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방법 논문

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

12.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53077

⸱

2015년 8월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

이 논문에서

요약

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

초록

생체 내에 현미경 살아있는 동물에서 다른 상이한 영역에서의 프로세스와 혈관을 조사하는데 사용될 수있는 방법이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 장간막 정맥의 생체 내에 현미경을 설명합니다. 이는 생체 내에서 내피 백혈구 작용을 도시 재현 결과 단시간에 행할 수있다. 우리는 내피 세포의 LPS 도전 후 염증 설정을 설명합니다. 그러나이 모델에 하나, 세균 화학 또는 생물학적 같은 염증성 질환의 많은 다른 유형을 적용하고 약물의 관리 및 살아있는 동물에 미치는 직접 효과와 백혈구 채용에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 혈관 염증 반응에 미치는 영향의 다른 치료의 숫자에 성공적으로 적용되고있다. 여기서, 우리는 형광 로다 민 6G 이러한 레이블에 의해 백혈구 및 혈소판의 시각화를 설명합니다. 또한, 특정 영상은 PE 될 수 있습니다대상 형광 표지 된 분자를 사용하여 rformed.

서론

이 프로토콜의 목적은 염증 조건에서 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 직접적인 관찰을 위해 쥐를 거주 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 간략화 된 기법을 설명하기위한 것이다.

생체 내에 현미경은 염증 백혈구 모집 및 기능을 이해하는 사소한하지만 중요하지 않은 염증성 질환 1, 2에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜에서 우리가 설명하는 방법은 이전에 발행 된 출판물을 기반으로 개발되었다. 발표 된 내용에 성장 혈전 3 병렬로 혈소판 통합을 시각화 유사 이전 4 표면화 장간막 정맥은 투과광 현미경으로 검사한다. 이러한 쥐 5 마우스의 간 및 쥐 (6)의 cremaster 근육으로 내 생명 현미경의 다양한 모델이 있습니다.

장간막 정맥의 생체 내에 현미경이 개발되고 여러 그룹에 의해 이전의 연구에 적용되어왔다. - / - 누구의 혈소판 세로토닌 약리학 장기 고갈 된 쥐에 연구 결과 비 신경 세로토닌의 결핍과 비교 마우스, 우리는 야생형 마우스 및 트립토판의 hydroxylase1 (Tph1) 사이의 백혈구 모집의 차이를 관찰하기 위해이 기술을 사용했다 애플리케이션 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 인 플루옥세틴 ​​7. 우리는 또한 급성 플루옥세틴 ​​치료 (8) 후 백혈구 - 내피 상호 작용을 조사 하였다.

이 모델은 신속하게 수행하고, 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 유효 측정을 허용 할 수 있기 때문 프로토콜에서는, 장간막 정맥의 생체 내에 초점 현미경. 이것은 훨씬 더 어렵고 시간이 소요되는 등의 뼈, 간, 피부, 근육 등 cremaster 또는 다른 장기의 생체 내에 현미경이다. 모드여기에 설명 된 L은 리포 폴리 사카 라이드의 복강 내 주사로 염증 자극, 그것을 challengeing 후 염증 세포 - 세포 상호 작용의 재현성 평가에 이상적입니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 독일의 동물 보호 법률 (TierSchG)을 준수 하였다. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) 및 국가 동물 복지 몸 GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html)에 의해 정의 된 마우스는 보관과 좋은 동물 관행에 따라 처리되었다. 프라이 부르크 대학의 동물 복지위원회뿐만 아니라 지방 자치 단체 (Regierungspräsidium 프라이 부르크)는 모든 동물 실험을 승인했다.

1. 동물 취급, 준비 및 염증의 유도

  1. 16-20g의 무게 범위 6 주령의 수컷 마우스 - 4를 사용합니다. 참고 : 마우스는 이전 또는 무거운 경우가 현미경 관찰을 제한, 선박을 둘러싼 과도한 지방을 제시한다.
  2. 수술에 앞서 모든 도구와 현미경 테이블을 소독.
  3. 주사 20 ㎎ / ㎏ LPS (리포 폴리 사카 라이드) 복강 4 세균 inflamm을 유도하는 생활 마우스로는 현미경하기 전에 시간ATION.
  4. 플라스틱 챔버 및 장간막 조직 가습 37 ℃에서 수조에서 0.9 % 식염수 Prewarm.
  5. 바로 현미경 절차 전에 복강 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 대안 마취는, 예를 들면, 2 % 이소 플루 란 흡입을 사용할 수있다. 반사 자극 (회사의 압력과 발가락 또는 꼬리 핀치)에 응답의 손실에 의한 적절한 마취를 확인합니다.
  6. 면도기를 사용하여 복부를 털을 뽑다 에탄올 70 %로 포화 거즈로 느슨하게 머리를 제거합니다.
  7. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 적용합니다.

2. 수술

  1. 70 % 에탄올을 사용하여 복부 멸균. 이 방법은 멸균 방법 아니며 실험의 마지막에 치명적일 수있다.
  2. 중간 개복술을 수행 작은 곡선 집게와 작은 가위를 사용하여 복부 피부를 엽니 다. 에피을 확인gastrical 용기는 용기를 보호하기 위해, 원격 교육 알바의 영역에서 복막을 열고.
  3. 습윤 티슈 유지 복강 데워진 식염수 몇 방울을 적용한다.
  4. 형광 50 μL의 로다 민 6G 9, 10 전에 설명 된 바와 같이 역 궤도 (1 ㎎ / ㎖)을 주입하여 라벨 백혈구 및 혈소판.
  5. 10cm의 직경을 갖는 페트리 디쉬에 ileumand 장소 그것의 외면 화하다 루프 및 37 ° C를 도포하여 습윤 티슈 유지 확인은 식염수 (0.9 %), 다른 모든 순간 데워진.

3. 생체 내에 현미경

  1. 현미경 아래에 마우스를 위치시키고 (200)의 직경과 장간막 정맥을 가지고 - 뷰의 중심에서 300 μm의. 눈에 보이는 지방 환경과 용기를 선택합니다.
  2. 하여 내피 세포의 자극을 피 장간막 혈관을 만지지 마십시오. 조심스럽게 회장 루프를 처리합니다.
  3. 혈액 세포 내피 상호 작용을 시각화반전 또는 직립 현미경 및 현미경 소프트웨어를 사용하여 카메라. 녹음 혈액 마우스 당 4 개의 정맥에 1 분 동안 세포 내피 세포의 상호 작용.
  4. 촬상 실험 종료 후 경추 탈구하여 마우스를 안락사.

4. 분석

  1. 분석 오프라인을 수행하고 모든 매개 변수에 대한 눈을 멀게. 임의의 적합한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석을 수행.
  2. 관내 피 세포의 흐름에 집중 높은 시간 해상도 씨네 클립에서 안정하고 interindividually 필적 혈류 상태 (최대 프레임 율)을 확인한다.
  3. 롤링 백혈구의 수를 정량화. 그 때문에 정맥을 통해 수직선을 그리고 1 분에이 선을 넘어 모든 백혈구를 계산합니다.
  4. 하나의 백혈구가 안정적으로 내피 세포에 롤링 동안 50 ㎛의 거리를 통과하는 데 필요한 시간을 측정하여 회전 속도를 결정합니다. 이 작업을 수행하려면, 50 μm의 t의 거리에 두 개의 수직 라인을 그릴정맥 hrough.
    1. 대표적인 백혈구 필요한 시간 (μm의 / s)으로 50 μm의 분할함으로써 other.Calculate 한 행에서 백혈구의 속도를 얻기 위해 필요한 시간을 측정한다.
  5. 0.04 mm (2)의 필드에 백혈구 부착을 측정한다. 이를 위해, 정맥에 200 ㎛, 변의 길이와 사각형을 그린다.
    1. 이 광장 내에서 30 초 동안 눈에 보이는 운동으로 정의 된 회사 부착 백혈구, 계산합니다.
  6. 혈소판, 백혈구 작용을 정량화하는 하나의 백혈구 결합 혈소판의 개수를 카운트.

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결과

이 프로토콜에 설명 된 실험 환경의 개요가도 1에 도시되어있다. 이것은 생체 내에 현미경에서 관찰 할 수 표면화 회장 루프 및 그 용기와 마우스를 보여준다.도 2 인해 미처리 동물에서 활성화의 어느 정도를 나타낸다 절차 자체. 그러나 거의 느린 압연 또는 LPS 처리 쥐에 비해 백혈구의 회사 접착이있다. 또한 야생형 마우스 중 마시는 물이나 치료 쥐 3 주 동안 플루옥세틴 ​​처리 하였다. 그림 2A-에서 생체 내에 현미경의 다른 결과를 보여줍니다 그림 2 도 2F-H에 추가하여 마우스를 LPS로 처리하면서, LPS와 더 염증성 도전없이 결과를 표시 하였다. 회전 속도가 LPS 도전 후 감소하는 동안 여기에서 우리는, 압연 및 부착 백혈구의 높은 숫자를 볼 수 있습니다. 이 실험을 통해 우리는 혈소판의 세로토닌이 C 것을 보여줄 수염증 7 백혈구 모집의 초기...

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토론

여기에서 우리는 준비 및 생체 내에서 쥐의 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 성능을 설명합니다. 이 방법은 우리에게 살아있는 유기체에 직접 백혈구가 내피 세포와 혈소판 내피 세포의 상호 작용 (11)을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다.

내피 세포를 염증 초기 반응으로 활성화됩니다 압연, 접착력과 윤회 (12)의 결과 백혈구 및 혈소판과 상호 작용한다. 그러나 백혈구는 혈소판이 소위 형성하는 상호 작용, 혈소판, 백혈구 단지, 주로 혈소판 - 호중구 단지 (PNCs) 및 혈소판 - 단핵구 단지 (PMCS) 13, 14 .These 상호 작용이 관찰이 방법으로 정량화 할 수있다.

또한이 기술은 (혈소판 / 백혈구 작용 후의 예) VCAM-1, ICAM-1과 같은 마커 내피의 활성화 (15)을 조사 허용한다.

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공개 사항

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감사의 글

이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
로다민 6G시그마-알드리치  989-38-8
대장균의 지질다당류 055:B5Sigma-AldrichL2637 

참고문헌

  1. Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
  2. Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
  3. Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
  4. Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
  5. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
  6. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
  7. Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
  8. Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316(2014).
  9. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  10. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
  11. Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
  12. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  13. Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
  14. Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
  15. Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).

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백혈구-혈관내피 상호작용장간막 정맥LPS 자극형광 표지Rhodamine 6G롤링 백혈구백혈구 부착혈소판 결합
마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용
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