마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용
이 논문에서
요약
초록
생체 내에 현미경 살아있는 동물에서 다른 상이한 영역에서의 프로세스와 혈관을 조사하는데 사용될 수있는 방법이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 장간막 정맥의 생체 내에 현미경을 설명합니다. 이는 생체 내에서 내피 백혈구 작용을 도시 재현 결과 단시간에 행할 수있다. 우리는 내피 세포의 LPS 도전 후 염증 설정을 설명합니다. 그러나이 모델에 하나, 세균 화학 또는 생물학적 같은 염증성 질환의 많은 다른 유형을 적용하고 약물의 관리 및 살아있는 동물에 미치는 직접 효과와 백혈구 채용에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 및 혈관 염증 반응에 미치는 영향의 다른 치료의 숫자에 성공적으로 적용되고있다. 여기서, 우리는 형광 로다 민 6G 이러한 레이블에 의해 백혈구 및 혈소판의 시각화를 설명합니다. 또한, 특정 영상은 PE 될 수 있습니다대상 형광 표지 된 분자를 사용하여 rformed.
서론
이 프로토콜의 목적은 염증 조건에서 백혈구 - 내피 백혈구 및 혈소판의 상호 작용의 직접적인 관찰을 위해 쥐를 거주 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 간략화 된 기법을 설명하기위한 것이다.
생체 내에 현미경은 염증 백혈구 모집 및 기능을 이해하는 사소한하지만 중요하지 않은 염증성 질환 1, 2에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜에서 우리가 설명하는 방법은 이전에 발행 된 출판물을 기반으로 개발되었다. 발표 된 내용에 성장 혈전 3 병렬로 혈소판 통합을 시각화 유사 이전 4 표면화 장간막 정맥은 투과광 현미경으로 검사한다. 이러한 쥐 5 마우스의 간 및 쥐 (6)의 cremaster 근육으로 내 생명 현미경의 다양한 모델이 있습니다.
장간막 정맥의 생체 내에 현미경이 개발되고 여러 그룹에 의해 이전의 연구에 적용되어왔다. - / - 누구의 혈소판 세로토닌 약리학 장기 고갈 된 쥐에 연구 결과 비 신경 세로토닌의 결핍과 비교 마우스, 우리는 야생형 마우스 및 트립토판의 hydroxylase1 (Tph1) 사이의 백혈구 모집의 차이를 ....
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프로토콜
모든 동물 실험은 독일의 동물 보호 법률 (TierSchG)을 준수 하였다. FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) 및 국가 동물 복지 몸 GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html)에 의해 정의 된 마우스는 보관과 좋은 동물 관행에 따라 처리되었다. 프라이 부르크 대학의 동물 복지위원회뿐만 아니라 지방 자치 단체 (Regierungspräsidium 프라이 부르크)는 모든 동물 실험을 승인했다.
1. 동물 취급, 준비 및 염증의 유도
- 16-20g의 무게 범위 6 주령의 수컷 마우스 - 4를 사용합니다. 참고 : 마우스는 이전 또는 무거운 경우가 현미경 관찰을 제한, 선박을 둘러싼 과도한 지방을 제시한다.
- 수술에 앞서 모든 도구와 현미경 테이블을 소독.
- 주사 20 ㎎ / ㎏ LPS (리포 폴리 사카 라이드) 복강 4 세균 inflamm을 유도하는 생활 마우스로는 현미경하기 전에 시간ATION.
- 플라스틱 챔버 및 장간막 조직 가습 37 ℃에서 수조에서 0.9 % 식염수 Prewarm.
- 바로 현미경 절차 전에 복강 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 대안 ....
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결과
이 프로토콜에 설명 된 실험 환경의 개요가도 1에 도시되어있다. 이것은 생체 내에 현미경에서 관찰 할 수 표면화 회장 루프 및 그 용기와 마우스를 보여준다.도 2 인해 미처리 동물에서 활성화의 어느 정도를 나타낸다 절차 자체. 그러나 거의 느린 압연 또는 LPS 처리 쥐에 비해 백혈구의 회사 접착이있다. 또한 야생형 마우스 중 마시는 물이나 치료 쥐 3 주 동안 플루옥세틴 처리 하였다. 그림 2A-에서 생체 내에 현미경의 다른 결과를 보여줍니다 그림 2 도 2F-H에 추가하여 마우스를 LPS로 처리하면서, LPS와 더 염증성 도전없이 결과를 표시 하였다. 회전 속도가 LPS 도전 후 감소하는 동안 여기에서 우리는, 압연 및 부착 백혈구의 높은 숫자를 볼 수 있습니다. 이 실험을 통해 우리는 혈소판의 세로토닌이 C 것을 보여줄 수염증 7 백혈구 모집의 초기.......
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토론
여기에서 우리는 준비 및 생체 내에서 쥐의 장간막 정맥의 생체 내에 현미경의 성능을 설명합니다. 이 방법은 우리에게 살아있는 유기체에 직접 백혈구가 내피 세포와 혈소판 내피 세포의 상호 작용 (11)을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다.
내피 세포를 염증 초기 반응으로 활성화됩니다 압연, 접착력과 윤회 (12)의 결과 백혈구 및 혈소판과 상호 작용한다. 그러나 백혈구는 혈소판이 소위 형성하는 상호 작용, 혈소판, 백혈구 단지, 주로 혈소판 - 호중구 단지 (PNCs) 및 혈소판 - 단핵구 단지 (PMCS) 13, 14 .These 상호 작용이 관찰이 방법으로 정량화 할 수있다.
또한이 기술은 (혈소판 / 백혈구 작용 후의 예) VCAM-1, ICAM-1과 같은 마커 내피의 활성화 (15)을 조사 허용한다.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 로다민 6G | 시그마-알드리치 | 989-38-8 | |
| 대장균의 지질다당류 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
참고문헌
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V.
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재인쇄 및 허가
