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방법 논문

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53098

⸱

2016년 2월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Physiology and Pathobiology, Tufts University School of Medicine

이 논문에서

요약

호르몬 작용을 연구하기에 적합한 인간 유방 상피의 3D 배양 모델을 설명합니다.

초록

유방 상피 형태 형성 과정은 호르몬의 영향을 받습니다. 2D 배양을 사용하여 유방 상피에 대한 호르몬 작용에 대한 연구는 세포 증식 및 유전자 발현 종말점으로 제한됩니다. 그러나 유기체에서 유방 형태 형성은 3D 환경에서 발생합니다. 3D 배양 시스템은 단층 세포 배양(2D)과 유기체의 복잡성 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 호르몬 작용을 연구하기에 적합한 인간 유방 상피의 3D 배양 모델을 설명합니다. 시판되는 호르몬 반응성 인간 유방 상피 세포주, T47D 및 쥐꼬리 콜라겐 유형 1을 매트릭스로 사용합니다. 이 3D 배양 모델은 주요 유방자극 호르몬인 에스트라디올, 프로게스틴 및 프로락틴에 반응합니다. 이러한 호르몬이 상피 형태 형성에 미치는 영향은 종말점에 따라 1주 또는 2주 치료 후에 관찰할 수 있습니다. 3D 배양물은 상피 형태 형성, 세포 증식 및 유전자 발현 분석을 위해 수확할 수 있습니다.

서론

표준 2D 배양과는 달리, 3 차원 세포 배양 대리 모델 생리 관련 컨텍스트 번 유사한 조직에서 상피 세포 행동 연구 허용한다. 유선의 3D 문화는 유선 개발 및 신 생물의 여러 측면을 명료하게 도왔다. 그러나, 현재 3D 배양 모델의 대부분은 작업에 사용되는 인간 상피 세포주 호르몬 수용체 발현 6,7,9 부족하기 때문에 호르몬 작용을 연구하는 것이 적합하다.

여기서, 우리는 호르몬 작용 (12) 연구에 적합 인간의 유방 상피 세포의 3 차원 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 원래 유방 침투 유관 암종 54 세의 여성 환자로부터 얻은 흉수에서 파생 된 시판 호르몬 응답 인간 유방 상피 세포주 T47D 3,11,13을 사용한다. 우리는 매트릭스 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1을 사용합니다. 이 3D 숭배URE 모델은 인간 유방 상피 세포에 대한 세 가지 mammotropic 호르몬 (에스트라 디올, promegestone (황체 호르몬의 유사체) 및 프로락틴)의 작용의 연구에 적합하다. 호르몬에 의한 상피의 형태는 형태 계측 학적 분석 (12)에 의해 시간이 지남에 따라 정량적으로 평가 될 수있다.

적절한 파종 밀도는 이러한 3D 문화 2 주 동안 유지 될 수 있습니다. 현재까지 구조물의 발달은 상피 형태에서 호르몬 작용 강력한 정량 평가 충분하다. 겔은 세포 증식에​​ 대해 이전 시점에서 수확 될 수 있고, 유전자 발현 분석. 또한,이 모델은 순차 호르몬 치료의 효과를 시험하기에 적합하다; 예를 들어, 다음 주 중에 호르몬의 다른 호르몬 / 조합으로 첫 주 동안 에스트라 디올 치료 및 교체 후. 예컨대 ICI 182,780 같은 항 에스트로겐 화합물 및 에스트로겐의 효과도 STU 수이 3D 문화 모델 (12)를 사용하여 죽었다.

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프로토콜

시약 1. 준비

  1. 10-3 M의 재고 솔루션을 만들 수있는 합성 progestagen의 promegestone (R5020) 및 에탄올 17-β-에스트라 디올 (E2)를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖ 모액을 증류하여 탈 이온수 프로락틴을 녹인다. 10 -2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 DMSO에 항 에스트로겐 ICI 182,780을 녹인다. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다.
  2. 숯불 덱스 트란 (CD)의 혈청 및 CDFBS 매체를 제거 :
    1. 30 분 동안 57 ° C의 물 중탕에 소 태아 혈청 (FBS)을 열 - 불 활성화.
      참고 : 사용이 프로토콜의 나머지 부분에 대해서만 산 세척 유리합니다.
    2. 필요한 숯의 양을 계산한다. 상기 활성탄에 의한 변위를 보상 5 % 중량 / 부피의은 분말 활성탄 무게 혈청 량보다 10 % 더 많은 양을 사용.
    3. 혈청 양과 동일한 양을 사용하여 차가운 탈 증류수로 두 번 세척 숯. 각 세척 C에 대한숯 펠렛 2 분 50 XG에 entrifuge. 세척 사이에 물을 제거합니다. 마지막 숯 펠렛 0.5 % 중량 / 부피의 덱스 트란 T-70을 추가합니다. 5 분 100 XG에 증류수, 탈 이온수와 원심 분리기에 다시 일시 중지합니다. 물을 대기음.
    4. 펠렛에 혈청의 적절한 볼륨을 추가하고 혈청에 숯 덱스 트란 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 60 분 37 ºC에서, (6 RPM) 압연 동안 품어. 20 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 상층 액이 흐린 나타나는 경우, 원심 분리를 반복; 그러나, 혈청은 현재 완전히 명확하지 않을 수 있지만, 여과시 삭제됩니다.
    5. 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 0.45 미크론 필터를 통해 다시 0.80 미크론 필터를 통해 여과하고. 마지막으로, 0.20 미크론 필터로 멸균 필터. 스토어는 -20 ºC에서 유리 튜브 또는 T-25 배양 플라스크에 CDFBS 필터링.
    6. 숯 덱스 트란은 태아 미디어 (CDFBS 미디어) 소 함유 박탈 : 페놀 레드가없는 DMEM의 375 ml의 DMEM의 125 ㎖의 혼합/ F-12. 37.5 ml의를 제거하고 숯 덱스 트란 박탈 소 태아 혈청의 동일한 볼륨으로 교체. 2 mM의 최종 농도 106 U / ㎖ 페니실린 및 L- 글루타민을 추가합니다. 그 결과 매체는 75 % DMEM, 25 % DMEM / F-12, 7.5 %의 숯불 덱스 트란 제거-FBS, 2mM의 L 글루타민, 10 (6) U / ㎖ 페니실린이다.
  3. 10X PBS, 1N의 NaOH와 증류수 탈 이온수를 준비합니다. 필요한 콜라겐 용액의 부피에 따라 각각의 충분한 양을 준비한다. 필터링 모든 솔루션을 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 10 배 PBS와 멸균 증류수 탈 이온수를 저장합니다. 1N NaOH 용액을 보관하지 마십시오.
  4. 제조업체에서 제공하는 "콜라겐 I, 쥐 꼬리의 대체 겔화 절차"에 대한 프로토콜에 따라 1 ㎎ / ㎖ 최종 농도 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 각 겔 콜라겐 용액 1.5 ㎖로한다. 예를 들어, 제조 콜라겐 용액 (피펫 동안 손실을 고려하여 0.5 mL)을 18.5 mL의 제조12 젤. 바로 콜라겐 솔루션을 사용하거나 최대 2 ~ 3 시간 동안 얼음에 개최.
  5. 카마 졸업생 염료 :
    1. 증류수 500 ㎖에 1g 카민 2.5 g 알루미늄 칼륨 설페이트 결합. 20 분 동안 교반하는 동안 끓인다. 이상 끓는 않도록주의하세요. 추가 증류수로 다시 500 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다.
    2. 항균 활성에 대한 티몰의 결정을 추가하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 병을 커버합니다. 각 사용하기 전에 실험실 등급의 종이 필터를 통해 필터링합니다. 최대 3 개월 카민 용액을 다시 사용합니다. 실온에서 저장, 빛으로부터 보호.
  6. 콜라게나 제 용액 / V w 0.125 %의 농도로 DMEM / F12 배지에서 콜라겐을 분해. 이 솔루션을 보관하지 마십시오.

쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1 젤과 호르몬 치료 2. 3D 문화 T47D의 세포

참고 : 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지합니다.

  1. 처리장단일 세포 현탁액을 Re 및 세포 수를 수행한다. 분할 T47D 세포 배양은 70 %의 합류에 도달하기 전에. 필요한 셀의 양을 포함하는 양을 원심 분리기. 한 젤은 약 75,000 T47D 세포를 포함하는 것을 고려하십시오.
  2. 초기 피펫을 사용하여 콜라겐의 적절한 부피 세포 펠렛을 다시 일시. 각 겔은 콜라겐의 1.5 ml의로 구성되어 있음을 고려한다. 거품을 도입 피하기 위해 조심스럽게 세포와 콜라겐을 섞는다.
  3. 세포의 분포에 정전기의 영향을 방지 판을 풀기 후 정전기 감소 브러시​​로 12 웰 플레이트의 경계, 상단과 하단 브러시합니다. 후드의 작업 표면과 접촉시 정전기의 발생을 방지하기 위해, 또한 정전기 감소 brush.Gently로 닦았 된 다른 12 웰 플레이트 (빈 접시)의 상단에이 판을 배치 믹스의 1.5 ml에 부어 12 웰 플레이트의 각 웰에.
  4. 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 일을 제거전자 인큐베이터에서 플레이트와 후드에 다시 배치합니다.
  5. P200 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 잘 국경에서 부드럽게 원을 그리 젤을 분리합니다. 겔은 웰의 바닥으로부터 분리한다.
  6. CDFBS 배지에서 희석 호르몬 웰에 첨가한다. 10 -7 M 최종 농도에서 10 -10 M 최종 농도와 프로락틴에서 E2 및 R5020을 사용합니다. 대조군으로 추가 호르몬하지만 여전히 사용되는 호르몬 주식과 동일한 DMSO의 높은 볼륨을 포함하지 않고 CDFBS 미디어를 사용합니다. 각 잘 미디어 1.5 ml에 포함되어 있는지 확인합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 100 % 내부의 3D 문화를 배치 습도 조직 문화 인큐베이터. 2 일마다 미디어를 변경, 1 ~ 2 주 동안 문화를 유지한다.

전체 마운트 3. 젤 처리

  1. 문화 미디어를 제거하고 각 웰에 PBS 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
  2. 슬라이드에 젤을 전송합니다. 곡선을 사용하여 반 겔을 잘라D 수술 블레이드. 절반으로 처리를 계속 조직 학적 분석을 위해 나머지 절반을 저장합니다.
  3. 전체 슬라이드에 마운트의 절반 젤을 전송합니다. 5 분 동안 젤 건조하자 다음 10 % 포르말린을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다.
    참고 : 모든 배양은 실온에서 수행해야합니다.
  4. 통 O의 /의 N에 코 플린 항아리에 젤을 수정합니다.
  5. 세척 통에 10 분마다 두 번 PBS와 슬라이드. 전송은 70 %의 EtOH에 슬라이드; 통에 1 시간 동안 품어. 카마 졸업생 O / N로 전송 슬라이드.
  6. 다음 날, 1 시간마다 70 % EtOH로 95 % EtOH로 100 %의 EtOH에 통에 슬라이드를 탈수. 이전 두 번 1 시간마다 자일 렌 통에 유지하는 슬라이드. 젤 1.5 mm 두께 된 커버를 탑재 톨루엔 기반 장착 매체를 사용합니다.
  7. 일반 빛 (현미경 입체경)에서 전체 마운트를 검사합니다. 형상 및 루멘의 자세한 분석을 위해 공 초점 현미경을 사용하여 633 nm의 오펜 레이저와 카민 염료를 시각화.

조직학 분석 처리 4. 젤 처리

  1. 10 % 포르말린을 함유하는 20 mL 유리 바이알에 겔의 나머지 절반을 전송하고 진탕 O / N에 고정한다.
  2. 통에 10 분마다 PBS로 두 번 젤을 씻으십시오. 파라핀 삽입에 대한 처리 카세트에 배치 젤.
  3. 70 %의 EtOH로 전송 겔은, 1 시간 동안 배양하고 1 시간 동안 95 % EtOH로 다음 1 시간 동안 신선한 95 % EtOH로 변경, 100 %의 EtOH를 1 시간, 1 시간 동안 신선한 100 %의 EtOH로 변경합니다. 1 시간 동안 신선한 크실렌 다시 이때 겔은 실온에서 100 % EtOH로 O / N에 저장 될 수 있거나, 1 시간 동안 배양하고, 크실렌.
  4. 전사 카세트 회 이상 신선한 파라핀 반복 진공 배양기에서 60 ℃에서 1 시간 동안 파라핀.
  5. 깨끗한 파라핀 플라스틱 금형을 입력합니다. 카세트를 열고 젤을 제거하고 플라스틱 금형 포함 된 파라핀에 넣습니다. 파라핀과 함께 작성하고 상단에 라벨을 포함하는 카세트의 상단을 추가하고 블록이 식지.
  6. 비접촉식를 제거IC에서 금형 및 섹션 마이크로톰을 사용하여 블록. 그는 염색 및 면역 세포 5 음 두꺼운 부분을 얻습니다.

콜라게나 치료를 사용하여 젤의 세포에서 세포의 5. 추출

  1. 웰에서 겔을 제거하고 PBS를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다. 린스 젤 잠시.
  2. 0.125 % 콜라게나 제 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 겔을 전송. 작은 조각으로 젤을 파괴하기 위해 최대 피펫 아래로 4-5 시간.
  3. 25 분 동안 37 ° C에서 품어 (겔 용해 세포 현탁액에 때까지)
  4. 혈청 보충 배지 2 ㎖를 추가합니다. 원심 분리 (1,000 XG, 5 분), 폐기 뜨는하여 세포를 수집, 세포를 다시 일시 중지하고 계산합니다.

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결과

도 1은 호르몬 성 3 차원 배양 물을 제조하는 절차를 요약 한 것이다. 상피 구조 단독 E2의 존재하에 2 주 동안 배양 및 다른 호르몬과 조합하여 겔 마운트 전체에서 관찰된다. 어떤 호르몬은 배양 배지 (CDFBS 매체) (그림 2)에 추가되지 않은 경우에만 단일 세포 또는 2-3 셀 그룹이 존재한다. 이 상태는 음성 대조군으로 작용한다.

모양, 크기, 루멘 존재 다를 3D 문화 양식 구조에서 셀. 겔 구조의 분포는 일반적으로 불균일하다. 이전에 나타낸 바와 같이, 중앙 4에서 볼보다 겔의 경계를 따라 일반적으로보다 구조가있다. 이 때문에 공간 이질의, 표본 간의 비교는 샘플에 걸쳐 지역 대응으로 제한되어야한다.

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토론

여기에서는 유방 상피에 대한 호르몬의 작용을 테스트하기 위해 호르몬 민감성 3D 배양 모델을 설명합니다. 호르몬에 대한 반응은 조직 형태, 세포 증식 및 유전자 발현 수준에서 평가할 수 있습니다 12. 이 기술의 한 가지 한계는 배양이 플라스틱 바닥판에서 성장하기 때문에 배양 기간 동안의 시각화가 광학 현미경으로 제한된다는 것입니다. 3D 배양 시스템은 배양 1의 라이브 이미징을 허용하기 위해 유리 바닥판에 적용될 수 있습니다.

세포가 유지되는 방식은 호르몬 반응성 표현형의 유지에 중요한 것으로 보입니다. 이러한 세포에서 E2 반응성을 자주 확인하는 것이 중요합니다. 새 바이알을 해동한 후 네 번째 계대에서 E2 용량-반응 곡선을 수행하고, 그 이후에는 10회 계대마다 일상적으로 수행하는 것이 좋습니다. 10 -10 M의 E2 농도는 1주 동안 CDFBS 배지에서 성장한 것과 비교할 때 일반적으로 2D 배양에서 3배, 3...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 크게 셰릴 Schaeberle에 의해 편집 기여를 주셔서 감사합니다. 이 연구는 에이 보조금 # 02-2009-093과 02-2011-095, 및 AMS에 NIEHS / NIH ES 08314에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 환경 보건 과학 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12웰 조직 배양 플레이트(매)Fisher Scientific08-772-29
15ml 폴리스티렌 원뿔형 튜브Fisher Scientific14-959-49D
활성탄시그마C-5510
카민 명반시그마C1022-100G
콜라겐 분해 효소, 유형 3WorthingtonS0C11784
HeNe633nm 레이저
Dextran T-70Abersham/Pharmacia17-0280-01
DMEM/F-12, HEPES, 페놀 레드 없음 Life Technologies11339-021호르몬 사용을 위한 페놀 레드 프리 미디어
DMEM, 저포도당, 피루브산, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음Life Technologies11054-020호르몬 사용을 위한 페놀 레드 프리 미디어
17-β-EstradiolEMD Millipore3301에탄올에 용해
탄올KoptecV1001
소 태아 혈청HycloneSH30070.03호르몬과 함께 사용하려면 숯 덱스트란을 제거해야 합니다 
필터 (115 ml)Nalgene380-0080, 245-0045, 120-00200.88, 0.45, 0.20 micron, 각각 
포르말린, 10%Fisher ScientificSF93-20
L-글루타민 (200 mM)Life Technologies25030-081
ICI 182,780 (풀베스트런트)Sigma AldrichI4409-25MGDMSO 마이크로톰에 용해됨
 LeicaRM2155
조직 포매 매체McCormick Scientific39502004
페니실린시그마7794-10MU증류수 10ml에 용해
PermountFisher ScientificSP15-500
인산염 완충 식염수 pH 7.4Sigma AldrichP3813-10PAK
프로락틴시그마 AldrichL4021-50UG증류수 탈이온수에 용해
PromegestonePerkin ElmerNLP004005MG에탄올
랫테일 콜라겐에 용해됨 코닝 354236로트는 다양한 농도를 포함할 수 있으니, 주의하십시오
ScalpelMiltex4311
반밀폐형 벤치탑 티슈 프로세서LeicaTP1020
수산화나트륨시그마 AldrichS58811N NaOH 재고 준비
StaticMaster 안티스태틱 브러시 AmstatC3500
스트라이프 혈청학 피펫 코닝 4101
T-25 플라스크Corning 
조직 카세트Fisher Scientific15-200-403E
Wheaton Vials, 유리, 20 mlFisher Scientific03-341-25D 
자일렌 폭스바겐95057-822
에. 430168

참고문헌

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  5. Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
  6. Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
  7. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
  8. Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
  9. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
  10. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
  11. Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
  12. Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
  13. Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).

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