방법 논문

공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

DOI:

10.3791/53049

⸱

2016년 4월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg

이 논문에서

요약

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단백질 발현을 제어하는 것은 살아있는 모든 유기체에 필수적일 뿐만 아니라 세포 모델에서 단백질 기능을 조사하는 중요한 전략이기도 합니다. 제시된 프로토콜은 1차 해마 뉴런을 포함한 포유류 세포에 대한 항체 간섭의 적용을 보여주고 단백질 기능 연구에서 3차원 재구성의 사용을 보여줍니다.

초록

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단백질 발현의 엄격한 관리가 살아있는 유기체의 모든 필수적인 아니라 세포 모델에서 단백질의 기능을 조사하는 중요한 전략뿐만 아니라. 따라서, 최근의 연구는 RNA 및 항체 간섭을 포함하여 포유 동물 세포주 또는 동물 모델에서의 단백질 발현을 대상으로 다른 도구를 발명했다. 첫 번째 전략은 지난 20 년 동안 많은 관심을 수집하고 있지만, 세포막에서 세포에 항체화물의 전위를 매개 펩타이드는, 훨씬 적은 관심을 얻을. 이 공보에서는 항체 간섭 실험을 수행하기 위해, 인간 배아 신장 세포에서뿐만 아니라 차 해마 뉴런 전차라는 펩티드 담체를 이용하고 상기 단백질의 기능을 분석하는 삼차원 재구성의 적용을 설명하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리의 연구 결과는 전차는 아마도 핵 지역화 신​​호, particula에 있음을 시사RLY 소마와 핵에 존재하는 단백질을 대상으로 매우 적합합니다. 차 해마 문화에 전차를 적용 할 때 놀랍게도, 시약은 놀라 울 정도로 잘 해리 신경 세포에 의해 허용 될 밝혀졌다.

서론

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모든 살아있는 유기체 자체 개발 명령뿐만 아니라 환경 신호에 반응하는 단백질 발현의 엄격한 제어가 필요하다. 따라서, 메커니즘은 다수 정확하게 앱 부호화 각 단백질의 발현을 조절하는 진화 중에 고안되었다. 그 삶의 주어진 시간에 모든 진핵 세포에 존재하는 20,000 유전자. 단백질 생산의 다른 단계에서 발생하는 규제 메커니즘은 번역 후 단백질 수정, 전송 및 분해의 방향으로 처리 크로 마틴 구조, 전사 및 RNA의 관리에 이르기까지 다양합니다.

분자 기계 및 변형 단백질 발현 수준을 기본에 고장이 암 또는 지적 장애 등 다양한 질병과 연관되어 있는지, 따라서 놀라운 일이 아니다. 사실, 신경 세포의 개발 및 포유 동물의 뇌 기능의 뛰어난 복잡성에서 찾고 SENSI단백질 발현의 변화에​​ 이러한 정교한 시스템의 tivity는 알츠하이머와 허약 한 X 증후군 (FXS) 같은 파킨슨 병 (AD 및 PD)뿐만 아니라 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) 등 여러 가지 잘 알려진 지적 적자에서 드러난다. 후자 질병은 하나의 번역 조절 단백질 FMRP (유약 X 정신 지체 단백질) 1-4의 손실로 인한 ​​단백질의 다양한 광범위한 misexpression 특징으로한다. 점 돌연변이는인지 장애 환자에서 식별되지 않은 상태에서 ....

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프로토콜

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1. 재고 솔루션

  1. 2 μg의 / μL의 최종 농도 멸균 H의 동결 건조 활성 모티브 분말 2 O를 재현 탁. 혼합주의 깊게 누릅니다.
  2. (예를 들어, 12 ㎕를 각각 2 μL가 반응에 따라 필요) 작은 분취 량을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다.

세포의 2. 준비

  1. 항생제를 포함하여 24 웰 플레이트에 500 μL의 성장 매체에 HEK293 세포 또는 차 신경 세포로 씨 포유 동물 세포.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 낮은 밀도의 세포를 시드 및 24 웰 플레이트의 두 개의 중간 열을 사용한다. 각각의 잘 따라서 배양 (단계 4.2) 동안 매체를 항구 빈 대응을해야합니다. 신경 세포를 취급 할 때는 항상 세포가 몇 분 이상 인큐베이터 밖에 유지되지되어 있는지 확인하십시오.
  2. 세포 앱까지 적절한 배양 조건의 세포 (가습 된 5 % CO 2, 37 ℃). 50 %지류.
    주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 문화 원하는 발달 단계까지 세포에 도달하고 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다. 두 매질의 25~50% 주. 매체 (1X B27, 5 mM의 L- 글루타민....

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결과

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다음 단락에서, POI의 기능 최저 설명 예시 결과 전차 시약 및 항체의 간섭이되게됩니다 사용 (Simiate는, 자세한 내용은 16, 17 참조). 연구 결과는 Simiate의 감소 발현이 전사 활성을 저해하고, 투여 량 의존적으로 높은 항체 양 (> 1 μg의 항체)을 적용 할 경우 99 %의 사망률에서 남중, 세포 사멸을 유도 입증 (이 발견은 이전에 발표되었다 (16)). 여기서는 상세하게 사용되는 기술과 프로토콜을 제공하고 또한 주 문화 해리 해마 신경 세포를 형질 감염 할 수있는 방법을 보여 전차 시약.

이들 항체는 절차 동안 계속 작동하는 경우 전차 펩티드, 특히 항체를 효율적으로 좌우 이동 가능 여부를 조사하기 위해, 우리는 FLAG를 표명이어서 HEK293 세포에서 24 시간 동안 -Simiate하고는 전차를 이용하는 세포 rbαSimiate-gtαrbAlexa568 거대 분자.......

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토론

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여기서는 도즈 구동 방식으로 세포 기능을 조절 단백질 발현 수준의 중요성을 연구 프로토콜을 제시한다. 기술 된 프로토콜은 그러므로 세포 수준에서 단백질 기능의 상세한 연구를 촉진 해마 신경 세포 등 다양한 종류의 포유류 세포에서 단백질 발현의 미세 조정 조작을 허용한다.

RNA 간섭의 POI를 하향 조절하는 공지의 방법을 나타낸다 있지만 단점 (CP있다. 14)를 가진다. 뿐만 아니라 매우 특이적이고 효율적인 시퀀스의 식별은 비용과 시간을 소모 할뿐만 아니라 셀 내부 사체 생합성 독성 RNA 구조의 축적 핵 수출 기계 과부하뿐만 아니라 포화 때문에 예측 결과의 원인이 될 수있다 내생의 RNAi의 처리 시스템은 오프 대상 효과 나 비 효율성이 발생할 수 있습니다. 또한 외래의 RNAi 벡터의 높은 양 UNS을 유도 할 수있다pecific 효과뿐만 아니라, 세포의 항상성을 교란.

항체는 반면에, 즉각적인 세포.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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제시된 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 부분에서 지원 / RD 캐나다 파트너십 프로그램의 허약 한 X 연구 재단, RD, 대학 에를 랑겐 - 뉘른베르크의 Interdisziplinäres 젠트 룸에 대 한 klinische Forschung에 제롬 레조 이네 재단은 Rd 및합니다 독일 연구 협회에서 RD와 RE합니다. 저자는 pCMV5-FLAG 벡터 사용할 수 있도록 기술 세포 배양 유지 보수에 대한 지원뿐만 아니라 교수 M. 웨 그너에 대한 잉그리드 Zenger을 감사드립니다. 저자는 또한 특히 비디오 촬영에 도움이되는 지원을 위해 나디아 슈뢰더을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ChariotActive Motif30025-20 ° C
Neurobasal 매체생명 기술21103-049워밍업 37 °
C 1x B27Life technologies를-20 °에서 저장17504044; C
L-글루타민Life technologies25030-149-20 ° C
페니실린과 스트렙토마이신생명 기술15140-122-20 °에 저장한다; C
Imaris 소프트웨어Bitplanen.a.비싸지 만 타의 추종을 불허하는
레이저 스캐닝 현미경Zeissn.a.
사용하기 전에 는

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of ....

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재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

3HEK293Imaris

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