방법 논문

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

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DOI:

10.3791/53100

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2015년 9월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

이 논문에서

요약

우리의 목표는 설계, 제조 및 내피 세포 캡처를위한 강자성 스텐트를 테스트했다. 열 스텐트 파괴에 대해 시험하고, 10 이상이 유지 자성 스텐트에 대해 시험 하였다. 마지막으로, 10 스텐트는 시험관 시험하고 8 개의 스텐트는 세포 캡처 및 보존을 보여 4 돼지에 이식했다.

초록

심혈관 스텐트에 내피 세포가 급속 스텐트 혈전증을 감소시키고 출혈 위험을 줄일 수있는 항 혈소판 요법을 피하기 위해 필요하다. 초 상자성 산화철 나노 입자 (SPION)로 표지 내피 세포 생장 (EOC)를 캡쳐하고 유지하기 위해 자력을 이용의 가능성은 이미 밝혀졌다. 그러나이 기술은 빠른에 내피 증명 시험관 내 및 생체 내 시험 하였다 자기 및 생체 물질로부터 기계적 작용 성 스텐트의 개발이 필요하다. 우리는 컴퓨터 이용 설계 (CAD)를 이용하여 2,205 듀플렉스 스테인레스 약하게 강자성 스텐트를 개발하고 설계는 또한 유한 요소 해석 (FEA)을 사용하여 정제 하였다. 스텐트의 최종 설계는 기계적 권축과 팽창시에 재료의 파단 한계 이하 주 변형률을 나타냈다. 백 스텐트를 제작하고, 그 중 일부는 기계적 시험, RET에 사용 된ained 자기장 측정 시험관 세포 캡처 연구 및 생체 내 주입 연구. 텐 스텐트은 실패없이 사이클을 압착 및 확장 입었 있는지 확인하기 위해 배포를 테스트 하였다. 다른 스텐트 (10)는 강한 네오디뮴 자석을 이용하고, 그들의 자화 유지 자기장을 측정 하였다. 스텐트는 유지 자기가 우리의 시험관 연구에서 SPION 표지 EOC를 캡처하기에 충분한 것으로 나타났다. SPION 표지 EOC 캡처 및 보유 1 자화 스텐트 4 돼지의 각 1 비 자화 제어 스텐트를 주입하여 큰 동물 모델에서 확인되었다. 스텐트 동맥 7 일 이후 외식 및 조직 학적으로 분석 하였다. 본 연구에서 개발 된 약하게 자기 스텐트 유치와 빠른 치유를 촉진 할 수 SPION 표지 내피 세포를 보유 할 수 있었다.

서론

스테인리스스틸, 코발트 크롬, 백금 크롬과 같은 혈전성 물질로 제조된 혈관 스텐트(베어 메탈 스텐트(BMS) 및 약물 방출 스텐트(DES))를 이식받은 환자는 혈전 형성을 방지하기 위해 항혈소판 요법이 필요합니다. 진동자극(BMS)은 빠르게 치유되지만 불완전한 치유로 인해 말기 재협착의 영향을 받습니다. DES는 치유가 지연되어 장기적인 항혈소판 요법이 필요합니다. 치유가 불완전하거나 지연되어 혈전증이 생기는 것을 피하기 위해 항혈소판제는 출혈 위험을 증가시키고 특정 환자에게는 적합하지 않을 수 있다1,2. 이상적인 스텐트는 완전하고 빠르게 치유되므로 장기적인 항혈소판 요법과 말기 재협착을 피할 수 있습니다. 이러한 완전한 치유는 이식 후 스텐트가 내피 세포의 단층으로 빠르게 코팅되는 경우에만 달성할 수 있습니다. 금 또는 기타 생체 고분자와 같은 생체 적합성 물질로 스텐트를 코팅하면 혈전 저항성이 향상되는 것으로 나타났지만, 이러한 기술 중 어느 것도 내피 세포로 코팅하여 가능한 이상적인 혈액 호환성을 달성하지 못했습니다3,4.

스텐트는 순환하는 전구 세포를 끌어당겨 이식 후 내피 세포로 코팅할 수 있습니다. 이 자체 파종 기술은 리간드와 항체를 활용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 순환하는 내피 전구 세포의 수가 적기 때문에 제한됩니다. 유망한 전략은 짧은 기간의 혈류 폐색 동안 이식 직후 스텐트에 세포를 직접 전달하는 것입니다3,5. 이 전략에는 세포를 빠르게 포획하여 혈류를 회복한 후에도 스텐트에 세포를 유지하는 기술이 필요합니다. 우리는 자기 스텐트를 사용하여 이식 후 전달된 자기 표지된 내피 세포를 끌어당기고 유지하는 기술을 개발했습니다. 이를 위해서는 자기적으로 표지된 내피 세포를 포착하고 유지할 수 있는 충분한 자기 특성을 가진 기능적 BMS가 필요합니다6.

이 백서에서는 2205 스테인리스강 스텐트를 설계, 제조 및 테스트하는 방법에 대해 설명합니다. 스텐트는 CAD와 FEA를 사용하여 설계되었습니다. 제조된 스텐트는 네오디뮴 자석을 사용하여 자화되었으며 잔류 자기장은 자기 저항 마이크로센서 프로브를 사용하여 측정되었습니다. 그런 다음 체외 실험 중에 배양 접시에서 자기 표지된 세포 포획을 위해 스텐트를 테스트했습니다. 마지막으로, 스텐트는 4마리의 돼지에 자기 및 비자성 스텐트를 이식하고 스텐트 동맥을 조직학적으로 분석하여 생체 내에서 테스트되었습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 메이요 클리닉에서 기관 동물 관리 및 이용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

2205 스테인레스 스틸 스텐트 1. 설계 및 분석

  1. CAD를 사용하여 베어 메탈 스텐트 설계
    1. 스텐트 스트럿 두께와 같은 벽 두께와 '돌출 보스 /베이스'기능을 선택하여 압출 중공 실린더를 확인합니다.
    2. 압출 실린더 접선 다른 스케치 평면에 스텐트 패턴을 디자인합니다. 압출 중공 원통의 원주에 일치하도록 평면 패턴의 폭을 만든다.
    3. 랩 기능을 사용하여 중공 실린더에 플랫 패턴 디자인을 전송합니다.
    4. 네이티브 형식으로도 FEA에 대한 수출 될 ACIS 형식으로 파트를 저장합니다.
  2. 스텐트 모델의 유한 요소 해석
    1. 더 분​​석가에 대한 유한 요소 해석 소프트웨어의 일부 모듈에 ACIS 형식으로 저장 솔리드 형상을 가져 오기이다.
    2. FEA 소프트웨어의 일부 모델러의 스텐트에 동축 2 분석 실린더 모델입니다. 외측 실린더는 크림 퍼 시뮬레이션 스텐트의 직경보다 큰 직경을 갖는 초기 및 내측 실린더는 인플레이션 풍선을 시뮬레이트하도록 1mm의 초기 직경을 갖는다.
    3. 위를 조립하는 어셈블리 모델러의 '인스턴스'트리 항목을 더블 클릭 상대 위치에 부품을 말했다.
    4. 감소 통합 20 노드 육면체 요소로서 요소 유형을 지정 FEA 소프트웨어 메쉬 모듈을 사용하여 소자의 크기를 지정하고, 상기 스텐트 메쉬.
    5. 스텐트 및 모델 트리의 '상호 작용의 특성'에 각각 두 개의 실린더 사이의 마찰 강성 접촉 쌍을 지정합니다.
    6. 스텐트 모델로 2205 스테인레스 스틸의 탄소 성 응력 - 변형 동작을 지정합니다.
    7. 우선 C 시뮬레이션 1mm로 외통 압착하는 경계 조건을 정의스텐트의 rimping. 압착 스텐트의 휴식을 시뮬레이션하기 위해 외부 실린더를 제거합니다. 확장을 시뮬레이션 3mm로 내부 실린더를 확장하고 마지막으로, 스텐트의 반동을 시뮬레이션 할 수있는 내부 실린더를 제거합니다.
    8. '분석'모델 트리 항목에 할당 된 프로세서와 RAM의 양의 수를 포함한 시뮬레이션 매개 변수를 정의하고 시뮬레이션을 실행합니다.
    9. 시뮬레이션이 완료되면, 주 균주를 연구 결과 결과 파일 (filename.odb) 및 후 처리를 열고 반복적 재료의 파괴​​ 한도보다 작은 20 %의 주요 스트레인을 달성하기 위해 스텐트 디자인을 향상 .

압착 및 확장 2. 스텐트 제조 및 테스트

  1. 스텐트 제조
    1. 이러한 개척자의 액션 정밀 제품으로 정밀 가공 회사에서 총 시추 및 정밀 연삭 바 원재료로 2205 스테인레스 스틸 튜브를 확보,OH.
    2. 레이저 절단 및 전해에 대해 같은 워키 건, 일리노이 Laserage 기술 공사로 스텐트 절단 회사에 정밀 연마 튜브 및 플랫 패턴 스텐트 디자인을 전송합니다.
    3. 또 다른 10 분 동안베이스 (10 %의 NaHCO3) 다음에 10 분 동안 강산 (50 % 염산)에 의해 그들을 담근다 전해 스텐트의 표면을 패시베이션. 주의 : 적절한 보호 장비와 흄 후드에서 화학 물질을 처리합니다. 마지막으로, 에틸 알코올 및 탈 이온수로 스텐트를 씻는다. 이 프로세스는 산세 불린다.
  2. 압착 및 확장을위한 제조 된 스텐트의 시험
    1. 도구를 압착 개최 손을 사용하여 3 중 풍선에 스텐트를 압착. 스텐트와 압착 공구의 3 중 풍선을 잡으십시오. 방사상으로 풍선에 압착 할 수있는 스텐트를 변형 핸들을 누릅니다.
    2. 균일 압착에 대한 현미경에 의한 구조의 실패의 흔적을 사용하여 압착 스텐트를 검사소성 변형.
    3. 물 3 중 풍선을 가압하여 3mm의 설계 직경을 확장합니다. 미세 골절 균일 확장을위한 확장 된 스텐트를 검사합니다.

잉여금 자기장에 대한 스텐트 3. 특성

주 : 2 인치 직경 1 인치의 높이의 원통 자석을이 연구에 사용 하였다. 자석의 극 축을 따라 정렬됩니다. 자석의 표면 자속 밀도는 약 1 T.

  1. 강한 네오디뮴 자석을 사용하여 직경 방향 또는 축 방향으로 자화 된 스텐트. 자화 약 1 분 동안 강한 자석에 가까운 스텐트를 잡습니다.
  2. 직경 자기 또는 축 방향으로 자화 자기장 라인을 따라 축과 원통면 옆에 스텐트를 보유 할 자력선을 따라 직경이 평탄면 중 하나에 상기 스텐트를 잡아. 잉여금 자기 한 느낌스텐트의 D는 적어도 24 시간 동안 안정하지만, 자화 후 가능한 빨리 스텐트를 사용하는 것으로 확인되었다.
  3. 유리 맨드릴 상에 개별적으로 스텐트를 장착 한 다음 자기 프로빙 조명기의 정밀 척에 유리 맨드릴 마운트. 자성 마이크로 센서 프로브 정확하게 XYZ가 자기 프로빙 어셈블리의 조명기를 사용하여 스테이지면 (도 4)를 만지지 않고 스텐트 부근에 위치 될 수있다.
  4. 멀리 스텐트에서 자성 마이크로 센서의 기준선 판독을 측정하고 자기 프로빙 조명기의 XYZ 스테이지를 사용하여 프로브를 위치시킴으로써 상기 스텐트의 표면에 잔류 자기장을 측정한다.

4. 자기 세포 캡처 연구

  1. 얻기 세포, 형광 염료와 SPION 및 염색 라벨
    1. 5,7에 기재된 돼지의 말초 혈액으로부터 내피 세포 생장 (EOC)를 도출. unti했다 T-75 플라스크 문화L 약 80 %의 합류 (5 × 6 6 8X10에 세포).
    2. 10 nm의 직경 마그네타이트 FE (3 O 4) 8,9에 기재된 바와 같이 50 nm 두께의 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 쉘에 의해 둘러싸인 코어로서 SPIONs 합성.
    3. O 37 ℃에서 16 시간 동안 세포 배양 배지의 200 μg / ml의 농도로 유도 SPION EOC 부화
    4. 부드럽게 세포 배양 배지를 흡인. 부드럽게 플라스크에 인산 완충 식염수 (PBS) 10 ㎖를 첨가 요동하고 PBS를 흡입하여 세포를 세척한다.
    5. 실험 중 시각화 형광 염료 (CM-DII)와 세포를 얼룩. 이는 5 μL / ㎖의 농도로 세포 배양 배지 10 ㎖에 염료를 첨가하여 37 ℃에서 30 분 동안 세포와 함께 배양하여 제조사의 지침에 따라 수행된다.
    6. 단계 4.1.4에서와 같이 PBS로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 용액 3 ㎖로 배양플라스크에서 세포를 올립니다.
    7. 5 분 세포 펠렛을 형성하기 위해 500 XG에 PBS로, 15ml의 원뿔형 튜브에 가기를 세포 현탁액을 전송하고, 원심 분리기.
    8. 1-2x10 106 세포 / ml의 농도로 PBS에 세포 펠렛을 다시 중지하고 수회와 원추형 튜브의 피펫 팅하여 잘 혼합한다.
  2. 체외 세포 연구
    1. 설계 및 제작합니다 (예를 들어, 3D 인쇄) 단지 유리 커버 슬립의 표면 위의 스텐트를 유지하는 간단한기구.
    2. 전자기 자기야을 이용한 스텐트 탈자 또는 강한 네오디뮴 자석을 사용하여 직경 방향 또는 축 방향으로 자화 스텐트.
    3. 축 방향으로 자화 된 직경 자기 또는 비 착자 제어 스텐트를 포함하는 접시로 PBS에 현탁 SPION 라벨링 EOC 피펫. 이미지 반전 형광 현미경을 사용하여 즉시 형광을 위해 PBS에 현탁 EOC와 스텐트.
5. 인 - 생체 내 동물 연구

  1. 스텐트 시술
    1. 4 건강한 요크셔 돼지에서 말초 혈액을 그립니다 - 5,7에 설명 된대로 삼주 전에 각각 주입 스텐트 문화 EOC하기 - 약 50 kg의 무게.
    2. (매일 아스피린 325 밀리그램과 클로피도그렐 75 mg)을 수술 3 일전부터 항 혈소판 약물을 관리합니다.
    3. 스텐트 시술 당일, 근육 Telazol, 크 실라와 아트로핀과 돼지를 마취 (5 / 2-3 / 0.05 밀리그램 / 각각 ㎏) 해당 기관의 동물 관리 및 사용 지침에 명시된대로.
    4. 삽관 및 1-2.5 % 아이소 플루 란 마취의 흡입에 돼지를 놓습니다.
    5. 돼지의 복부 목 영역을 면도하고 일반 멸균 조건의 절차를 실시하고 있습니다.
    6. 임플란트 (1) 및 기준 자화 심장 도관 기술을 이용하여 우측 관상 동맥 (RCA)에 1 비자 성 스텐트.
      1. Cathete동물의 rization은 훈련 중재 심장 전문의에 의해 수행되어야한다. 9 프랑스어 칼집과 오른쪽 경동맥에 액세스 할 수 있습니다.
      2. 목표 관상 동맥 Cannulate 및 투시 화상을 얻기 위해 요오드화 조영제를 주입.
      3. 동맥에서 0.014 인치 표준 관상 동맥 가이드 와이어를 놓습니다. 풍선을 사전이 가이드 와이어를 이용하여 스텐트 3-3.5 mm 직경의 혈관에 스텐트를 배포합니다.
    7. 와이어 풍선 위에를 사용하여 이식 된 스텐트에 대한 RCA 근위 내의 혈류를 폐색하고 2 분 동안 중심 카테터를 통해 PBS 4 mL에 현탁 SPION 표지 약 2 × 6자가 EOC을 제공한다.
    8. 추가 폐색의 2 분 후 RCA 혈액의 흐름을 복원합니다.
    9. 회복실에 동물을 전송하고이 의식을 회복 할 때까지 밀접하게 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
    10. 항 혈소판 약물을 투여 계속 (아스피린 325 밀리그램과 클로피도그렐 75mg)을 희생 할 때까지 작동 가능 게시합니다.
  2. 스텐트 이식편 및 조직학
    1. 이전에 설명한 바와 같이 첫 번째 동물을 마취하여 동물에게 수술 후 7 일 안락사 후 정맥 적용 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 나트륨 펜 토바 비탈 (100 ㎎ / ㎏)의 치사량을 관리 할 수​​ 있습니다.
    2. 수술 스텐트 동맥 세그먼트를 수확. 30 분 이상 동안 10 % 포르말린 버퍼 외식 동맥 수정. 또한 조직 학적 분석을 위해 포르말린 버퍼에 샘플을 남겨주세요.
    3. 금속 스텐​​트 조직학을 수행 할 수있는 설비에 고정 된 샘플을 아웃소싱. 이 처리 중에, 샘플은, 메틸에 포함되는 횡단 및 철 입자 러시안 블루 염색으로 염색 된 Mallory의 기법을 사용하여 조직 학적 분석.

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결과

FEA (도 1)에 기초하여 반복적 스텐트 디자인은 압착 및 30 %의 궁극적 인 스트레인 미만 20 %의 주요 균주 스텐트 확장 할 수 있었다. 압착 및 확장 테스트 (그림 2) 골절의 징후를 보이지 않았다. 변형 된 스텐트의 사진은 FEA 계산 변형와 잘 일치를 보였다 또한 현미경 사진은 골절을 (그림 3)가 없었다. 유지 자기장 측정 (그림 4 및 5)에서 예상대로, SPION 표지 세포는 우선적으로 축 방향으로 자화 스텐트에 구부러진 부분에 매력을보다 균일 한 직경 자기 스텐트 (그림 6)에서 직선 세그먼트에 매료되었다. 조직학 이미지는 칠일 주입 기간 (그림 7) 동안 스텐트에 EOC 유치 및 유지를 증명하는 스텐트 스트럿 근처 철 염색을 보여 주었다.

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토론

우리는 베어 메탈 스텐트의 기능을 할 수 있으며 SPION 표지 내피 세포를 유치 할 수있는 자기 스텐트를 개발했다. 자기 스텐트와 관련된 이전 연구에서 연구팀은 (는) 강자성 스텐트 5,10-14의 불가능에 자성 재료로 만든 니켈 코팅 된 상업 스텐트 및 코일 또는 메쉬를 사용했습니다. 다른 그룹은 나노 입자로드 내피 세포 3을 대상으로 시판 304 등급의 스테인레스 스틸 스텐트의 상자성 특성을 사용했다. 스텐트를받는 환자 및 상자성 스텐트 유치 및 자성 나노 입자를 유지하도록 3,5- 외부 자장을 필요에 니켈 코팅은 극성 일 수있다. 따라서, 설계 및 기능 강자성 스텐트를 개발하는 것은 셀 배달 어플리케이션뿐만 아니라 다른 임상 적용 10,15-20 중요하다. 2,205 스테인리스 - - 본 연구를 위해 선택된 재료의 양면 특성상 w를 만든다강자성 eakly. 예컨대 316L 스테인레스 (70 %) 6,21,22

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman 및 Dr. Peter J. Psaltis, MBBS, PhD의 귀중한 기여에 감사드립니다. 이 연구는 유럽지역개발기금(European Regional Development Fund, FNUSA-ICRC)의 재정 지원을 받았다(No. CZ.1.05/1.100/02.0123), 미국심장협회 과학자 개발 보조금(AHA #06-35185N), 미국 국립보건원(T32HL007111) 및 그레인저 혁신 기금 – 그레인저 재단.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2205 스테인레스 스틸Carpenter Technology Corporation라운드 바 스톡 재료
AbaqusDassault 시스템소프트웨어
아트로핀처방약.
클로피도그렐상업명: Plavix. 처방약.
CM-DiILife TechnologiesV-22888분자 프로브, Eugene, OR
내피 성장 매체-2LonzaCC-3162
휴대용 압착 도구Blockwise engineeringM1-RMC
염산(HCl)Sigma AldrichMFCD00011324주의: 보호 장비를 착용하고 흄 후드
Isoflurane 마취Piramal Critical Care, Inc. 
에틸 알코올시그마 AldrichMFCD00003568
NdFeB 자석 2 "Dia x 1"두께놀라운 자석D1000P축 방향 자화 디스크 자석 평면면에 극이 있음
Over-The-Wire 삼중 풍선상업적으로 이용 가능한 모든 OTW 삼중 풍선을 사용할 수 있습니다
인산염 완충 식염수Life Technologies10010-023일반적으로 PBS
소듐 바이카보네이트 (NaHCO3)시그마 알드리치MFCD00003528
소듐 펜토바르비탈Zoetis. 상업적인 이름: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  허가된 수의사만 주문할 수 있는 규제 물질
SolidWorksDassault 시스템소프트웨어
SpinTJ-020 마이크로 센서MicroMagneitcs Sensible SolutionsLong probe STJ-020 마이크로센서
SPIONMayo Clinic내부적으로 합성된 나노 입자(참조: Lee, S. J. et al. 폴리(D,L 라타이드-코-글리콜라이드)로 캡슐화된 자성 산화철의 나노 입자 그리고 자기 공명 영상 조영제에 대한 그들의 응용. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi : DOI 10.1016 / j.jmmm.2003.12.416 (2004))
TelazolZoetis규제 물질은 면허가있는 수의사
Trypsin EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazineBayer Animal Health상업명 : Rompun. 면허가 있는 수의사만 주문할 수 있는 통제된 일광
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