방법 논문

두 선택 재생 테스트를 사용하여 마우스의 초음파 발성 환경 설정을 결정

DOI:

10.3791/53074

⸱

2015년 9월 3일

 ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine, Azabu University, 2Division of Electric and Information Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Kato Acoustics Consulting Office

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

쥐의 초음파 발성(USV)은 나이, 성별, 상태 및 유전적 배경에 따라 다릅니다. 서로 다른 위치에서 동시에 방송되는 두 개의 초음파 이미터를 사용하는 이 두 가지 선택 테스트는 USV의 서로 다른 특성에 대한 쥐 인식 및 선호도 반응을 평가할 수 있습니다.

초록

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생쥐는 강아지 격리 및 성인의 사회적 상호 작용과 같은 다양한 조건에서 초음파 발성(USV)을 방출합니다. 이러한 USV는 방출 동물의 연령, 성별, 상태 및 유전적 배경에 따라 다릅니다. 많은 연구에서 이러한 차이를 특성화했지만, 수신기 마우스가 객관적으로 다른 USV를 구별하고 특정 소리 특성에 대한 선호도를 나타낼 수 있는지 여부는 아직 밝혀지지 않았습니다. 마우스가 USV의 서로 다른 특성을 구별할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 최근에 재생 실험이 개발되었으며, 이 실험에서는 두 개의 서로 다른 USV에 대한 마우스의 선호도 반응을 장소 선호도의 형태로 평가할 수 있습니다.

먼저 마우스의 USV를 기록했습니다. 그런 다음 녹음된 USV를 편집하고 그에 따라 트리밍한 다음 스테레오 사운드 파일로 내보냈습니다. 다음으로, 실험에 사용된 두 개의 초음파 이미터에 의해 생성된 USV 진폭을 동일한 음압 레벨로 조정했습니다. 나노 결정 실리콘 열음향 이미터는 USV를 재생하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 선택된 USV에 대한 피험자 마우스의 선호도를 조사하기 위해, 두 개의 서로 다른 USV 신호 쌍을 두 개의 선택 테스트 박스에서 동시에 재생했습니다. 초음파 이미터 근처의 정의된 영역에 반복적으로 들어가 이미터 앞의 철망을 검색함으로써 마우스는 한 소리가 다른 소리보다 선호되는 것을 나타냅니다. 이 모델을 사용하면 다양한 컨텍스트에서 마우스 USV의 다양한 기능의 매력도를 비교할 수 있습니다.

서론

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많은 동물 종자 간 통신을위한 발성을 사용합니다. 마우스 뮤스의 musculus에서 통신 신호의 하나의 중요한 유형은 20 kHz의보다 높은 주파수가 초음파 발성 (USVs)이다. 마우스에 의해 방출 USVs는 남성 여성, 1-4 여성 - 여성 1, 5, 남성 - 남성 (1), (6) 상호 작용의 사회 인식의 구성 요소로 간주됩니다. USVs는 그녀의 강아지 - 검색 행동을 증가 어머니로부터 분리되는 경우도 새끼에 의해 방출, 따라서 생존 7 강아지 있습니다. 많은 보고서가 적은 10에 설명 된 분석 마우스 USVs 8, 9, 행동 반응 및 수신 동물의 신경 메커니즘을 분류하고 있지만 11. 후자 USVs의 다양한 특성의 생물학적 의미를 명확하게 할 필요가있다. 이러한 메커니즘을 나타 내기 위해, 재생 실험 효율적인 방법이다. 최근 재생 연구는 여성의 것으로 밝혀졌다마우스는 USVs (12)에 매료되어, 그들은 그들의 부모 (13), (14)에서 다른 남성에서 USVs을 선호.

이 문서에서는 마우스의 USV 환경을 평가하는 데 사용되는 재생 테스트를 설명합니다. 두 선택 테스트 박스가도 1에 도시 된 두 개의 다른 USVs는 테스트 케이스의 두 구획을 동시에 재생할 수있는 개발되었다. 시험 상자의이 유형은 세 개의 서브 - 챔버에서 검사 영역을 분할하여 음성 오염을 방지 납 벽을 사용하여. 초음파 방출은 각 객실 외부에 있습니다. 객실과 초음파 이미 터 사이의 벽에서 철망으로 덮여 구멍이 있습니다. 마우스는 3 방에서 자유롭게 이동하고, 초음파 에미 터에 의해 재생 USVs에 응답하는 것처럼, "메시 검색"동작을 보여줄 수있다. 이 시험에서, 생쥐는 하나의 사운드 이미 터 또는 서로 근접 상이한 지속 기간까지. 이러한 매개 변수는 민감한 measu를 얻을 기록 할 수 있습니다 사운드 환경 설정의 재.

다시 USVs를 재생하려면, 나노 결정 실리콘 열 음향 방출 (즉, "NC-시 터")는 이전의 연구 15-17에서 사용 하였다. 이러한 장치는 박막 가열기 전극, 나노 다공성 실리콘 층과 단결정 실리콘 웨이퍼로 구성된다. 디지털 사운드 파일을 아날로그 신호로 변환 한 후 히터 전극을 통과한다. 장치는 낮은 왜곡과 상당한 음압으로 인한 전위 의존성 열 신호를 변환한다. 기계적 진동에 의존하는 일반적인 소리 발생기,이 진동판의 필요없이 음향을 재생 달리이 장치는 점에서 독특하다. 이미 터 (20)로부터 160 kHz에서 (도 2)까지의 주파수에서 평면 음압 레벨을 나타내고, 그리고 시간, 주파수 및 음압 레벨 15, 18, ​​19의 측면에서 매우 정확하게 디지털 기록 뮤린 USVs를 재생할 수있다.

도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 ve_content은 ">, C57BL / 6 (B6) 암컷 BALB / C (BALB) 사이 남성 USVs 및 배경 잡음을 선택하는 것이 허용되었다. 또한,도 4는 사이 B6 및 BALB 암컷의 선택을 도시 BALB 및 B6 남성에서 동시 USV의 플레이는 이전의 연구에서보고 된 14. 남성 USVs의 특성은 B6 사이의 차이와 BALB 20 종자. 이러한 결과에 의해, USVs의 매력은 본 프로토콜로 평가 될 수있다 바와 같이, 하는 소리, 라이브 개인으로부터 기록 된 음향 분석 및 기타 개인 재생됩니다.

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프로토콜

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모든 절차가 아자 부 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 실험은 방음 실에서 실시 하였다.

1. 동물 준비

  1. 녹음을위한 남성
    1. 짝짓기 경험이 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 가져옵니다.
  2. 여성 주제
    1. (- 오래된 12 주 보통 8) 케이지 당 2-5 한배 새끼와 함께 보관 된 처녀 암컷 마우스를 가져옵니다.
    2. 매 클린 (21)에 따라, 검사 전 발정주기의 위상을 결정하기 위해 매일 질 얼룩을 얻습니다. 주의 pseudopregnancy 않도록 질 자극을 최소화하기 위해주의해야한다.
    3. 넬슨 (22)에있어서, 김사와 얼룩 얼룩 및 존재 또는 백혈구, 각질화 된 상피 세포, 상피 세포 및 핵의 유무에 기초하여 발정주기의 위상을 결정한다.

2. 장치 (그림 1)

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그림 두 선택 테스트 상자 및 장치의 도식. 마우스는 그들과 중립 지역 ​​사이에있는 작은 문을 통해 방 A와 B에 액세스 할 수 있습니다. 두 선택 상자와 두 초음파 방사체는 방음 실의 바닥에 배치된다. 마이크는 방음 실 내부에 일시 중단됩니다. 약기 :. PC, 개인용 컴퓨터 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
  1. 기록
    1. USB의 A / D 컨버터를 이용하여 PC에 초음파 콘덴서 마이크로폰을 연결한다.
    2. "7"에 대한 A / D 컨버터의 이득 레벨을 설정한다.
    3. 오디오 캡처 소프트웨어를 사용하여 400 kHz의 샘플링 레이트를 갖는 16 비트 포맷 파일의 레코드 데이터 탄성.
  2. 재생
    1. D / 사용하여 PC에 컨버터를 연결USB 인터페이스.
    2. 감쇠기를 통해 D에 두 앰프 / A 컨버터를 연결합니다. (후자의 디바이스는 과부하를 방지하는 역할을한다.)
    3. 각 앰프에 초음파 이미 터를 연결합니다.

3. USV 기록

  1. 측벽에 6cm 직경의 구멍과 0.5 CM 철망으로 덮여 구멍에 소형 (17 × 10 X 11cm)에 남성 마우스 또는 중간 크기 (21 X 14 X 13cm) 케이지를 놓습니다. 중형 케이지를 사용할 때, 면적을 감소시키는 케이지의 중심을 가로 질러 파티션을 구성.
  2. 녹음을 오염시킬 수 부스럭 거리는 소음을 방지하기 위해 새장에 침대를 사용하지 마십시오.
  3. 메시 옆에 마이크를 배치합니다.
  4. 2.1 단계에 표시된 녹화 설정과 초음파 발성 모니터링을 시작합니다.
  5. 남성 마우스와 케이지에 metestrus 또는 diestrus 중 하나의 성적으로 성숙한 여성 마우스를 놓습니다.
  6. 5 분 - 3 녹음 USVs.

4. TEST 박스

  1. 아크릴 보드 (그림 1)를 사용하여 테스트 상자를 구축 할 수 있습니다.
    참고 : (× 20 ​​(35), 및 X 20cm 높이)를 세 구획으로 나누어 져 시험 상자 : 중립 지역 (15 X 20cm), 객실 A와 B (20 × 10cm, 각각). 방 및 B는 각각 0.5 ㎝ 철망으로 덮여 4cm 직경 홀을 갖는다. 구멍 메시는 중립 지역 및 객실 A와 B 사이의 객실 A와 B의 각 끝에 확인 게이트 (5 × 5cm 각)에 위치
  2. 사운드 누설은 각 메시의 둘레 상자로 밀봉 고무 플레이트를 사용하여, 메쉬에 대향 측면을 제외한 각 초음파 방사기를 절연 방지한다.
  3. 방음을위한 객실 A와 B 사이의 벽의 양쪽에 배치 리드 씰.

5. 사운드 재생을위한 준비

  1. 재생 사운드의 창조
    1. 디지털 오디오 편집 소프트웨어를 사용하여 기록 된 파일로부터 USV의 20 초 세그먼트를 캡처.
    2. 선택하지 않고 배경을 캡처이세 20 초 USV 세그먼트 파일에서 (0.35 초). 소음 세그먼트를 반복하여 20 초 배경 잡음 파일을 만듭니다.
    3. "왼쪽 귀"를 위해 다른 파일을 하나의 파일로, 하나의 스테레오 사운드 파일로 내보낼, 동시에 두 개의 사운드 파일을 재생하려면 "오른쪽 귀."
    4. 40 kHz의 컷오프와 같은 고역 통과 필터를 사용하여 사운드 파일을 필터링.
    5. 후 처리 소프트웨어의 노이즈 감소 도구를 사용하여 소음을 줄일 수 있습니다. 선택하고 노이즈 감소 프로파일과 더 USVs가없는 파일의 세그먼트를 캡처하고, 40 레벨과 노이즈 감소를 실행합니다.
  2. 재생 사운드의 교정
    1. 초음파 이미 터와 마이크 사이의 공간이 10cm 있는지 확인합니다.
    2. 에미 터에서 초음파의 음압 레벨을 교정하는 단계 2.1에 기재된 구성을 사용하여 초음파 모니터링을 수행한다. 데시벨 마이크 (dB)로 음압 레벨을 측정합니다.
    3. USI감쇠기 및 증폭기 겨, 3 단계에서 기록한 남성 USVs 동일한 음압 레벨 초음파 에미 터에 의해 발생 USVs의 볼륨을 조정한다.
    4. 두 초음파 에미 터 및 USVs 및 배경 잡음으로 구성된 사운드 파일을 사용하는 경우, 두 초음파 방출기 행동 시험을 수행하기 전에 보정 사운드 (예를 들어, 75 kHz의 순음)를 사용하여 동일한 음압 레벨을 나타내는 것을 확인한다.
    5. USVs 두 스트림으로 구성된 사운드 파일을 재생하는 경우, 실험 전에, 동일한 레벨로 생성 된 두 음압 레벨을 조정한다.

6. 두 선택 테스트

  1. 시험 상자의 메쉬 뒤에 초음파 이미 터를 놓습니다.
  2. 아크릴 보드와 함께 객실 A와 B에 문을 닫고 30 분 동안 중립 영역에 여성의 주제를 길들. 마우스를 탈출 할 수있는 방지하기 위해 아크릴 보드 상자를 커버.
  3. CC를 사용하여 비디오 녹화를 시작합니다D 카메라는 상자 위에 장착. 카메라 (하지 그림 1)은 세 개의 구획의 영역을 다루고 있습니다.
  4. 게이트와 커버 보드를 제거하고 여성의 사운드 영역을 포함하여 자유롭게 테스트 상자를 탐색 할 수 있습니다.
  5. 여성 모두 메쉬를 조사하였으며, 중성 영역으로 돌아 오면, 5 또는 10 분 동안 20 초 반복 사운드 파일을 재생 시작한다.
  6. 5 또는 10 분 동안 행동 모니터링을 실시한다.
  7. 이전 대상에서 침착 원하지 않는 후각 신호를 감소 70 % 에탄올과 시험 사이의 테스트 새장을 청소합니다.
  8. 초음파의 이미 터의 위치를​​ 랜덤하게 전환 B 실 또는 B. 향해 고유 측 바이어스 효과를 피하기

7. 통계 분석

  1. 다음 매개 변수를 분석, 행동 이벤트 득점 소프트웨어를 사용하여 각 방에있는 항목의 총 수를; 각각의 중간 영역에서 체류 전체 기간; 각 사운드 영역에서 체류 전체 기간; 과초음파 방출의 앞에 각 메시의 검색의 총 시간. 그림 1은 "중간 영역"과 무엇을 의미하는지 설명 "사운드 영역을 설정합니다."
    참고 경우 마우스 두 영역 사이의 분할 선 (도 1, 점선)의 머리 방향으로의 위치 결정을 유지한다. 헤드 측 메시에 직면했을 때, 그것은 사운드 존에서 머물 얻었된다.
  2. 각각의 행동 매개 변수에 대해 0.05의 유의 수준을 갖춘 객실에 대한 반응과 B 윌 콕슨 부호 순위 테스트를 사용하여, 또는 쌍 T의 -tests를 비교합니다.

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결과

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USVs는도 3에 도시 된 대표적인 실험에서 사운드 재생으로 사용 하였다 한 BALB-남성 (20 초 당 161 음절)뿐만 아니라 배경 잡음에서 기록 하였다.이 실험에서, 7 여성 B6 마우스는 9 주령에 사용 하였다 . 사운드를 재생하기 위해 여성의 응답 테스트의 가장 시간을 결정하기 위해, 행동 파라미터는 총 10 분의 시험 시간의 처음과 마지막 다섯 분 동안 별도로 분석 하였다.

먼저, 어떤 측면 bias.The 결과는 배경 잡음 측면 사이에 차이가 없다고 없었다 있다는 것을 보여주는, 재생 (도 3a) 전의 조사 시간 동안 룸 또는 B의 체류 전체 기간에서 유의 한 차이가 없었다 및 제 5 분, 마지막 5 분, 총 시험 시간 (도 3b)을 분석 룸 항목 수에 남성 USVs 측은.도 3c는 durat 누적 초를 나타낸다재생하는 동안 각 방에 숙박 이온...

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토론

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여기에서 대표적인 테스트 결과는 암컷 마우스가 인공 수컷 USV와 배경 소음을 구별할 수 있음을 보여주었습니다(그림 3). 이러한 결과에서 도출할 결론은 판별 신호가 방과 사운드 존에 머무는 시간과 테스트의 처음 5분 동안 메쉬 검색 시간에 반영되지만 두 번째 5분에는 반영되지 않는다는 것입니다(그림 3C, E 및 F). 이러한 데이터는 생쥐가 초음파 방출기 근처에서 발생하는 사회적 접촉 부족 때문에 재생 소리에 익숙해짐을 나타냅니다. 따라서 최적의 테스트 시간은 5분입니다.

이러한 발견은 USV가 "소음보다 더 참신한 소리"라는 사실을 설명할 수 있습니다. 그러나 이전의 재생 연구에 따르면 암컷 쥐는 수컷 USV의 소리에는 끌렸지만 참신한 인공 소리에는 끌리지 않는 것으로 나타났습니다12. 단순히 새로운 소리는 암컷 쥐에게 영향을 미치지 않는다고 가정합니다.

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은에 의해 지원되었다 그랜트 - 에이드에서 AA에 JSPS 휄로우; 보조금 인 원조 과학 연구에 대한 JSPS 휄로우위한 혁신적인 분야 (제 4501 호 및 제 25132712) TK에에 의해; 와 아자 부 대학. 그림 2에 의해 수여 연구 프로젝트 부여하여 키하라, 토니, 하라다, T., Koshida, N. 웨이퍼 호환 제조 및 나노 결정 실리콘 열 유도 초음파 이미 터의 특성에서 다시 인쇄됩니다. 센서 및 액추에이터 :에서 물리적 볼륨 (125), 엘스 비어, P. (426), (2006), 엘스 비어의 허가.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
방음 챔버Muromachi Kikai
소형 케이지CLEA JapanCL-0113-1
중간 케이지CLEA JapanCL-0103-1
초음파 콘덴서 마이크Avisoft BioacousticsCM16/CMPA
A/D 컨버터Avisoft BioacousticsUltraGate116H
오디오 소프트웨어Avisoft Bioacoustics,RECORDER, USGH
Adobe Audition 3.0 / 오디오 편집 소프트웨어Adobe Systems, Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter,원본상업용은 아니지만, 가까운 장래에 그렇게 될 예정입니다
: D / A 변환기National Instruments, NI USB-6251, BNC
감쇠기, 원본
앰프Yamatake
PCWindows 7 professionalIntel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64비트 운영 체제
이벤트 레코더 엑셀 매크로 / 이벤트 스코어링 소프트웨어원본프로그래밍 Naoto Akagawa & 타케루 야마모토
CCD 카메라
고무판(엘라스토머 수지제)도쿄 분TI-75BK B4적절한 크기로 자릅니다
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참고문헌

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