분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

요약

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

초록

필드와 실험실 연구에서 미생물 개체군은 형태 학적 및 생리 학적 파라미터에 높은 이질성을 표시하는 것으로 나타났다. 미생물 세포 분열 및 대사 활동이 감소함으로써 휴면 상태로 존재할 수있는 균체의 실시간 상태를 결정하면, 라이브 또는 죽은 카테고리로 넘어 간다. 전체 인구의 생존을 결정하는 데 도움이 할 수있는 신속하고 정확한 방법은 분자 프로브 감지 및 미생물의 정량화에 대한 필요성, 세포 계측법 (FCM)을 흐름을 제공 감안할. 막 완전성을 검출하도록 모델에 남조류 Microcystis 녹농균을 SYTOX 그린 SYTOX 오렌지를 사용함으로써, 우리는 단일 세포 사망의 신속한 표시에 대한 방법을 개발 양도. actio의 필적 모드가 유사 여기 및 발광 파장이 다른 제품이 있지만,이 저널에서 사용 분자 프로브 (각각으로 녹색 또는 오렌지색 핵산 프로브 부른다앞이 프로브를 언급에 N, 우리는 구체적으로)를 참조하십시오. 분자 프로브를 사용하여 프로토콜 농도와 배양 시간에 주로 서로 다른 종 사이에 다릅니다. M.aeruginosa에 출발이 프로토콜에 따라 녹색 핵산 프로브는 30 배양 분, 10 분 후 1 μM에서 오렌지 핵산 프로브 후 0.5 μM의 농도에서 최적화되었습니다. 막 손상 세포의보고에서 주도 언급 최적의보다 적은 양의 프로브 농도. 반대로, 두 프로브 5 μM 농도 이상은 '생방송'세포 '는 비 생존 "세포 수의 위에 표현 선도, 대상 형광을 생성함으로써 비특이적 염색의 유형을 나타낸다. 제어 세대의 적합성이 논의 될 수 남아 있지만, 양성 대조군 (열 사망)는, 검증 가능한 죽은 바이오 매스를 제​​공했다. 녹색과 주황색 핵산 프로브 우리 드를 최적화하기위한 단계의 논리적 순서를 보여줌으로써시아 노 박테리아 효과적으로 생리 상태를 분석하는데 사용될 수있다 프로토콜을 만드는 방법 monstrate.

서론

세포는 지속적으로 생체 변수를 수정하고 그 기능을 변화시켜 환경에 반응 복잡한 시스템이다. ^{3 -} 동종 미생물 인구 자연과 실험실 모두의 인구 역학은 비교적 일정한 환경 조건 ^(1)에서 발생, 개체군의 발전에 의해 영향을받습니다. 자연 미생물 군집의 변화로 인해 환경 조건의 매우 가변적 특성으로 발생한다. 이 때로는 확률 과정​​ 이후 인구 평균에 매우 다른 소집단을 생산하고 있습니다. 최근의 증거는 이러한 생리적 개체군은 환경 조건에 다르게 반응과 크게 영향을 전체 인구의 ^{3,4에 영향을} 미치는 신호 화합물 또는 억제제를 생성 할 수 있음을 밝혔다.

집단 내 이질성을 정의하는 방법을 설정하면 해제의 열쇠입니다다양한 환경에서 미생물의 생태를 derstanding 및 heterocysts 같은 전문화 된 세포를 개발하고, 이러한 환경 변동에 대한 응답으로 형태 학적 이질성을 표시 크게 영향 인간의 물 보안에. 종 등 Anabaena와 같은 독성 Microcystis으로, 귀찮은 시아 노 박테리아의 지식을 구축 할 때 필수적이다 및 akinetes ^2. 대조적으로, Microcystis 세포....

프로토콜

분자 프로브 및 흐름 사이토 1. 준비

1. 초순수 여과하고 H ₂ O에 필요한 농도의 분취 액에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 5 mM의 용액으로 공급 된 핵산 프로브의 원액을 희석
2. 25 ^O C까지 사용 - -5 ^O C와 사이의 어두운 조건에서 핵산 프로브를 저장합니다.
3. 사이토 흐름과 부하 소프트웨어 패키지를 켭니다 (FCM 사양 재료 / 장비의 표 참조).
4. 시료 주입 프로브 (SIP)에 빈 용혈 관 (12 X 75mm)를 놓고, FCM 청소 프로세스를 시작 다시 세척 한 후 방해를 없애기 클릭합니다.
   참고 : SIP에 대한 몇 가지 샘플 단계는 마이크로 원심 튜브를 포함하는 튜브의 여러 종류를 수용 할 수 있습니다. FCM 장치에 사용되는 프로브 분자 희석제 및 시스 유체 분석 등급 "타입 1"을 0.22 ㎛의 막 여과 소스이다.
5. 장소15 분 금식하는 유체 속도 (또는> 66 μL / 분의 유속으로) - SIP에 초순수 여과 H ₂ O 2 ㎖와 신선한 용혈 튜브, 10 시간 제한을 설정한다.
6. 배경 잡음을 줄이고 '실행'을 클릭 형광 빛 산란 채널 ....

결과

지수 상에 M.aeruginosa 배치 문화에서 앞으로 빛 산란 (FSC)와 측면 빛 산란 (SSC) 출력은 각각 셀 크기 (직경) 및 내부 단위에 대한 정보 (그림 1A)를 제공합니다. FSC는 M.aeruginosa하기에는 너무 큰 및 / 또는 작은 세포를 구별 할 수있다. 이 차별 또는 게이팅은 FSC 출력 (도 1C)의 소정 포인트 사이의 데이터에 의해 정제 할 수있다. 빨간색 광원에 의해 심문을 할 때 피코시 아닌은, M.aeruginosa 광합성 장치의 주요 구성은 강한 신호를 생성 (예 : 640, EM : 675 ± 12.5 ㎚) FSC에서 수행 된 것과 유사한 더 게이트 인구에 사용할 수 있습니다, 게이팅하지만 형광과 (그림 1D). FSC 형광 신호에서, 데이터는 F에 대한 M.aeruginosa에.......

토론

^{15,19,22,23 -} 분자 프로브를 사용하여 출판물의 증가 숫자는 믿을 수 있고 정보 데이터는 ^5,6,8를 얻을 수 있음을 나타냅니다. 아직 같은 농도 및 배양 시간 ^6,10 모든 종에 걸쳐 효과적 일 수있다 세포 생존에 대한 완벽한 얼룩은 없습니다. 변경된 형광 방출과 프로브의 같은 종류가 정확한 농도와 항온 처리 시간 (표 1 및 3)을 확립 할 필요를 나타낸다. 이 프로토콜을 사용하는 경우 알 수있는 바와 같이, 오렌지 핵산 프로브에 대한 최적 농도와 항온 처리 시간은 녹색 핵산 프로브가 절반 만 집중해야하는 반면 1 μM에서 10 분이며, 그러나 세 배만큼 (도 5 및 6)에 걸린다. 1.0 μM 이상의 농도 이러한 세포 impermeant 시아닌 단량체 모두 비 막 부상 세포 스펙트럼 방출의 중첩을 생산하기 시작했다. 시의이 중복gnals은 비특이적 염색 어디에 '라이브.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시아노박테리아 미디어	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 담수 집중 용액 (x50 희석)
오염 제거 유체	BD Biosciences	653155	출력이 빠른 상태에서 초당 12개 이상의 이벤트일 때 또는 66 µ의 유속일 때 2분 동안 실행합니다. l/분  그 후 칼집 H2O를 2분 동안 사용합니다.
유세포 분석기	BD Biosciences	요청에 따라	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	핵산 염색 – DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	핵산 염색 – DMSO에서 5 mM 용액