Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

요약

미세유체 소자 내에서 기능적 미세조직을 생성하려면 미세장치의 제한된 공간 차원에 전통적인 세포 배양 기술을 적용하여 세포 표현형을 안정화해야 합니다. 콜라겐의 변형은 간세포와 같은 일차 세포를 미세유체 조직 모델로 안정화할 수 있는 초박형 콜라겐 어셈블리의 층별 증착을 가능하게 합니다.

초록

미세유체역학은 세포 미세환경의 절묘한 제어를 제공하지만, 미세유체 장치 내에서 세포를 배양하는 challenging. 3D것은 콜라겐 유형 I 젤에서 세포를 배양하는 것이 세포 형태와 기능을 안정화하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 마이크로 장치에서 미세유체 조직 모델을 만드는 데 필요합니다. 조직 배양 플레이트에 대한 기존 3D 배양 기술을 미세유체 장치로 변환하는 것은 채널 치수가 제한되어 있기 때문에 어려운 경우가 많습니다. 이 방법에서는 미세유체 장치에서 배양된 세포 위에 초박형 콜라겐 어셈블리를 생성하기 위해 층별 증착과 함께 사용할 수 있는 다양이온 및 폴리음이온 콜라겐 용액을 생성하기 위해 네이티브 유형 I 콜라겐을 수정하는 기술을 설명합니다. 이러한 얇은 콜라겐 층은 1차 간세포를 예시 세포로 사용하여 볼 수 있듯이 세포 형태와 기능을 안정화하여 미세유체 장치에서 미세 조직의 장기 배양을 가능하게 합니다.

서론

미세유체역학은 세포 미세환경을 절묘하게 제어할 수 있지만 미세유체 장치 내에서 세포, 특히 일차 세포를 배양하는 것은 어려울 수 있습니다. 조직 배양 플레이트에서 배양할 때 세포 기능을 유지하고 안정화하기 위해 많은 전통적인 세포 배양 기술이 개발되었지만, 이러한 기술을 미세유체 장치로 변환하는 것은 종종 어렵습니다.

그러한 기술 중 하나는 생리학적 3D 세포 환경의 모델로서 콜라겐 겔 위에 또는 콜라겐 겔 사이에 끼워진 세포를 배양하는 것입니다. ¹ I형 콜라겐은 세포 외 기질의 편재성, 자연적인 풍부함, 강력한 세포 부착 부위 및 생체 적합성으로 인해 생체 재료 응용 분야에 가장 자주 사용되는 단백질 중 하나입니다. ² 암세포(cancer cell)^3,45, 미세혈관 내피 세포(microvascular endothelial cell)⁶, 간세포(hepatocyte)⁷ 등 많은 세포가 콜라겐을 이용한 3D 배양의 이점을 누릴 수 있습니다. 콜라겐 겔의 사용은 조직 배양 플레이트와 같은 개방형 형식에서 쉽지만, 제한된 채널 치수와 미세유체 장치의 밀폐된 특성으로 인해 전체 채널을 차단하지 않고는 겔화되는 액체를 사용할 수 없습니다.

이 문제를 극복하기 위해 우리는 층별 증착 기법⁸을 천연 콜라겐 용액의 화학적 변형과 결합하여 미세유체 장치에서 배양된 세포 위에 초박형 콜라겐 어셈블리를 생성했습니다. 이러한 층은 세포 형태를 안정화하고 콜라겐 겔과 유사한 기능을 할 수 있으며 중합 매트릭스로 채널을 차단하지 않고 미세유체 장치의 세포에 증착할 수 있습니다. 이 방법의 목표는 천연 콜라겐을 변형하여 다양이온 및 폴리음이온 콜라겐 용액을 생성하고 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 세포에 증착하여 미세유체 배양에서 세포를 안정화하는 것입니다. 이 기술은 microfluidic 장치에 있는 1 차적인 hepatocytes의 형태 그리고 기능을 안정시키기 위하여 이용되었습니다. ⁹

개

판 배양^11,12에서 간세포를 덮기 위해 천연 및 합성 고분자 전해질⁽¹⁰)로 층별 증착이 이전에 보고되었지만 미세유체 장치^13,14에서 간세포의 파종층으로 이 방법은 3D 콜라겐 배양 기술을 모방하여 간세포 위에 순수한 콜라겐 층을 증착하는 것을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 3D 콜라겐 층을 사용하여 유지할 수 있는 예시 세포로 간세포를 사용합니다. 콜라겐에서 3D 배양의 이점을 얻는 다른 많은 유형의 세포는 초박형 콜라겐 매트릭스 어셈블리의 층별 증착 후 배양으로부터 유사한 이점을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

원주민 수용성 콜라겐 솔루션 1. 준비

1. 준비 또는 내가 1-3 밀리그램 / 등 Piez 등에 의해보고 된 표준 격리 프로토콜을 사용하여 ML. ^(15)에 쥐의 꼬리에서 콜라겐 산성화, 가용성, 유형의 200 mg의 구입
2. 변성 콜라겐 용액의 목적하는 최종 부피를 기준으로 출발 물질의 양을 규모. 약 수용성 천연 콜라겐의 200 mg의에서, 3 ㎎ / ㎖에서 25 ~ 30 메틸화 ㎖의 석신 콜라겐 솔루션 25 ~ 30 ml의 각합니다.

2. 콜라겐 메틸화

1. 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액을 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
2. 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 흐린 될 해결책의 원인이 콜라겐 석출물을 관찰한다.
3. 25 분 동안 3,000 × g에서 침전 된 콜라겐 솔루션을 스핀 다운. 분명, 젤 같은 침전물은 튜브의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 대기음이 제대로 뜨는 유체 폐기하십시오.
4. 0.1 N HCl을 메탄올 200ml에 침전 된 콜라겐을 재현 탁하고, 메틸화 반응은 4 일 동안 실온에서 교반하면서 발생할 수 있도록. 콜라겐은 용해되지 않지만 솔루션은 흐린 것 아주 작은 볼 수 조각으로 깨지한다.
5. 메틸화 후, 원심 분리기 25 분간 3,000 × g에서 용액은 콜라겐 메틸화 펠렛. 대기음이와 산성화 메탄올 뜨는 폐기하십시오.
6. 반복적 피펫으로 약 3 ㎎ / ㎖의 농도를 제공 멸균 PBS 25 ㎖에 메틸화 콜라겐을 녹이고 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
7. the concentratio 평가상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 N. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
8. 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전송하여 메틸화 된 콜라겐 용액을 소독 병은 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 분리하고 저장하도록 허용 메틸화 콜라겐 상부층.
9. 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.

3. 콜라겐 Succinylation

1. 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액의 다른 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
2. 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 콜라겐은 흐린되기 위해 용액을 일으키는 석출한다.
3. SUC 40 mg의 해산(콜라겐 용액 부피의 1/20 ^번째)을 아세톤 10ml에 cinic 무수물 (콜라겐 밀리그램 당 0.4 mg)을 얻었다. 천천히 (약 0.5 ml의 단위) 지속적으로 pH를 모니터링하면서 교반 콜라겐 솔루션이 혼합물을 추가합니다. pH가 9.0에 근접함에 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 첨가하여 pH를 9.0 위를 유지한다.
4. 아세톤 숙신산 무수물 모두를 추가 한 후 120 분 동안 실온에서 계속 교반 하였다. 석신 콜라겐이 용해으로 명확하게하는 솔루션을 관찰한다. 정기적으로는 9.0 이상으로 유지하기 위해 pH를 확인합니다.
5. 1 N HCl을 20 μL 씩 증분하여 상기 용액의 pH를 4.0으로 조정한다. 석신 콜라겐 침전으로, 다시 흐린 솔루션을 관찰한다.
6. succinylation 후, 원심 분리기 25 분 3,000 × g에서 솔루션은 석신 콜라겐 펠렛합니다. 기음은 미 반응 숙신산 무수물로 산성화 뜨는 폐기하십시오.
7. 숙시 콜라겐을 녹여멸균 PBS 25 ㎖, 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 피펫 팅을 반복하여, ㎖ / 약 3의 Mg 농도를 제공하고, 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
8. 상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 농도를 평가한다. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
9. 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전사함으로써 석신 콜라겐 용액을 소독 병을 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 제거하고 저장하도록 허용 the 석신 콜라겐입니다 상단 층.
10. 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.

콜라겐 수정 4. 검증

1. 1, 기본 메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션의 각 1 ㎖의 샘플을 준비하고 진한 희석수소 이온 적정 멸균 순수 ml의 0.1 밀리그램 /의 entration. 또한 적어도 4 시간마다 10 kDa의 컷오프 membraneusing 3 솔루션의 변화를 통해 물에 대한 투석에 의해 버퍼 적어도 1000 배 희석.
2. 수산화 나트륨과 염산 소량의 7.3 용액의 pH를 조절합니다. 네이티브 메틸화 및 숙시 콜라겐 솔루션 적정 곡선을 만들 Tanford ^(16)에 의해 설명 된 바와 같이 임의의 기준으로 pH가 7.3을 사용하여, 각각의 샘플에 수소 이온 적정을 수행한다.
3. 산의 볼륨이 결합 된 H ⁺ 분자 당 이온의 수 대 추가 당 pH의 변화를 그린다. 높은 산도 "아미노"범위 중성점 향해 석신 콜라겐 시프트 (아민 기의 손실)를 표시해야하고, 낮은 pH "카르복시"범위는 메틸화 콜라겐 좌측 시프트 (카르복실기의 손실을 표시해야 ) 및 석신 콜라겐 우측 시프트 (카르복실기의 이득S), 천연 콜라겐에 비해.
4. 표준 프로토콜 ^17,18 다음, 2,4,6- 트리니트로 산 (TNBA)를 사용하여 비색법에 의해 대체 succinylation 네이티브 콜라겐 아미노기의 %를 결정함으로써 succinylation 반응의 효능을 평가한다.

미세 유체 장치 및 셀 시드 5. 제작

1. 표준 방법 ^(9)를 사용하여 미세 유체 장치를 제조. 100 ㎛, 높이 0.4 ~ 1.5 mm 폭, 세포 성장을위한 긴 채널 1~10mm로 미세 세포 배양 챔버를 만들 포토 리소그래피를 사용하여 정의 실리콘에 SU-8 마스터에서 PDMS의 복제 성형을 사용합니다.
2. 장치와 슬라이드 유리의 표면을 산화시키기 위해 플라즈마 세정기를 사용하고 본드 함께 누른다. 적어도 30 분 동안 UV 광에 노출하여 장치를 멸균 한 후, 멸균 PBS 중 50 μg의 / ml의 피브로넥틴을 가진 챔버를 채우고 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
3. 표현형 또는 분화 상태의 안정화를위한 콜라겐 젤을 필요로 같은 차 쥐 또는 인간의 간세포와 같은 세포와 장치를 시드. 우리는 장치 당 14 × 10 ⁶ 세포 / ml에 접종 갓 격리 기본 쥐의 간세포 ^7,19 또는 시판 냉동 보관 차 인간 간세포의 20 μl를 사용합니다.
4. 세포가 4-6 시간 동안 부착하고 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 성장 매체와 도금 매체를 대체 할 수 있습니다. 확산 전체 셀을 보장하고 세포의 합류 단층을 만들 O / N을 품어.

6. 레이어로 레이어 콜라겐 증착

1. 층류 조직 배양 후드에서, 각각의 디바이스 당 용액 10 애플리케이션 메틸화 및 석신 콜라겐 용액의 충분한 양뿐만 아니라 미디어의 몇 MLS 준비. 얼음에 솔루션을 유지합니다. 우리는 장치 레이어 당 콜라겐의 20 μL (10 ~ 15 배의 전체 장치 볼륨)를 사용합니다.
2. 있다메틸화 (폴리 양이온) 솔루션 ginning 후 20 메틸화의 μL와 함께 장치를 세척 대체 각 응용 프로그램 사이에 1 분을 기다리고, 콜라겐 솔루션을 숙시. 장치를 약 20 분 소요됩니다 솔루션 당 10 회, 총 플래시합니다. 세포가없는 미디어 아르 시간의 양을 최소화하기 위해 신속하게 작동한다.
3. 천천히 그 크기에 따라 입구 / 출구에 축적 콜라겐을 준수하십시오. 유체 흐름에 대한 저항성 증가가 미디어 한두번 장치를 세척 한 경우 축성을 계속한다.
4. 모든 층을 적용한 후, 새로운 미디어로 두 번 장치를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 세포 유형에 따라, 그러한 간세포의 향상된 편광 같은 세포 외 기질 - 유도 된 형태 적 변화는, 몇 시간 내에 볼 수 있어야한다.
5. 콜라겐 매트릭스의 존재를 확인하기 위해 표준 ^방법을 사용하여 ⁽⁹⁾ 투과형 전자 현미경 장치를 준비 대표배양 된 세포의 상단에 조립.

세포 표현형 및 기능 7. 안정화

1. 화상 세포 유형에 대한 표준 방법을 사용하여 세포 형태, 생존 및 극성. 간세포를 들어, 콜라겐 침착의 효과를 입증하기위한 정점 편광 위상 현미경에 대한 생존 LIVE / DEAD 염색 및 CMFDA 염료를 사용 14일 위에 이미지를 수집한다.
2. 세포 형태에 대해, 린스 PBS 20 μL의, 화상, 위상차 현미경을 사용하여 장치를 주입하기 위해 PBS 20 μL 피펫으로하여 입구를 통해 장치를 세척.
3. 라이브 / 죽은 얼룩 들어, 린스 제조업체의 지침에 따라 제조 DAPI와 라이브 / 죽은 염색 용액 20 μl를 주입하는 PBS의 20 μL에 피펫으로 입구를 통해 장치를 세척, 37 ℃에서 30 분 동안 품어, 린스 다시 디바이스 (20)의 PBS μL, 화상 형광 현미경을 사용하여 장치.
4. 담즙 날리 들어culi 염색은 제조자의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안 배양하여 제조 DAPI와 2 μM C​​MFDA 염색 용액 20 μL를, 린스 주입하는 PBS 20 μL로 피펫으로 유입구를 통해 장치를 세척하여 장치를 다시 린스 20 μL의 PBS 및 이미지 형광 현미경을 사용하여 장치.
5. 소비 된 매체를 수집하고 세포의 기능을 결정하기 위해 배양 기간 동안 적절한 시점에서 세포 대사의 제품을 측정한다. 간세포를 들어, 소비 된 배지에서 알부민 및 우레아의 양을 측정한다.
6. 이러한 평가 효소 활동 수준, 항체 염색, 또는 RNA 분석과 같은 세포 자체에 엔드 포인트 기능 분석을 수행합니다. 간세포를 들어, 유도 및 시토크롬 P450 효소 활동이나 위상 공액 II 효소 글루타티온 S 트랜스퍼를 측정한다.

결과

네이티브 콜라겐 층별 증착에 사용하기위한 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 만들 메틸화 및 succinylation를 사용하여 수정 될 수있다. Succinylation가 숙시 닐기로 네이티브 콜라겐의 ε 아미노 그룹을 수정하고 메틸화는 메틸기 (도 1a)와 네이티브 콜라겐 카르복실기를 수정한다. 콜라겐 단백질 아미노산 측쇄에 이러한 변형은 용액의 pH에​​ 대한 적정 곡선을 변경. 메틸화는 아미노기에 영향을주지 않으며 카르복실기의 수를 감소하면서 Succinylation은 네이티브 콜라겐 (도 1b)에 비해, 아미노기의 수를 감소시키고, 카르복실기의 수를 증가시킨다. 이러한 변형은 콜라겐 분자의 전하 특성을 변화. Succinylation는 양으로 대전 된 그룹을 제거하고 음전하 단체로 대체하고, 메틸화는 음으로 대전 된 그룹을 제거합니다 (그림 1C </ STRONG>).

토론

얇은 순수 콜라겐 어셈블리 변성 콜라겐의 층별 증착을 이용하여 충전 재료 또는 세포 표면 상에 증착 될 수있다. 이 연구의 결과는 메틸화 네이티브 콜라겐 succinylation 세포 (도 2) 상에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 증착하기 위해 레이어 - 바이 - 레이어 기술로 사용될 수있다 (도 1) 또는 다른 충전 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 생성 함을 입증 재료 표면. 이러한 초박막 매트릭스 층은 간세포 (도 3), 그 기능뿐만 아니라, 미세 유체 소자에 파종 후 (도 4)으로 세포의 형태, 생존율, 및 편광을 안정화시킬 수있다.

얇은 콜라겐 층의 성공적인 증, 메틸화 및 석신 콜라겐을 생성 개질 반응은 중요하다. 카르복실기 메틸화 반응은 바람직하지 않기 때문에콜라겐 메틸화 반응 르 샤 틀리에의 원리에 기초하여 순방향 반응을 이용시 산성...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리	라이프 테크놀로지	A1048301	집중 쥐 꼬리 콜라겐
콜라겐 유형 I에 대한 옵션, 쥐 꼬리	그마-알드리치	C3867-1VL	집중 쥐 꼬리 콜라겐
콜라겐 유형 I에 대한 옵션, 쥐 꼬리	EMD Millipore	08-115	옵션 집중 쥐 꼬리 콜라겐
콜라겐 유형 I, 쥐 꼬리	R % D 시스템	3440-100-01	농축 쥐 꼬리 콜라겐
숙신산 무수물	Sigma-Aldrich	239690-50G	숙시닐화 시약
무수 메탄올	Sigma-Aldrich	322415-100ML	메틸화 시약
수산화나트륨	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH 침전 시약
염산	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH 침전 시약
쥐 콜라겐 유형 I ELISA	Chondrex	6013	콜라겐 함량 검출
하이드록시프롤린 분석 키트	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	콜라겐 함량 검출 옵션
하이드록시프롤린 분석 키트	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	콜라겐 함량 검출