Method Article

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

DOI:

10.3791/53105

⸱

August 31st, 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

In This Article

Summary

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박테리아 피오멜라닌 생성은 산화 스트레스와 독성에 대한 저항력을 증가시킵니다. 우리는 pyomelanin 생성의 억제를 결정하고 박테리아의 산화 스트레스에 대한 민감도의 증가를 분석하며 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 데 사용할 수 있는 기술에 대해 보고합니다.

Abstract

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Pyomelanin은 여러 박테리아 및 곰팡이 종에 의해 생성되는 세포 외 적갈색 색소입니다. 이 색소는 티로신 이화 경로에서 파생되며 산화 스트레스 저항성을 높이는 데 기여합니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 표멜라닌 생산은 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)으로 처리하여 용량 의존적 방식으로 감소합니다. 우리는 박테리아의 피오멜라닌 생성을 감소시키거나 폐지할 약물의 농도를 결정하기 위해 여러 농도의 NTBC를 사용하는 적정 방법을 설명합니다. 적정 방법은 쉽게 정량화할 수 있는 결과를 가지고 있으며, 약물 농도가 증가함에 따라 색소 생성이 눈에 띄게 감소합니다. 또한 박테리아의 항생제 최소 억제 농도(MIC)를 분석하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 최소한의 리소스를 사용하며 하나의 마이크로타이터 플레이트에서 하나의 박테리아 균주에 대해 여러 항생제를 테스트하도록 쉽게 확장할 수 있습니다. MIC 분석은 특정 농도에서 박테리아 성장에 대한 비항생제 화합물의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있습니다. 마지막으로, H2O2 를 한천 플레이트에 통합하고 플레이트에 여러 박테리아 희석을 발견하여 산화 스트레스에 대한 박테리아 민감도를 테스트하는 방법을 설명합니다. 산화 스트레스에 대한 민감도는H2O2 대조군이 없는 대조군과 비교하여H2O2를 함유하는 플레이트의 다양한 희석액에 대한 콜로니 수와 크기의 감소로 표시됩니다. 산화 응력 스폿 플레이트 분석은 최소한의 자원과 낮은 농도의 H2O2 를 사용합니다. 중요한 것은 재현성도 우수하다는 것입니다. 이 스폿 플레이트 분석은 한천 플레이트에 화합물을 통합하고 그에 따른 박테리아 성장을 특성화하여 다양한 화합물에 대한 박테리아 민감도를 테스트하도록 조정할 수 있습니다.

Introduction

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>jove_content<녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 박테리아로, 산화 스트레스1-4로부터 보호하는 데 도움이 되는 적갈색 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 포함한 다양한 색소를 생성하고, 아미노글리코시드 항생제5-7을 포함한 다양한 화합물과 결합합니다. 피오멜라닌 생성은 호모겐티세이트 1,2-디옥시게나제(HmgA)1,9를 암호화하는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 통해 또는 경로10의 다양한 효소의 불균형을 통해 티로신 이화작용 경로4,8의 결함으로 인해 발생합니다. Homogentisate는 HmgA의 불활성화로 인해 축적되고 분비 및 산화되어 pyomelanin11을 형성합니다. 피오멜라닌의 생산은 티로신 이화작용 경로에서 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(Hpd)를 억제하는 제초제 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)12 처리를 통해 용량 의존적 방식으로 폐지 또는 감소할 수 있습니다13. Hpd는 homogentisate의 형성에 필요하므로 pyomelanin11이 필요합니다.

녹농균을 생산하는 녹<....

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Protocol

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배양기 항생제 1. 제조, 및 2- [2- 니트로 -4- (트리 플루오로 메틸) 벤조일] -1,3- 시클로 헥산 디온 (NTBC)

  1. 적절한 볼륨으로 LB 액체 배지 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 %의 NaCl의 H 2 O)과 분취 액을 만든다. 오토 클레이브 소독. 실온에서 보관하십시오.
  2. 100 ㎖ LB 한천 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 % 염화나트륨, H 2 O 1.5 % 한천) 250 mL의 플라스크를 만든다. 실온에서 오토 클레이브 및 저장에 의해 소독. 한천 플레이트에 쏟아져 전에 용융되어 있는지 확인합니다.
    주 : 4 판을 수득한다 LB 한천 100 ㎖을 함유하는 플라스크. LB 한천의 양이 분석에 필요한 플레이트의 수에 대응하도록 변경 될 수있다.
  3. (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4) (16) PBS를 확인합니다. 실온에서 오토 클레이브 또는 여과 및 저장에 의해 소독.
  4. 겐타 마이신에 대한 항생제 재고 솔루션을 준비, 카나마이신,D 토....

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Results

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NTBC 적정

NTBC가 경찰에 pyomelanin 생산을 줄일 수 있다면 NTBC 적정을 결정하는 데 사용되었다 애 루기 노사, 또한 제거 또는 추가 분석에 사용하기 위해 생산을 감소 pyomelanin NTBC의 농도를 확인한다. 이 다른 복제에서 생성 pyomelanin의 수준에서 변화 될 수 있지만 일반적인 경향은 일정하게 유지 될 수 있습니다. NTBC 적정 분석은 다른 세균 안료 생산에 영향을 미칠 수있는 다른 화합물을 시험하기 위해 수정 될 수있다. 시각적으로 결정되거나 정량화 될 수 표현형 변화가있는 경우에만, 그러나 작동 할 것이다.

P.의 pyomelanin 생산 균주의 치료 NTBC와 aeruginosa에 안료 생산 (12)의 농도 의존적 감소의 결과. 그림 2하여 보여줍니다 P.의

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Discussion

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이 프로토콜에 설명된 NTBC 적정 방법을 통해 사용자는 NTBC가 박테리아에서 파이오멜라닌 생성을 감소시키거나 제거할 수 있는지 여부를 결정하고 필요한 NTBC의 농도를 결정할 수 있습니다. NTBC 적정 분석에서 가장 중요한 단계는 분석에 사용할 NTBC 농도 범위를 결정하는 것입니다. P. aeruginosa 의 다른 균주는 NTBC에 대한 민감도가 다르며, 실험실 균주는 임상 분리주보다 NTBC에 더 민감할 수 있습니다12 (그림 2). 따라서 분석 중인 각 균주에 대해 다양한 NTBC 농도를 테스트할 필요가 있습니다. 사용자가 특정 균주에서 피오멜라닌 생성을 억제하는 NTBC의 최저 농도를 결정하기를 원할 가능성이 높기 때문에 더 낮은 농도로 시작하여 필요에 따라 더 높은 농도로 늘리는 것이 좋습니다. 당사의 적정 분석은 색소 생성 억제를 결정하는 정성적 방법을 설명합니다. 연구 목적에 따라 농곡진 수치를 결정해야 할 수도 있습니다. 이는 샘플에서 파이오.......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 다라 프랭크(Dara Frank)와 캐리 하우드(Carrie Harwood)에게 균주에 대한 관대한 기여에 감사를 표합니다. 위스콘신 대학교 밀워키 연구 재단은 특허 번호 8,354,451을 보유하고 있습니다. 2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)과 같은 4-하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 억제 화합물을 투여하여 환자에서 미생물의 감염 진행을 치료하거나 억제하는 것에 대한 청구가 광범위하게 이루어졌습니다. 발명자는 Graham Moran과 Pang He입니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R00-GM083147)의 지원을 받았습니다. University of Washington P. aeruginosa transposon 돌연변이 라이브러리는 NIH P30 DK089507의 지원을 받습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)시그마-알드리치SML0269-50mg은 니티시논이라고도 합니다. DMSO에 용해됩니다.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. H2O.  안정.
GentamicinGold BioG-400-100H2O.에 용해됨  필터는 살균합니다.
KanamycinFisher ScientificBP906-5H2O.  필터는 살균합니다.
토브라마이신시그마-알드리치T4014-100MGH2O.  필터는 살균합니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A.

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Tags

Pyomelanin ProductionNTBC TitrationOxidative Stress AssayMIC AssayBacterial SensitivityHydrogen PeroxideAntibiotic ResistanceSpot Plate MethodSerial DilutionPseudomonas Aeruginosa

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