신생아 설치류에서 분리 뇌간 - 척수 준비에 전기 생리학은 신경 호흡 네트워크 출력 녹화를 할 수 있습니다

요약

중추 호흡 드라이브는 뇌간에 있습니다. 고립된 뇌간-척수에서 출력되는 자발적인 호흡 운동은 네 번째 배뿌리에 전극을 배치하여 기록됩니다. 이 실험적 접근 방식은 약리학적 조사 또는 리듬 운동 행동에 대한 호흡 문제 및 유전자 조작 평가에 유용합니다.

초록

중추 호흡 욕구가 뇌간에 있다는 것은 잘 알려져 있지만, 중추 호흡 욕구의 기본 기능, 발달 및 자극에 대한 반응의 여러 측면은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 전체 동물에서 뇌간에 접근하는 어려움을 극복하기 위해 뇌간과 척수의 일부를 분리하는 작업이 수행됩니다. 이 제제는 인공 뇌척수액에서 유지되며 가스, 농도 및 온도가 제어되고 모니터링됩니다. 호흡기망의 출력 신호는 네 번째 복부근에 배치된 흡입 전극에 의해 기록됩니다. 이러한 방식으로 자극을 뇌간에 직접 적용할 수 있으며 그 효과를 직접 기록할 수 있습니다. 기록된 신호는 횡격막을 통해 횡격막으로 전달되는 흡기 신호와 연결되어 있으며, 파열(분당 약 8회 파열)로 설명할 수 있습니다. 이러한 파열(주파수, 진폭, 길이 및 곡선 아래 면적)을 분석하면 호흡기에 대한 자극 효과를 정확하게 특성화할 수 있습니다. 이 방법의 주요 한계는 초기 산후 단계를 넘어서는 준비의 실행 가능성입니다. 따라서 이 방법은 갓 태어난 쥐의 주변 입력 없이 전체 네트워크를 연구하는 데 크게 중점을 둡니다.

서론

호흡 옥시젠 (O ₂₎ 흡수 및 이산화탄소 (CO _2)를 제거 가능하게 뇌에 의해 제어 복잡하고 생명 활동이다. 중앙 호흡기 드라이브는 모두 포유류 ¹ 뇌간에있는 복잡한 네트워크, 양서류 ^2, 파충류 ^3, 조류 ⁴ 물고기 ^(5)에 의해 생성된다. 호흡의 연구는 생체 내에서 처리 할 수없는 경우에도, 정확한 역학적 조사 호흡 제어 네트워크에 직접 액세스를 필요로한다. 이를 위해, 아드리안과 Buytendijk는 뇌간 표면 레코드 아가미 환기 ^5와 연관된 리듬을 생성하는 전극을 배치 감소 금붕어 제제를 개발 하였다. 이 방법은이어서 신생아 설치류에서 사용하기 위해 1984 년 ⁶ Suzue 의해 채택되었다. 이 제제의 출현은 호흡 신경 생물학에서 중요한 발전을 주도하고있다. 그것은 상대적으로 간단하기 때문에,이 기술은 H를 제시감수 리듬 모터 행동과 신생아 설치류 기원의 기본 조사의 넓은 범위에 의무입니다.

이 방법의 전체 목표는 흡기 신경 활동의 상관 관계를 기록하는 것, 호흡기 같은 호흡 리듬 네트워크에 의해 생성 된 가상의 호흡을했다. 이 방법은 ....

프로토콜

이 방법은 라발 대학 동물 윤리위원회 (프로토콜 # 2,012에서 170 사이)에 의해 허용되는 동물 환자의 사용을 요구했다.

1. 설치 및 준비

1. 솔루션
   1. 다음과 같은 조리법 ^7,17에 따라 ACSF 재고 솔루션을 준비합니다. 농도 변화와 다른 조리법은 문학에서 사용할 수 있습니다. 최대 1 개월 4 ℃에서 보관 재고 솔루션을 제공합니다.
      1. 염 용액 : 염화나트륨 75.39 g의 (129 mM의 최종)를 추가; 의 KCl 2.5 g (3.35 mM의 최종); NaH2PO4의 0.81 G (0.58 mM의 최종) 의 MgCl2의 2.33 G (1.15 mM의 최종) CaCl2를 1.85 g (1.26 mm)이다. 다음 증류수 1 L에 기입 증류수 800 ㎖에 용해.
      2. 중탄산염 용액 _:의 NaHCO3 (21 mM의 최종)의 17.65 g을 추가합니다. 증류수 1 L에 기입 증류수 900 mL에 녹인다. 중탄산염 농도의 변화는 산도의 변화가 발생합니다.
      3. 포도당 용액 : 54.06 추가포도당의 G (30 mM의 최종). 다음 증류수 500㎖의 증류수로 채워 400 ml의 용해.
   2. ....

결과

서두에서 언급 한 바와 같이,이 기술의 중요한 장점 중 하나는 뇌간에 직접 액세스 다양한 자극을 적용하는 것이다. 예를 들어, 저산소증 여기에 적용 하였다. 그림 1. AB 두 정상 산소와 저산소 조건, 전체 프로토콜 기록을 표시합니다. 그림 1.CE 즉 정상 산소 조건 (기록 리듬을 표시 ACSF는 95 % O ₂ 5 %로 버블 26 ° C에서 CO _2). 이전에이 정확한 제제 ^(11)에서 입증 된 바와 같이, 주파수는 약 8 버스트 / 분이고, 진폭이 약 0.800 MV이다. 진폭이 때문에 중요한 간 준비 변화의 나타내는합니다. 낮은 추적 원시 신호를 나타내고 상단 추적은 통합 된 신호를 나타냅니다. 그림 1.DF은 (저산소 조건에 기록 된 예., ACSF가 95 %, N _2, 5 % CO와 버블 리듬을 표시 <서브&g.......

토론

호흡 활동의 정확한 정량화가 어려울 수 있습니다. 실제로, 호흡 자동 자발적 모두 일 수 함수이며, 즉, 환경, 인체의 요구, 감정 상태와 행동에 따라 변조된다. 이 기술의 장점은 호흡기 명령을 생성 할 책임 신경 요소의 분리이다. 따라서, 뇌간, 척수 - 제제와 혈량 측정법의 전기 생리 학적 기록은 각각 시험 관내 및 생체 내에서 신경 세포 호흡 전체 네트워크를 연구하는 상보적인 기술이다. 뇌간 - 척수 준비에 패치 클램프 녹음 (예., 복부 표면에서 접근)도 생각할 수 있고 보존 호흡 네트워크 ^(24)의 특정 신경 세포의 연구를 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 주로 해부에, 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 신경 조직 손상을 방지하기 위해,모든 해부 단계는 신속하고 정확하게 실행해야합니다. 신경 조직이 손상되어서는 안 조심스럽게 ACSF 상수 침수에 의해 보존 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 신경 어린 뿌리와 전극.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	사용 언더
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
온도 조절기	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
흡입 전극	AM 시스템, Everett, WA, USA	모델 573000
차동 AC 증폭기	AM 시스템, Everett, WA, USA	모델 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	모델 MA-821
데이터 수집 시스템	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	모델 DI-720
LabChart 소프트웨어	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
프리즘 소프트웨어	Graphpad, La Jolla, CA, USA
해부 챔버	플라스틱 상자 (예 : 페트리 상자)는
녹음 챔버	홈 메이드
베이스	Kanetec, Bensenville, IL, 미국	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
연동 펌프	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
패러데이 케이지	홈 메이드
컴퓨터

후드