방법 논문

공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

DOI:

10.3791/53049

⸱

2016년 4월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 발현을 제어하는 것은 살아있는 모든 유기체에 필수적일 뿐만 아니라 세포 모델에서 단백질 기능을 조사하는 중요한 전략이기도 합니다. 제시된 프로토콜은 1차 해마 뉴런을 포함한 포유류 세포에 대한 항체 간섭의 적용을 보여주고 단백질 기능 연구에서 3차원 재구성의 사용을 보여줍니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 발현의 엄격한 관리가 살아있는 유기체의 모든 필수적인 아니라 세포 모델에서 단백질의 기능을 조사하는 중요한 전략뿐만 아니라. 따라서, 최근의 연구는 RNA 및 항체 간섭을 포함하여 포유 동물 세포주 또는 동물 모델에서의 단백질 발현을 대상으로 다른 도구를 발명했다. 첫 번째 전략은 지난 20 년 동안 많은 관심을 수집하고 있지만, 세포막에서 세포에 항체화물의 전위를 매개 펩타이드는, 훨씬 적은 관심을 얻을. 이 공보에서는 항체 간섭 실험을 수행하기 위해, 인간 배아 신장 세포에서뿐만 아니라 차 해마 뉴런 전차라는 펩티드 담체를 이용하고 상기 단백질의 기능을 분석하는 삼차원 재구성의 적용을 설명하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리의 연구 결과는 전차는 아마도 핵 지역화 신​​호, particula에 있음을 시사RLY 소마와 핵에 존재하는 단백질을 대상으로 매우 적합합니다. 차 해마 문화에 전차를 적용 할 때 놀랍게도, 시약은 놀라 울 정도로 잘 해리 신경 세포에 의해 허용 될 밝혀졌다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 살아있는 유기체 자체 개발 명령뿐만 아니라 환경 신호에 반응하는 단백질 발현의 엄격한 제어가 필요하다. 따라서, 메커니즘은 다수 정확하게 앱 부호화 각 단백질의 발현을 조절하는 진화 중에 고안되었다. 그 삶의 주어진 시간에 모든 진핵 세포에 존재하는 20,000 유전자. 단백질 생산의 다른 단계에서 발생하는 규제 메커니즘은 번역 후 단백질 수정, 전송 및 분해의 방향으로 처리 크로 마틴 구조, 전사 및 RNA의 관리에 이르기까지 다양합니다.

분자 기계 및 변형 단백질 발현 수준을 기본에 고장이 암 또는 지적 장애 등 다양한 질병과 연관되어 있는지, 따라서 놀라운 일이 아니다. 사실, 신경 세포의 개발 및 포유 동물의 뇌 기능의 뛰어난 복잡성에서 찾고 SENSI단백질 발현의 변화에​​ 이러한 정교한 시스템의 tivity는 알츠하이머와 허약 한 X 증후군 (FXS) 같은 파킨슨 병 (AD 및 PD)뿐만 아니라 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) 등 여러 가지 잘 알려진 지적 적자에서 드러난다. 후자 질병은 하나의 번역 조절 단백질 FMRP (유약 X 정신 지체 단백질) 1-4의 손실로 인한 ​​단백질의 다양한 광범위한 misexpression 특징으로한다. 점 돌연변이는인지 장애 환자에서 식별되지 않은 상태에서 5 캐핑 mRNA의 수정에 의해 mRNA의 안정성과 변환을 관리 또한, 가변 전하에 영향을 미치는 염색체 재구성 연결된 x를 단백질 A (VCXA) 단백질은 최근 지적 결핍과 연관되고 지금과 같은 6, 7, 관찰 된 정신 장애는 변경된 VCXA 발현과 그 대상 보호 자전거의 조절 이상 발현에서 발생한 것을 건의인. 이러한 연구 결과, 드 노보 ASD와 관련된 유전자의 복제 수 변화에 따라서 상승 또는 감소 단백질 발현 수준이 발생할 수 있음을 아이디어를 지원하는 새로운 유전자 중복 및 삭제 ASD (8)의 중요한 위험 인자임을 설립 여부를 조사 연구와 일치 지적 적자.

놀랍게도, 최근의 연구는 또한 특정 단백질의 발현 량을 정확하게 거의 안전 여유도 9 높은 단백질 량의 결과로서 그 응집을 방지하도록 조절되어 있다는 증거를 제공 하였다. 따라서, 심지어 작은 단위는 AD 및 PD (9)과 같은 질병을 유발하기에 충분하다는 것을 제안되었다. 단백질 발현 조절에 기여하는 분자 기계의 다양한 이러한 결과에 비추어 복잡한 조절 방식을 제안했지만, 5000 포유류 유전자 (10)의 발현 량을 조사하는 연구는 것을 증명자연은 더 인색 방식을 선호 : 단백질의 세포 풍요 로움을 주로하여 RNA 가용성 관리는 주로 미세 조정하는 단백질 발현을 제공한다는 설명, 번역 (10)의 수준에서 조절되는 것으로 나타났다.

관심 단백질의 용량을 연구 장소 (POI)를 따라서 만 내인성 단백질의 기능을 이해하는 것이 중요하지만, 또한 많은 질병의 연구 및 치료의 개발이 아니다. 따라서, 지난 수십 년은 POI의 복용량을 조작하는 RNA 간섭을 사용하여 몇 가지 전략의 발전을 보았다. RNA 간섭 널리 단백질의 기능을 연구하기 위해 사용되며, 심지어 암, 안과 질환의 치료뿐만 아니라 환자의 11-13 항 바이러스 요법을 추구하는 임상 시험에 적용되고 있지만, 약간의 어려움이 전략 불가능 렌더링 할 수있는 발생할 수있다. 예를 들어, 상 동성으로 최저 구동 시드 시퀀스는 compara은상상력 짧은, 따라서 홍보 오프 대상 효과. 고효율 서열이 드문 및 시간과 비용이 많이들 수있는 권리 순서를 식별 (14 리뷰) 옵션의 수천 사이에서 발견해야하지만 이후 결과는 여전히 실망 할 수있다.

또 다른 전략은 직접 항체에 의해 POI를 대상으로하는 것입니다. 여기서, 우리는 세포 단백질의 가용성을 감소 (활성 모티프 제조) 단백질 담체 전차의 사용을 설명하고, 삼차원 재구성의 고용 녹다운 따라 단백질의 기능을 연구.

전차, 자체 2.8 kDa의 펩타이드의 활성 모티브, 포유 동물 세포 (15)의 세포막을 가로 질러 셔틀 펩티드, 단백질 및 항체로 사용된다. 전차-POI 단지 가는데, 소수성 상호 작용을 이용하여 비공유 결합 된 거대 분자 복합체를 형성함으로써 관심 장소와 펩타이드 관계자는 엔도 좀-IND 세포에 내장되어 있습니다ependent 방법. 중요한 것은, 전차가 왕복 단백질의 세포 내 위치 파악에 영향을 미치지 않으며, 세포 독성 효과를 발휘하는 또는화물 (15)의 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로도 나타내었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 재고 솔루션

  1. 2 μg의 / μL의 최종 농도 멸균 H의 동결 건조 활성 모티브 분말 2 O를 재현 탁. 혼합주의 깊게 누릅니다.
  2. (예를 들어, 12 ㎕를 각각 2 μL가 반응에 따라 필요) 작은 분취 량을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다.

세포의 2. 준비

  1. 항생제를 포함하여 24 웰 플레이트에 500 μL의 성장 매체에 HEK293 세포 또는 차 신경 세포로 씨 포유 동물 세포.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 낮은 밀도의 세포를 시드 및 24 웰 플레이트의 두 개의 중간 열을 사용한다. 각각의 잘 따라서 배양 (단계 4.2) 동안 매체를 항구 빈 대응을해야합니다. 신경 세포를 취급 할 때는 항상 세포가 몇 분 이상 인큐베이터 밖에 유지되지되어 있는지 확인하십시오.
  2. 세포 앱까지 적절한 배양 조건의 세포 (가습 된 5 % CO 2, 37 ℃). 50 %지류.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 문화 원하는 발달 단계까지 세포에 도달하고 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다. 두 매질의 25~50% 주. 매체 (1X B27, 5 mM의 L- 글루타민 및 1X 페니실린 및 스트렙토 마이신을 함유하는 (REF) (16)과 비교)로 Neurobasal 배지.

3. 전차 단지 형성

  1. 반응 당 PBS 50 μL에 각각 POI 또는 해당 항체뿐만 아니라 제어 단백질, 또는 대조군 항체의 0.1 μg의 희석.
    참고 :이 기술은 또한 거대 분자 복합체 사전 구속 일차 및 이차 항체 (. CP '대표 결과'그림 1)으로 구성된 작동합니다. 믹스와 스핀.
  2. 각 샘플에 대해, 전차의 자동 연관을 방지하기 위해 별도의 튜브를 사용하여 PBS 50 μL 2 μL 전차 원액을 희석. 믹스와 스핀.
  3. 피펫에 의해 전차의 희석에 희석 POI 또는 항체 (3.1 단계)를 전송팅. 믹스와 스핀.
  4. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 혼합물 (POI 전차 - 복합체 형성 할 것이다).

셀의 4. 형질

  1. 전차 단지 사전 예열 성장 매체 100 μL (37 ° C, 무첨가)에서 (단계 3.4) 희석. 매체를 제거하고 한 번에 미리 예열 1X PBS를 사용하여 세포를 씻는다.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 배지를 폐기하지 않는 것이 재사용 될 것이다. 37 ℃에서 보관하십시오. 세척, PBS가 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 염화칼슘 (2)를 포함하는 사용합니다.
    제안 : 접시 (4.5 단계)을 배양하는 동안 빈 우물에 매체를 보관합니다.
  2. 세포에 전차 착체 용액 (단계 4.1)를 적용하고, 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 조심스럽게 흔들어 세포. 1 시간 동안 표준 조건 (단계 2.2)에서 세포를 성장. 10 %의 최종 농도로 혈청을 추가한다. 신경 세포를 사용하는 경우, 단계 4.1에서 매체를 추가 할 수 있습니다. 1 ~ 2 시간 이상 세포 성장.
    참고 :최적의 배양 시간은 규모와화물의 특성에 따라 실험적으로 조정할 필요가있다. 다음의 제안은 가이드 라인으로 역할을 할 수있다 : 펩타이드를 들어, 1 시간 ~ 2 시간이 항체, 2 시간을 권장하고, 항체와 신경 세포의 형질 4 시간 동안하는 단백질, 일반적으로 충분합니다.
  3. 평소와 같이 분석을위한 프로세스 세포. 참고 : 기술은 고정 프로토콜뿐만 아니라 라이브 영상을 사용하여 실험과 호환됩니다.

5. 이미지

  1. 레이저 주사 현미경을 사용하여, 약 0.25-0.5 μm의 거리를 사용하여 세포 및 / 또는 관심의 세포 구획 Z-스택을. 정확한 층 거리 재구성 될 구조물의 크기에 따라 개별적으로 결정되어야한다.

6. 재건

  1. 다음 단계에서 O를 클릭하여 여러 개체를 선택하려면 선택과 이동, Cntr을 사이를 전환 할 Esc를 바닥을 사용n은 그들과 Shift 키 객체 (CP를. 6.10 단계) 잘라.
  2. Imaris에서 LSM-파일을 엽니 다.
  3. 밝은 구조가 포화에 도달 할 때까지 각 채널의 표시를 조정하여, 화상을 대조. 표면 구조에 영향을주지 않습니다이 조정은, 그것은 단지 이미지를 임계 화에 실험을 지원하는 역할을 양해 바랍니다.
  4. 새로운 표면 추가 아이콘을 클릭합니다. 마법사가 열립니다.
  5. 선택 : 관심의 세그먼트 만 지역. 다음 단계로 진행합니다.
  6. 관심의 목적에 맞게 선택 상자의 여백을 조정합니다. 이미지는 3 차원이 숙지하고 선택뿐만 아니라 Z 평면에서 조절해야한다는 부담주십시오. 선택 박스의 직사각형이 제대로 관심의 대상이 일치하지 않아야하는 경우, 객체를 회전 및 / 또는 모든 필요한 구조를 포함 할 때까지 선택을 확대. 원치 않는 개체가 나중에 제거 할 수있다 (CP. 6.10 단계). 발하다.
  7. 해당 채널을 선택합니다annel. 표면적의 상세 수준 또는 구 직경은 구조가 재구성되고 일치하도록 설정해야합니다. 상기 신호 특성에 따라 절대 강도 또는 로컬 콘트라스트 중 하나가 사용될 수있다. 일반적으로, 지역 대비 확산 신호에 대한 더 나은 작동합니다. 어떠한 경우에도, 설정이 각각 관심있는 각각의 신호 또는 구조에 대해 개별적으로 조절 될 필요가있다.
  8. 임계 화 도구를 사용하여 관심의 구조를 재구성.
  9. 녹색 화살표 아래를 클릭하여 복원을 완료합니다.
  10. 절단 및 필요에 따라 표면을 제거하기 위해 연필 도구를 사용하여 추가 개체를 조정합니다. 원하는 개체를 절단하기 위해 이미지를 따라서 남북 방향으로 절단 기울에만 가능합니다.
  11. 선택 통계, 자세한 통계 및 평균 값에 의해 각 표면 볼륨 영역의 측정과 강도를 얻습니다.
  12. 색상 코드 통계를 관찰하려면 (선택 단계) (CP. 그림 2E 및 F)는, 해당 표면의 색상 탭을 선택하고 대신 '자료'의 '통계 코딩'을 표시합니다. 몇 가지 옵션이 표시됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 단락에서, POI의 기능 최저 설명 예시 결과 전차 시약 및 항체의 간섭이되게됩니다 사용 (Simiate는, 자세한 내용은 16, 17 참조). 연구 결과는 Simiate의 감소 발현이 전사 활성을 저해하고, 투여 량 의존적으로 높은 항체 양 (> 1 μg의 항체)을 적용 할 경우 99 %의 사망률에서 남중, 세포 사멸을 유도 입증 (이 발견은 이전에 발표되었다 (16)). 여기서는 상세하게 사용되는 기술과 프로토콜을 제공하고 또한 주 문화 해리 해마 신경 세포를 형질 감염 할 수있는 방법을 보여 전차 시약.

이들 항체는 절차 동안 계속 작동하는 경우 전차 펩티드, 특히 항체를 효율적으로 좌우 이동 가능 여부를 조사하기 위해, 우리는 FLAG를 표명이어서 HEK293 세포에서 24 시간 동안 -Simiate하고는 전차를 이용하는 세포 rbαSimiate-gtαrbAlexa568 거대 분자...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 도즈 구동 방식으로 세포 기능을 조절 단백질 발현 수준의 중요성을 연구 프로토콜을 제시한다. 기술 된 프로토콜은 그러므로 세포 수준에서 단백질 기능의 상세한 연구를 촉진 해마 신경 세포 등 다양한 종류의 포유류 세포에서 단백질 발현의 미세 조정 조작을 허용한다.

RNA 간섭의 POI를 하향 조절하는 공지의 방법을 나타낸다 있지만 단점 (CP있다. 14)를 가진다. 뿐만 아니라 매우 특이적이고 효율적인 시퀀스의 식별은 비용과 시간을 소모 할뿐만 아니라 셀 내부 사체 생합성 독성 RNA 구조의 축적 핵 수출 기계 과부하뿐만 아니라 포화 때문에 예측 결과의 원인이 될 수있다 내생의 RNAi의 처리 시스템은 오프 대상 효과 나 비 효율성이 발생할 수 있습니다. 또한 외래의 RNAi 벡터의 높은 양 UNS을 유도 할 수있다pecific 효과뿐만 아니라, 세포의 항상성을 교란.

항체는 반면에, 즉각적인 세포...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 부분에서 지원 / RD 캐나다 파트너십 프로그램의 허약 한 X 연구 재단, RD, 대학 에를 랑겐 - 뉘른베르크의 Interdisziplinäres 젠트 룸에 대 한 klinische Forschung에 제롬 레조 이네 재단은 Rd 및합니다 독일 연구 협회에서 RD와 RE합니다. 저자는 pCMV5-FLAG 벡터 사용할 수 있도록 기술 세포 배양 유지 보수에 대한 지원뿐만 아니라 교수 M. 웨 그너에 대한 잉그리드 Zenger을 감사드립니다. 저자는 또한 특히 비디오 촬영에 도움이되는 지원을 위해 나디아 슈뢰더을 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ChariotActive Motif30025-20 ° C
Neurobasal 매체생명 기술21103-049워밍업 37 °
C 1x B27Life technologies를-20 °에서 저장17504044; C
L-글루타민Life technologies25030-149-20 ° C
페니실린과 스트렙토마이신생명 기술15140-122-20 °에 저장한다; C
Imaris 소프트웨어Bitplanen.a.비싸지 만 타의 추종을 불허하는
레이저 스캐닝 현미경Zeissn.a.
사용하기 전에 는

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007(2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Chariot3HEK293Imaris

관련 논문