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방법 논문

신생아 설치류에서 분리 뇌간 - 척수 준비에 전기 생리학은 신경 호흡 네트워크 출력 녹화를 할 수 있습니다

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53071

⸱

2015년 11월 19일

 , 
1Department of Pediatrics, Laval University

이 논문에서

요약

중추 호흡 드라이브는 뇌간에 있습니다. 고립된 뇌간-척수에서 출력되는 자발적인 호흡 운동은 네 번째 배뿌리에 전극을 배치하여 기록됩니다. 이 실험적 접근 방식은 약리학적 조사 또는 리듬 운동 행동에 대한 호흡 문제 및 유전자 조작 평가에 유용합니다.

초록

중추 호흡 욕구가 뇌간에 있다는 것은 잘 알려져 있지만, 중추 호흡 욕구의 기본 기능, 발달 및 자극에 대한 반응의 여러 측면은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 전체 동물에서 뇌간에 접근하는 어려움을 극복하기 위해 뇌간과 척수의 일부를 분리하는 작업이 수행됩니다. 이 제제는 인공 뇌척수액에서 유지되며 가스, 농도 및 온도가 제어되고 모니터링됩니다. 호흡기망의 출력 신호는 네 번째 복부근에 배치된 흡입 전극에 의해 기록됩니다. 이러한 방식으로 자극을 뇌간에 직접 적용할 수 있으며 그 효과를 직접 기록할 수 있습니다. 기록된 신호는 횡격막을 통해 횡격막으로 전달되는 흡기 신호와 연결되어 있으며, 파열(분당 약 8회 파열)로 설명할 수 있습니다. 이러한 파열(주파수, 진폭, 길이 및 곡선 아래 면적)을 분석하면 호흡기에 대한 자극 효과를 정확하게 특성화할 수 있습니다. 이 방법의 주요 한계는 초기 산후 단계를 넘어서는 준비의 실행 가능성입니다. 따라서 이 방법은 갓 태어난 쥐의 주변 입력 없이 전체 네트워크를 연구하는 데 크게 중점을 둡니다.

서론

호흡 옥시젠 (O 2) 흡수 및 이산화탄소 (CO 2)를 제거 가능하게 뇌에 의해 제어 복잡하고 생명 활동이다. 중앙 호흡기 드라이브는 모두 포유류 1 뇌간에있는 복잡한 네트워크, 양서류 2, 파충류 3, 조류 4 물고기 (5)에 의해 생성된다. 호흡의 연구는 생체 내에서 처리 할 수없는 경우에도, 정확한 역학적 조사 호흡 제어 네트워크에 직접 액세스를 필요로한다. 이를 위해, 아드리안과 Buytendijk는 뇌간 표면 레코드 아가미 환기 5와 연관된 리듬을 생성하는 전극을 배치 감소 금붕어 제제를 개발 하였다. 이 방법은이어서 신생아 설치류에서 사용하기 위해 1984 년 6 Suzue 의해 채택되었다. 이 제제의 출현은 호흡 신경 생물학에서 중요한 발전을 주도하고있다. 그것은 상대적으로 간단하기 때문에,이 기술은 H를 제시감수 리듬 모터 행동과 신생아 설치류 기원의 기본 조사의 넓은 범위에 의무입니다.

이 방법의 전체 목표는 흡기 신경 활동의 상관 관계를 기록하는 것, 호흡기 같은 호흡 리듬 네트워크에 의해 생성 된 가상의 호흡을했다. 이 방법은 모두 야생형 7 및 8 트랜스 제닉 동물의 호흡 변화 또는 약리학에 흡기 응답들을 타겟팅, 연구 목적의 넓은 범위에서 사용할 수있다. 기록 된 신호의 생리 학적 관련성에 관한 실험 구 심성 감각없이 낮은 온도에서 수행되며, ACSF 내 글루코스와 O 2의 농도가 높은 조건 하에서, 문제가 발생되었음을 주어진다. 생체 내 및 시험 관내 조건 사이의 명확한 차이가 있지만 (예., 흡기 버스트의 주파수는) 사실이 존재한다는 남아호흡 네트워크 (6)의 핵심 요소는 가능한 중요 기능 항상성 9,10- 연결된 강력한 리듬을 연구 할 수 있도록.

이러한 기술 개발의 사용 배후의 이론적 근거는 신생아에서 특히, 생체 내에서 거의 액세스 네트워크의 호흡 뇌간 요소에 직접 액세스를 용이하게하는 것이다. 뇌간은 엄격하게 통제 된 조건 아래에 배치되어 기록 된 리듬이 폐 또는 경동맥의 몸에서 말초 구 심성 입력에 의해 변조되지 않은, 연구 중심 호흡 드라이브 자체 11 일에 집중할 수 있습니다. 따라서, 이러한 액세스는 자극을 적용하고 출력 신호를 기록하기 위해 이용된다. 녹음 혈량 측정법 달리 호흡 리듬 체내 모든 구성 요소에 의해 변조된다 (예., 폐 팽만, 주변 화학 센서)를 어렵게 정확한 자극을 적용 할 수있다.

에서ewborn 쥐, 프로토콜은 인공 뇌 - 척수 (ACSF) 유지 고립 뇌간에 네 번째 복부 루트 신호와 절단 된 척수를 기록으로 구성되어 있습니다. 뇌간 - 척수 제제에 의해 생성 된 리듬 흡기 신호 (9)에 연결되어 각각의 느린 버스트들로 구성된다. 7 - 고립 된 뇌간 - 척수 준비 쉽게 4 (P4 P0)에 산후 일 0에서 쥐에서 촬영 가능한된다. 이 방법은 일반적으로 네트워크의 호흡 저산소 반응하고, 또한 탄산 혈증, 산증 또는 약물에 대한 반응을 평가하는 데 사용된다. 급성 저산소증 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 이 자극은 ACSF의 O 2의 인출에 의해 얻어진다; 이 방법은 일반적으로 저산소증 욕설 공차 및 응답 성을 평가하는 데 사용된다. 프로토콜은 저산소증 노출 단부 (도 1)까지 12 분부터 제 리듬 우울증을 유도한다. 이 우울증은 반전후 저산소 복구 12시. 실험 설계에 관하여, 그것은 뇌간의 주동이의 부분에있는 뇌교는, 리듬 발생기 (8)에 억제 작용을 가지고주의하는 것이 중요하다. 따라서, 전체 뇌간과 주동이의 척수의 준비는 낮은 리듬을 표시합니다. 기록 용 절연 샘플 뇌교의 포함은 실험 (13)의 목표에 따라 결정된다; 연수 나 네트워크에 뇌교 영향의 연구 결과 (14)를 비교하는 뇌교와없이 녹음을 필요로한다. 또한,이 기술의 이점 중 하나는, 중뇌 및 / 또는 diencephalic 영역 (15, 16)를 포함하는 제제의 입쪽 부분을 연장하는 것이 가능 본토 수질 호흡 네트워크에 이들 영역의 효과를 평가하기 위해 제조하는 가능성이다.

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프로토콜

이 방법은 라발 대학 동물 윤리위원회 (프로토콜 # 2,012에서 170 사이)에 의해 허용되는 동물 환자의 사용을 요구했다.

1. 설치 및 준비

  1. 솔루션
    1. 다음과 같은 조리법 7,17에 따라 ACSF 재고 솔루션을 준비합니다. 농도 변화와 다른 조리법은 문학에서 사용할 수 있습니다. 최대 1 개월 4 ℃에서 보관 재고 솔루션을 제공합니다.
      1. 염 용액 : 염화나트륨 75.39 g의 (129 mM의 최종)를 추가; 의 KCl 2.5 g (3.35 mM의 최종); NaH2PO4의 0.81 G (0.58 mM의 최종) 의 MgCl2의 2.33 G (1.15 mM의 최종) CaCl2를 1.85 g (1.26 mm)이다. 다음 증류수 1 L에 기입 증류수 800 ㎖에 용해.
      2. 중탄산염 용액 :의 NaHCO3 (21 mM의 최종)의 17.65 g을 추가합니다. 증류수 1 L에 기입 증류수 900 mL에 녹인다. 중탄산염 농도의 변화는 산도의 변화가 발생합니다.
      3. 포도당 용액 : 54.06 추가포도당의 G (30 mM의 최종). 다음 증류수 500㎖의 증류수로 채워 400 ml의 용해.
    2. 염 용액 100 ㎖, 중탄산 용액 100 ㎖, 증류수 1 L의 글루코스 용액 50 mL로 희석하여 준비 ACSF. 사용까지 4 ℃에서 보관.
    3. 가온하고 휴식까지 유리관을 연신하여 유리 전극을 준비한다. 사용하기 전에 팁 아래로 모래. 전극은 오랫동안 청결 유지로 많은 시간을 재사용 할 수 있습니다.
  2. 실험 설정
    참고 : 설정 세부 사항은 그림 2에 제시되어있다.
    1. 평균 기, 데이터 수집 시스템, 온도 컨트롤러와 펌프를 이동, 앰프의 전원을 켭니다. 및 원시 신호 (2.5 kHz로)의 아날로그 디지털 변환의 샘플링 속도는 신호 증폭 (이득 = 10,000), 여과 (높은 문턱 값, 5 kHz의 낮은 임계 값, 10 Hz로)를 확인한다.
    2. ACSF과 carbogen (95 % O 2와 거품을 가진 병 채우기 , 5 % CO 2). / 분에서 4 ml의 기록 챔버 (부피 5 ㎖) 및 가온 bubbled--ACSF 흐름을 유도한다. 26 ° C에서 기록 챔버 내 온도 (± 1)을 잡아. pH는이 표준 조건에서 7.4이어야한다.
    3. 해부 실 근처 50 ML의 주사기에 RT와 carbogen - 버블 ACSF 50 ㎖를 유지합니다.
    4. 컴퓨터를 켜고 레코딩 소프트웨어를 시작합니다.

2. 해부

  1. 무게를 시각적으로 동물의 성별을 결정 (여성 짧은 항문 생식기의 거리를 반면 남성, 긴 항문 생식기의 거리를 가지고, 여성 성기 핑크 동안 성기 종종 어두운 수컷).
  2. 다음 옵션 중 하나를 사용하여 신생아 쥐를 마취 : cryoanesthesia을 (완전히 4 얼음 동물을 담그지 - 5 분 18) (4 ㎖ / ㎏에서 equitensine), 주입 휘발성 마취제 (이소 플루 란 (20) 또는 에테르 21)의 19 또는 흡입을. 눌러 확인RM 발 철수 반사의 부재에 의한 마취의 적절한 비행기.
  3. 아래 벤치에 동물, 복부 얼굴을 놓습니다. 제 (피부와 두개골을 통해 볼 수) 브레 그마 수준에서 메스와 coronally 머리의 주동이의 부분. 동물이 마취 후 즉시이 단계를 수행합니다.
  4. 제 몸 coronally 전방 회원에서 메스와.
  5. 수술 얇은 가위와 집게와 피부, 근육, 지방 조직 및 viscus를 제거합니다. 뼈가이 나이에 부드러운 때문에, 신경 시스템에 아무런 영향을 미치지에주의. 벤치에서이 단계를 수행합니다.
  6. 해부 실의 준비를 놓습니다. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다. 기록의 끝이 시점에서 현미경을 사용합니다.
  7. 준비 등의면에서 수술 얇은 가위와 집게와 매체 축을 따라 꼬리 부분에 주동이의 두개골과는 척추를 잘라. 절단 된 두개골을 열고그리고 순서는 척추가 신경 조직을 노출. 준비 산소를 위해 주사기에 strored ACSF를 사용합니다.
  8. 펜치로, 거미 막, 신경 조직의 표면을 덮는 얇은 조직을 제거합니다. 신경 조직에 대한 피아 교인과 혈관을 유지. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  9. 지느러미와 준비가 아래로 향하게 조심스럽게 자리에 준비를 잡고 가위로 신경과 결합 조직을 절단하여 뇌간과 척수를 가져 놓습니다. 등의 방법도 가능합니다. 가능한 한 오랫동안 뿌리 신경을 유지합니다. 뇌간과 척수를 분리하기 위해 뼈를 제거합니다. 준비 산소를 위해 주사기에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  10. 소뇌를 제거하고 메스를 절편으로 주동이의 구조를 나머지. 준비 산소를하기 위해 바늘에 저장된 ACSF를 사용합니다.
  11. 선택적 experimen에 따라탈 디자인은 열등한 소뇌 동맥 (22)에 관상 부 전방에 의해 메스와 뇌교를 제거합니다. 전체 뇌교를 유지하는 것은 쥐의 리듬을 느리게하고 완벽하게 쥐를 억제하는 것에주의. 뇌교의 꼬리 부분을 포함 할 준비가 C4 루트에서 안정적인 주파수의 호흡과 같은 활동을 표시합니다.

3. 녹음

  1. 기록 챔버, 복부 얼굴까지의 준비를 놓습니다. 척수와 뇌간의 주동이 - 대부분의 가장 낮은 부분에 핀 준비를 수정합니다.
  2. 부분적 ACSF으로 전극을 채우기 위해, 주사기 피스톤 당겨서 - (225 μm의 150 유리 팁 직경)의 바늘 전극에 연결된 주사기를 이용하여, 전극의 함몰을 유도한다.
  3. 미세 조작기를 사용하여 조심스럽게 네 번째 복부 뿌리 중 하나에 가까운 전극을 배치합니다. 기타 복부 뿌리는 호흡과 같은 활동 (예를 들어 제시 할 수있다.G., XII 뇌신경, C1 복부 루트).
  4. 부드럽게 신경 어린 뿌리를 흡인하기 위하여 피스톤을 잡아 당겨 주사기를 통해 전극 탱크 내 우울증을 유도한다. 조심스럽게 척수에 적용하기 위해 전극을 이동합니다.
    주의 : 이상적으로 어린 뿌리의 크기가, 전극 개구의 크기와 일치하고, 따라서 전극의 내부 및 외부 사이의 시일 구획을 생성한다. 차동 증폭기는 일반적으로 이러한 기록을 위해 사용되기 때문에, 전극의 내부 챔버와 기록 사이에 개구 된 신호의 품질을 감소시키고 어려운 배경 잡음을 제거 할 수있다.
  5. 녹화를 시작합니다.
  6. 정상 산소의 조건 하에서 제조 제조 리듬을 기록 (즉, ACSF carbogen 버블은 95 % O 2를, 5 % CO 2) 적어도 20 분의 제조 기준 파라미터를 결정하기 위해.
  7. 에 carbogen - 버블 ACSF에서 관류 전환자극 ACSF (즉, 95 % N 2와 5 %의 저산소증 자극에 대한 CO 2와 버블) 15 분. 실험 프로토콜의 따라 노출 시간을 변경합니다. 기록과 동물 시트에 노출 지속 시간을 기록한다. ACSF 병 및 튜브의 외부로의 가스의 확산을 피하기 위해 가능한 챔버 사이에 스테인레스 스틸 튜브를 사용한다.
  8. 복구 기록을 위해 적어도 15 분 동안 표준 carbogen - 버블 ACSF로 다시 관류를 전환합니다. 기록과 동물의 데이터 시트에서이를 기록한다.
  9. 녹음을 종료합니다.

4. 통계 분석

  1. 통합 된 신호로부터, (버스트 / 분으로 표현) 분당 버스트들의 개수와 주파수, 기준선 및 (MV 표현됨) 버스트의 피크 사이의 차이와 같은 진폭으로부터 통화 시간, 버스트 지속 시간을 계산 (S 표현됨) 버스트의 끝부터 시작하여 아래 CUR 지역 버스트 영역(MV 표현 · S) 통합 신호 (그림 3)에 버스트했습니다.
  2. 각 조건에 대한 기록의 마지막 5 분의 평균과 주파수, 진폭, 버스트 기간 및 버스트 영역 정상 산소에서 (베이스 라인), 저산소 (자극)과 후 저산소 (포스트 자극) 복구 조건을 계산합니다. 기록 챔버 내에서 관류 ACSF 균질화 스위칭 사이에 지연이 있기 때문에, 각 상태의 제 1 부분을 분석하지 않는다.
  3. 해당 기록 용 기준 값의 백분율로 자극 후 (즉, 저산소증) 및 후 자극 (즉, 포스트 - 저산소) 복구 값을 표현한다. SD ± 수단으로서 결과를 표현

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결과

서두에서 언급 한 바와 같이,이 기술의 중요한 장점 중 하나는 뇌간에 직접 액세스 다양한 자극을 적용하는 것이다. 예를 들어, 저산소증 여기에 적용 하였다. 그림 1. AB 두 정상 산소와 저산소 조건, 전체 프로토콜 기록을 표시합니다. 그림 1.CE 즉 정상 산소 조건 (기록 리듬을 표시 ACSF는 95 % O 2 5 %로 버블 26 ° C에서 CO 2). 이전에이 정확한 제제 (11)에서 입증 된 바와 같이, 주파수는 약 8 버스트 / 분이고, 진폭이 약 0.800 MV이다. 진폭이 때문에 중요한 간 준비 변화의 나타내는합니다. 낮은 추적 원시 신호를 나타내고 상단 추적은 통합 된 신호를 나타냅니다. 그림 1.DF은 (저산소 조건에 기록 된 예., ACSF가 95 %, N 2, 5 % CO와 버블 리듬을 표시 <서브&g...

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토론

호흡 활동의 정확한 정량화가 어려울 수 있습니다. 실제로, 호흡 자동 자발적 모두 일 수 함수이며, 즉, 환경, 인체의 요구, 감정 상태와 행동에 따라 변조된다. 이 기술의 장점은 호흡기 명령을 생성 할 책임 신경 요소의 분리이다. 따라서, 뇌간, 척수 - 제제와 혈량 측정법의 전기 생리 학적 기록은 각각 시험 관내 및 생체 내에서 신경 세포 호흡 전체 네트워크를 연구하는 상보적인 기술이다. 뇌간 - 척수 준비에 패치 클램프 녹음 (예., 복부 표면에서 접근)도 생각할 수 있고 보존 호흡 네트워크 (24)의 특정 신경 세포의 연구를 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 주로 해부에, 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 신경 조직 손상을 방지하기 위해,모든 해부 단계는 신속하고 정확하게 실행해야합니다. 신경 조직이 손상되어서는 안 조심스럽게 ACSF 상수 침수에 의해 보존 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 신경 어린 뿌리와 전극...

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공개 사항

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계나 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 연구 시설 제공과 재정 지원에 대해 캐나다 보건 연구소 MOP 130258와 아동 건강 연구를 위한 스타 재단, 몰리 토웰 재단에 진심으로 감사드립니다. 저자는 또한 원고 교정과 조언을 해준 Kinkead Richard 박사에게 진심으로 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SylgardSigma Aldrich761036-5EA사용 언더
NaClBioshopSOD002
KClBioshopPOC888
CaCl2BioshopCCL444
MgCl2BioshopMAG510
NaHCO3BioshopSOB999
NaH2PO4BioshopSPM306
D-glucoseBioshopGLU501
CarbogenLinde343-02-0006 
온도 조절기Warner Instruments, Hamden, CT, USATC-324B
흡입 전극AM 시스템, Everett, WA, USA모델 573000
차동 AC 증폭기AM 시스템, Everett, WA, USA모델 1700
Moving averagerCWE, Ardmore, PA, USA모델 MA-821
데이터 수집 시스템Dataq Instruments, Akron, OH, USA모델 DI-720
LabChart 소프트웨어ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
프리즘 소프트웨어Graphpad, La Jolla, CA, USA
해부 챔버플라스틱 상자 (예 : 페트리 상자)는
녹음 챔버홈 메이드
베이스Kanetec, Bensenville, IL, 미국MB
MicromanipulatorWorld Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USAKITE-R
BaseKanetec, Bensenville, IL, USAMB
연동 펌프Gilson, Middleton, WI, USAMINIPULS 3
패러데이 케이지홈 메이드
컴퓨터
후드

참고문헌

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신생아 설치류에서 분리 뇌간 - 척수 준비에 전기 생리학은 신경 호흡 네트워크 출력 녹화를 할 수 있습니다
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