쪽 아래로 절개 사이트에서 피하로 터널을 무딘 집게를 사용하여 커프스에 대한 경로를 준비한다.
    6. 지혈제 오픈 절개 사이트를 당깁니다. 면봉을 사용하여, 남아있는 조직을 제거하기 위해 노출 된 두개골에 과산화수소를 적용한다.
    7. 메스를 사용하여 고정 나사를 배치 두개골에 두 개의 얕은 선발 구멍을 드릴. 그들은 충분히 멀리 떨어져 임플란트를위한 공간을 허용으로 배치하지만, 주변 조직에 너무 가까이하지해야합니다. 중간 선에 직접 나사를 두지 마십시오.
      1. 힘으로PS와 스크루 드라이버, 두 구멍에 뼈 나사를 드라이브. 두개골의 표면 위의 3mm에서하고 나사 주위에 채우기 위해 아크릴을위한 공간을 허용하는 - 나사 (2) 캡, 구멍에 꽉해야한다.
    8. 주변 조직을 피하고, 주위 및 아크릴 소량와 나사 사이에, 아래의 공간을 채우기. 그런 다음 두 개의 나사 사이의 두개골의 중간에 아크릴의 더 큰 금액을 배치합니다.
    9. 표시된 선이 표시되지 않은 와이어 주동이를 지향하고 신속 골드 핀 버클 지역, 또는 상단에 입력 사이트에 아크릴 묻지 않도록주의하면서, 아크릴에 임플란트를 배치되도록 임플란트를 잡아. 일단 건조 될 때까지 ~ 5 분을 설정할 수 있습니다 위치. 이것은 또한 지원 정위의 아암을 사용하여 수행 될 수있다. 아크릴의 낮은 점도의 조화와 함께 임플란트와 두개골 사이의 균열이나 틈 입력합니다. 건조하도록 허용합니다.
    10. 3.2의 나머지 단계를 확대 쌍안경을 사용합니다.
    11. 일을 제거정위기구의 전자 동물. 그 오른쪽에있는 동물을 놓고 복부 위치로 약간 회전.
    12. 약 왼쪽 경정맥을 통해 작은 절개를합니다. 턱 뼈와 쇄골은 절개 사이트에 거의 같은 거리에 있어야한다. 근육 층에 도달 할 때까지 무딘 절개를 이용하여 절개를 넓혀. sternomastoid, sternohyoid 및 omohyoid 근육이 볼 수 있어야합니다. 열려있는 사이트를 유지하기 위해 근육 견인기를 사용합니다.
    13. 근육 사이의 자연 고랑을 따라 무딘 해부를 계속합니다. 경동맥의 펄스를 찾아보십시오. 펄스쪽으로 근육을 통해 제목은 경동맥을 공개합니다. 근육 트랙터와 근육을 다시 잡아 당깁니다. 경동맥을 포함하는 시스는 미주 신경이 포함되어 있습니다. 조심스럽게 가위로 칼집을 해부 무딘.
    14. 미주 신경을 식별합니다. 그것은 경동맥 시쓰에서 가장 신경하고 동맥의 동물의 왼쪽 통상그러나 어떤 측면에서 찾을 수 있습니다. 사용자 정의 유리 도구로 전환 경동맥에서 미주 신경을 분리합니다. 신경 적어도 5mm 위해 다른 조직이 없어야합니다.
    15. 리드 반대 커프의 측면에있는 나사를 사용하여 머리에 절개,에서, 집게 또는 작은 지혈제와 이전에 만든 피하 터널을 통해 커프를 당깁니다. 목에 절개 부위에 조직을 통해 밀어 넣습니다.
    16. 부드럽게 유리 툴을 사용하여 신경을 들어 올리고 신경 아래 리드 커프스의 대향 측면에 나사산을 누른다. 신경 마찰 않도록주의하면서, 모든 방법을 통해 스레드를 당깁니다. 커프는 신경에​​ 바로 인접해야한다.
    17. 커프가 우수한 표시 '최고'면의 방향이 있는지 확인합니다. 커프의 중앙으로 신경을 삭제합니다. 신경은 이제 커프 (그림 2B)의 골에 모두 와이어를 통해 거짓말을한다. 커프를 닫 함께 스레드를 묶어.
    18. headcap에서 자극 입력 사이트의 금색 핀으로 팔목에 부착 된 핀을 연결합니다. 시뮬레이션 입력 사이트의 가장 앞쪽에 치아에 부착 된 골드 핀으로 표시된 핀을 연결합니다.
    19. 커프가 제대로 미주 신경을 자극하는지 확인하려면, (10 초까지 0.2 mA, 60 Hz에서) 자극에 의​​해 테스트 호흡 headcap에 자극 입력 사이트에 자극을 연결하고 실행 중지를 수행합니다. 호흡이 잠시 중지해야하고 심장 박동이 커프 기능을 확인, 드롭한다.
    20. 아크릴로 자극 입력 사이트에 핀을 고정합니다. 전선을 덮고 노출 핀과 전선이 단락으로 이어질하지 않는 것이 확인합니다. 어떤 범프를 통해 부드럽게 아크릴 사용하거나 틈새를 입력 할 수 있습니다. 건조하도록 허용합니다.
    21. 봉합은 모두 절개 사이트를 마감했다. 목 절개 부위 근처에 마르케 피하 0.05 ml를 주입한다. 사이트를 절개하기 위해 항생제 연고를 적용합니다. 선택적으로 자극 입력 사이트에 장소에 남성 커넥터를 남겨치유 과정 동안의 손상 또는 폐색을 방지 할 수있다.
    22. 항생제 치료와 적절한 진통제를 포함하여 표준 수술 후주의 사항을 따르십시오. 그들은 이동성을 회복 한 후 동물 주거 시설에 동물을 돌려줍니다. 복구를위한 오일을 허용합니다. 단독으로 실험의 나머지 부분에 대한 최대 수명과 headcap의 기능, 집 동물을 보장합니다.
      주 : 가성 VNS 래트 동일한 수술을 그러나 회로 headcap의 레벨 (즉, headcap가 주입되고, 미주 신경은 경동맥으로부터 분리되지만 전극 커프스 주위에 배치되지 않을 때 짧은 설계 신경).

4. 청각 공포 컨디셔닝

참고 :이 실험의 목표는 멸종을 강화하기 때문에이 공포 조건화 프로토콜은 대부분보다 21 더 많이 사용합니다. 쉽게 소멸 가벼운 두려움 컨디셔닝, 바닥 효과는 이러한 개선을 모호하게 할 수 있습니다.

  1. 음식과 물에 대한 광고 무제한 액세스 할 수있는 12 시간의 빛 / 어둠주기에 집 동물. 수술에서 회복하는 동안 매일 동물을 처리합니다.
  2. 사운드 감쇠 챔버 (그림 2C)에 보관 조건화 상자로 구성, 조절 및 테스트 장치를 설정합니다. 조건화 상자는, 20 × 20 ​​× 20 ​​㎝의 투명한 플라스틱 벽을 갖고, 발 충격 발생기에 연결된 스테인레스 그리드 바닥을 갖는다. 비디오 녹화 실을 조명 백악관 빛을 사용합니다. 9 kHz에서, 조건 자극으로 85dB SPL 톤을 사용합니다.
  3. 조작 적 상자 위, 챔버 내부에있는 디지털 카메라를 사용하여 기록 동작. 보고 동작 공간 외부에있는 컴퓨터의 세션을 모니터링한다. 나중에 분석을위한 비디오를 저장합니다.
  4. 후각 신호를 제거하기 전에 각 세션 후 70 % 에탄올로 챔버를 닦아주십시오.
  5. 이일 (그림 3A)의 쥐를 두려움은 조건. 쥐에없는 것을 확인첫 날 5 톤 (9 kHz에서, 85dB, 30 초)을 제시하여 톤의하게도 두려워. 동결 수준은 무시할 수 있는지 확인합니다.
    1. 2 일 연속 각각 8 톤 footshock (1 초, 0.5 mA) 짝과 초기 톤 프리젠 테이션을 따르십시오. 두 번째 날에 다시 톤 footshock의 짝을 반복합니다. 모든 시험에 대한 3 분의 평균, 2, 4 분 사이의 상호 자극 간격 (ISI)를 다릅니다. 충격 톤 중 발생하는 지점을 무작위.
  6. 셋째 날, 톤 / 충격 협회의 강도를 테스트합니다. footshocks의 부재 (3)의 ISI, 4, 또는 5 분 (4 분 평균) 4 톤을 플레이 톤 프레젠테이션 동안 및 조건 공포 반응의 대책으로서 인터 - 자극 간격 동안 동물 동결 행동을 기록 (CFR).
  7. 하루에 4 일, VNS 또는 위장 VNS와 멸종 훈련을 시작한다.
    1. stimulato에서 남성 커넥터를 삽입하여 자극에 쥐를 연결자극 부위에 입력 r에. 챔버 (그림 2A, 2C)에 배치 할 동물. 30 Hz에서 0.4 mA, 500 μs의 펄스 폭에 자극을 설정합니다. 30.15 초 총 지속 기간으로 설정 자극은, 톤의 개시 전에 150 밀리 초를 시작. (단계 4.6에서와 같이) 동물 4 톤을 플레이 VNS 또는 위장 VNS 각 톤 프리젠 테이션을 쌍.
  8. 주기적 오실로스코프를 이용하여 커프 및 입력 위치의 전기적 무결성을 테스트.
    1. 정상에 동물을 연결하고 오실로스코프로 자극기의 출력을 분할합니다.
    2. 20 V -20 V와 오실로스코프의 범위를 설정하고 자극을 실행합니다. 30 Hz에서 자극의 파형은 오실로스코프에 볼 수 있어야합니다. 크기 10 V를 초과 자극은 높은 임피던스와 부적절하게 작동 커프 또는 자극 입력 사이트에서 연결을 나타냅니다.
  9. 흡광 훈련 VNS의 효과를 테스트하기 (단계 4.6에서와 같이) 제 CFR 테스트를 실행할하루 5. 기록에 시간이 톤 프리젠 테이션 동안 동결 및 제 CFR 시험 (단계 4.6) 동안 기록 기준 동결 비교 보냈다.
  10. 처리 조건에 눈이 독립적 인 관찰자를 사용하여 비디오를 분석합니다. 스톱워치를 사용하여 톤 프리젠 테이션 동안 동결 소요되는 시간을 측정한다. 냉동은 쥐가 빠른 호흡을 전시하는 동안 완전한 부동, 저하 머리로 정의하고, 발 (22) 전염됩니다. 동결 동작의 분석은 두 단계로 분할 될 수있다 : 톤 및 프레젠테이션 중에 자극 간 간격 동안.

이 필드를 유발 전위 생체 녹음 5.

참고 :이 단계는 선택 사항입니다. 필드 유발 전위 (EFPs)는 표준 절차 (23, 24) 다음 정위 장치에 장착 된 이소 플루 란-마취 쥐에 복직의 테스트 후 24 시간 (5 일)를 기록하고 있습니다.

  1. 수집 및 모든 도구를 소독.
  2. 투명한 플라스틱 용기 내의 이소 플루 란 (5 %에서 100 % 산소 유량 1리터 / 분)으로 마취를 유도한다. TOE 및 / 또는 테일 핀치에 응답하여 동물의 발성과 빠짐 반사를 모니터하여 마취면의 깊이를 평가한다. 눈을 보호하기 위해 미네랄 오일 또는 안연고를 사용한다.
  3. 마르케 피하 머리의 상단에 0.05 ml에 주입하고, 덩어리가 분산 할 수 있습니다. 두개골에서 headcap을 제거하는 메스와 지혈제를 사용합니다. 브레 그마을 모호하게하는 것을 피하기 위해 가능한 적은 힘을 사용한다.
  4. 정위 기기에서 동물을 놓습니다. 람다와 브레 그마 모두 노출 절개를 확대하기 위해 메스를 사용합니다. 노즈콘을 통해 이소 플루 란 (100 % 산소 3 %, 유량 1 L / 분)로 마취 평면을 유지한다.
  5. infralimbic 전두엽 피질 (IL) 및 기저 편도 (BLA) 위의 두개골에 구멍을 뚫습니다. 유리 미세 전극 (2M KCl을 1-2 옴 저항) 내려 BLA에 (D / V를 : 7.2, A / P : 2.7, M은 / L : 브레 그마 4.9)과 stimulat내측 전두엽 피질의 일리노이 지역에 이온 전극 (D / V : 4.6, A / P : 3.0, M / L : 브레 그마 0.7) (그림 4A).
  6. BLA에 EFPs을 불러 일으키는 IL을 자극한다. 도 4에 도시 된 데이터는 다음과 같은 설정으로 취득되었다 : 최대 필드 응답을 유발 최소 전류 강도의 40 %에 해당 자극 강도를 사용하여, 0.3 msec의 지속 기간의 자극 펄스 (이전에 결정된 입출력 곡선에 기초 기준 데이터의 수집), 매 15 초를 전달했다.
  7. 시냅스 가소성을 유도하기 전에 15 분 - 10의 최소 기준 데이터를 수집합니다.
    참고 : 실험의 요구 사항에 따라 달라질 수 시냅스 가소성을 연상 조심스럽게 각각의 실험에 의해 선택해야합니다 사용되는 프로토콜입니다. 그림 (c)의 데이터는 그대로 보여주고 최소 전류 세기에서 20 초 간 버스트 간격으로 50 Hz에서 (2 초)에 100 펄스의 3 버스트를 다음 EFP의 변화를 보여줍니다최대 필드 응답을 거라고.
  8. 필드 전위의 극성의 피크에 대응하는 25 밀리 초 자극 인공물 후 - 자극 인공물 전에 5 밀리 초 윈도우의 평균 사이의 차이와 약 20도 5 밀리 초 윈도우의 평균으로 EFP의 진폭을 측정한다. 기준에 데이터를 정규화 100 %로 10 분 기준의 평균을 설정합니다. EFP 진폭의 장기적인 변화를 평가하기 - (50 분 포스트 유도 예를 들어, 40) 소성 유도 한 후 다른 10 분 기간의 평균 EFP 진폭을 사용합니다.
  9. 녹화 종료 후 마취 된 동물의 목을 벨 뇌의 압축을 풉니 다. 전극 배치의 조직 학적 확인을 위해 조직을 준비합니다.

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결과

이 섹션은 래트에서 에어컨 공포 반응의 발현을 감소시키기 위해 흡광 학습과 VNS 조합을 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 도시한다. 일 1, 2 (청각 공포 컨디셔닝)의 경우, 쥐 footshocks를 톤와 결합 된에 청각 공포 조건화 작업에 대한 교육을했다. 3 일 (전처리 시험)에서 톤이 동결 수준을 측정하고 조절 공포 응답 수집을 유추 footshocks의 부재에 제시 하였다. 4 일에 (치료) 쥐 그룹 별 멸종 훈련과 치료를받은 4 톤 프리젠 테이션 VNS 또는 가짜 자극 또는 가짜 자극과 확장 멸종 그룹, 20 톤 프리젠 테이션 중 하나와 결합되었다. 냉동 수준은 혼자 CS (후 처리 시험) (그림 3a에 CF 타임 라인)의 4 프리젠 테이션에 대한 응답으로 5 일에 다시 시험 하였다. 공동 비 강화 노출 제한된 수의 (4)를받은 동물멸종 단계에서 nditioned 톤은 다음 회복의 날 (그림 3B) 조건으로 두려움에 단지 작은 감소를 보여...

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토론

우리는 여기 컨디셔닝 큐 (19)에 노출 단일 세션에서 컨디셔닝 두려움의 멸종을 촉진하고 infralimbic 피질과 소멸 (20) 학습 중재 할 수 있습니다 기저 편도체 사이의 경로에 가소성을 조절하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 성공을위한 중요한 단계는 멸종 트레이닝 동안 VNS의 적절한 전달합니다. 따라서, 특별한주의 커프 전극의 구성 및 미주 신경 주위 커프스의 배치에 주어져야한다. 커프 전극의 제작 과정에서 그것은 와이어의 노출 된 부분은 정확한 위치에있는 것을 보장하는 것이 중요하다. 마찬가지로, 수술 중, 특별한 노력이 적절한 위치에 커프를 배치하고, 커프와 자극 사이 회로는 실험 과정을 통해 그대로 유지되도록 장소에 충분히 앵커 이루어져야한다. 커프의 적절한 기능 ㄴ한다(단계 4.8에 설명 된대로) 행동 테스트 후 다시 (단계 3.2.20에 설명 된대로)와 E는 수술 후 확인.

VNS는 중추 신경계 활성...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 이해관계나 갈등이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알코올
아트로핀피셔A0132-5G
베타딘헨리 샤인69066950
과산화수소 CVS209478
케타민Henry Schein 1129300
마르케인Henry Schein6312615
미네랄 오일CVS152355
NeosporinCVS629451
산소홈 디포304179
페니실린피셔PENNA-10MU
프로판홈 디포304182
자일라진Henry Schein4019308
Tools
보석 토치스미스 장비23-1001D
재봉 바늘Walgreens441831
#5 펜치 (2)Fine Science Tools11254-20
납땜 철홈 디포;
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X 회로 보드 붐 스테레오 현미경 + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
도움의 손길A-M 시스템 726200
메스 블레이드 홀더파인 사이언스 도구10003-12
메탈 파일홈 디포6601
룰홈 디옵
곡선형 헤모스탯 Fine Science Tools130009-12
Fine ScissorsFine Science Tools14058-09
주걱Fine Science Tools
소형 스크루 드라이버홈 디포646507
Magnetic Fixator Retraction SystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
히팅 패드Walgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring JunpsFine Science Tools11103-09
맞춤형 마이크로피펫 유리 도구 (J 모양 및 직선) - 붕규산 유리셔터 기기B150-110-10
Adson 펜치파인 사이언스 도구11006-12
커프스
튜빙Braintree Scientific IncMRE-065
플래티넘 이리듐 와이어Medwire10IR9/49T
골드 핀Mill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
봉합사Henry Schein100-5797
22 G 바늘Fisher 14-815-525
종이 테이프피셔 03-411-602
솔더홈 디포327793
플럭스 Home Depot300142
메스 블레이드, 10 또는 15스톨팅52173-10
실라스틱 실험실 튜빙 .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
헤드캡
커넥터 피스(남성)Omnetics Connector CorporationA25001-004
헤드캡 피스(여성)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets 치과 아크릴, 액체 및 분말A-M 시스템525000, 526000
26 게이지 솔리드 구리 와이어스테이플1016882  
수술
뼈 나사스틸팅+CB33:C6151457
메스 블레이드, 10 또는 15스틸52173-10
1 ml 주사기Fisher14-826-261
22 G 바늘Fisher 14-815-525
27 G 바늘Fisher14-826-48
2" x 2" 거즈Fisher22-362-178
SwabsFisher19-120-472
강아지 패드PetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
챔버 및 행동 환경 
Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Quiet Barrier­ HD 방음 재료(시트)(PSA)soundproofcow.com10203041
Convoluted Acoustic Foam Panelsoundproofcow.com 10432400
Isolated Pulse Stimulator Model 2100A-M Systems720000
Digital Camera - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometer 10MHz 단일 채널 오실로스코프SinometerCQ5010C
OxyLED T-01 DIY 스티커 온 어디서나 4-LED 터치 탭 라이트OXYLEDB00GD8OKY0
5k 옴 전위차Alpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-130 데시벨 디지털 사운드 레벨 미터Extech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C 이중 출력, 스크램블 쇼커킨더 사이언티픽 컴퍼니
203525863러 트 202035324 용

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