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방법 논문

코카인 유발 행동 과민성 및 마우스의 조건 장소 선호도 평가

17.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53107

⸱

2016년 2월 18일

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, McLean Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 연구자들이 조건화된 장소 선호 및 운동 행동 민감성 분석을 사용하여 중독의 이러한 측면을 테스트하기 위해 고안된 실험을 수행할 수 있도록 하기 위한 것입니다.

초록

마약에 대한 보람 있는 경험은 강력한 맥락적 연관성을 만들고 반복적인 복용을 장려하는 것으로 생각됩니다. 결과적으로, 남용 약물에 대한 반복적인 노출은 취약한 개인의 뇌 기능에 지속적인 변화를 일으키며, 이러한 지속적인 변화는 중독/의존의 특징인 부적응 약물 추구 및 복용 행동을 유지하는 데 기여할 가능성이 높습니다2. 설치류의 경우, 보상 경험과 맥락적 연관성은 이전에 약물 쌍을 이룬 맥락에 대한 선호도가 측정되는 조건화된 장소 선호 분석법(CPP)을 사용하여 자주 측정됩니다. 반면에 행동 민감화는 반복적인 노출을 통해 점진적으로 발전하는 약물 유발 행동의 증가입니다. 감작 행동은 종종 몇 달간의 약물 금주 후에 측정될 수 있기 때문에, 초기 노출의 용량과 기간에 따라 지속적인 약물 유발 가소성의 관찰 가능한 상관관계로 간주됩니다. 연구자들은 이러한 분석이 중독의 측면을 매개하는 신경생물학적 기질을 결정하고 이러한 행동을 방해하는 다양한 개입의 잠재력을 평가하는 데 유용하다는 것을 발견했습니다. 이 원고는 마우스 CPP 및 코카인에 대한 운동 행동 민감화를 위한 기본적이고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

서론

동물 모델을 사용하여 약물 중독을 이해하는 것을 목표로 하는 연구는 보상/강화/동기 부여, 금단 및 재발 등 치료 성공을 가로막는 다양한 구성 요소뿐만 아니라 이러한 중독 문제를 더욱 복잡하게 만드는 일반적인 지속성을 다루기 위해 다양한 접근 방식을 취해야 합니다. 약물 남용과 관련된 보람 있는 경험은 후속 약물 복용에 동기를 부여하는 것으로 생각되기 때문에 약물 맥락 연관성에 초점을 맞춘 연구는 약물 복용 및 탐색에 기여하는 뇌 메커니즘을 이해하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 이러한 분석 중 하나인 CPP(Conditioned Place Preference)는 보상 민감도의 그룹 차이를 비교하기 위한 고처리량 방법입니다. 과제에 대한 전통적인 해석은 조건화된 자극(CS)이 무조건적 자극(UCS)과 쌍을 이루고, 여러 쌍을 이룬 후에 CS가 UCS와 동일한 행동을 유도하는 고전적 또는 파블로프식 조건화와 관련이 있습니다(단,39,40 참조). 이론적으로 동물은 내부수용성 상태(보상 또는 혐오)를 맥락적 단서와 연관시키는 법을 배운다. 그런 다음 내부 수용 상태의 상대적인 혐오감 또는 식욕 강도를 평가한 다음 상황적 단서에 대한 동물의 선호도를 결정함으로써 평가합니다. 약물 보상 연관성을 측정하기 위해 장소 조건화를 사용하는 것은 적어도 1957 년으로 거슬러 올라가며, Y- 미로에서 쥐에게 모르핀을 사용한 연구로 거슬러 올라갑니다3,4. 지난 수십 년 동안 이 방법의 변형은 다양한 자극에 대한 설치류의 장소 선호도와 혐오를 연구하는 데 널리 사용되었으며, 약물 남용에 의해 유발된 연관성 연구에 특히 유용합니다. 약물 중독 연구에서 이 분석은 여러 약물의 보상 특성과 약물 보상에 대한 다양한 뇌 시스템 및 단백질의 기여도를 평가하는 데 사용되었습니다(리뷰는5-7,44 참조). 약물 중독에 기여하는 요인을 평가하는 우수한 방법, 즉 약물 자가 투여가 있지만 CPP는 보상 기능을 측정하는 간단하고 훨씬 더 접근하기 쉬운 접근 방식입니다.

조건화된 장소 선호 및 혐오(CPA)에 대한 대부분의 최신 프로토콜은 설치류가 출입구 또는 더 작은 연결 챔버를 통해 두 개의 별개의 챔버에 접근할 수 있도록 하는 장치를 사용합니다. 두 챔버 사이의 구별은 최소한 벽 색상 및 바닥 질감을 포함한 시각적 및 촉각적 단서를 기반으로 하는 경우가 많지만 때로는 후각 단서와 같은 다른 요소를 포함합니다. "편향된" 디자인은 일반적으로 설치류가 일반적으로 흰색보다 검은색 챔버에 대해 보여주는 것과 같이 한 챔버에 대한 기존의 선천적인 선호를 뒤집으려고 시도합니다. "편향되지 않은" 설계는 그룹 내의 두 챔버 중 하나에 대한 할당을 무작위로 상쇄하여 처음에는 동등하게 매력적이었던 두 챔버 중 하나에 대한 선호도를 만드는 것을 목표로 합니다. "균형 잡힌" 디자인은 동물이 작은 선호도를 보이지만 그룹으로서 같은 방을 선호하지 않을 때 사용됩니다. 이 후자 설계의 목표는 1) 실험 그룹 간에 크게 다르지 않은 (최종) 코카인 쌍 챔버에 대한 사전 테스트 선호도 점수와 2) 사전 테스트에서 코카인 쌍 챔버에 대한 무시할 수 있는 선호도(양성 또는 음성8)를 생성하는 것입니다. 균형 잡힌 디자인은 벽 색상(흰색 위의 검은색)과 바닥(막대 위의 철사)에 대해 모순되는 편향을 사용하는 설명된 챔버와 함께 사용하기에 이상적이며, 그 결과 서로 다른 동물의 검은색과 흰색 측면 모두에 대한 작은 선호도가 거의 동일하게 분포됩니다. 밸런싱 계산은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

조건화 과정에서, 동물들은 약물에 노출되고, 제한된 기간 동안 이 두 가지 환경 중 하나에 재빨리 배치된다. 노출은 일반적으로 복강내 주사(i.p.) 또는 피하주사(s.c.) 주사를 통해 이루어지지만, 정맥주사(i.v.) 자가 투여9 및 두개내 주입38 에 대한 패러다임도 개발되었다. 이러한 쌍은 반대쪽 챔버에서 수행되는 동일한 길이의 비약물(차량) 쌍으로 보완되며, 이는 약물 쌍과 같은 날 또는 별도의 날에 발생할 수 있습니다. 일반적으로, 조건화 후 장치를 탐험할 수 있게 되면, 동물들은 보람 있는 약물(즉, 인간과 동물이 자발적으로 자가 투여하는 약물)을 받은 곳에서 더 많은 시간을 보내게 되는 반면, 질병을 유발하는 약물(예: 염화리튬)을 투여받은 장소는 피하게 된다. 여러 가지 연구가 다양한 남용 약물에 대한 선호 조건을 최적화하는 데 전념해 왔다(검토를 위해7 참조). 생쥐의 코카인 복용량(ip)은 일반적으로 1에서 20mg/kg 사이이며, 5mg/kg 미만의 복용량은 한 그룹에서 높은 감도를 분석하는 데 자주 사용됩니다. 2개 이상의 약물 쌍은 전형적으로 성체 마우스(10)에 필요하며, 이러한 쌍의 길이는 중요한 고려 사항이다. 매우 적은 용량의 코카인은 즉각적이고 짧은 조건화가 필요한데, 아마도 이 방법이 노출의 가장 보람 있는 기간을 포착하기 때문일 것입니다. 지연되거나 매우 긴 조건화 기간은 선호를 초래하지 않거나 심지어 혐오를 유발할 수 있습니다11,12. 다음은 성인 마우스에서 코카인에 대한 조건화된 장소 선호도를 얻기 위한 기본 방법을 제시합니다.

CPP 분석은 보상 관련 학습 및 약물 맥락 연관성에 대한 기억을 평가하는 이상적인 방법이지만, 행동 민감화는 틀림없이 수행하기가 더 쉽고 반복적인 치료를 통해 발생하는 변화를 평가할 수 있습니다. 역내성(reverse-tolerance)이라고도 하는 감작을 겪는 행동은 특정 남용 약물, 특히 정신자극제에 대한 반복적인 노출에 따라 점진적으로 강화되며, 교차 감작(cross-sensitization)은 이러한 약물의 전부는 아니지만 일부 사이에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 특히 설치류에서 코카인에 의한 운동 감작에 대한 최초의 평가 중 하나는 1976 년에 발표되었습니다13. 많은 실험실에서 감작 운동은 원래 노출 길이, 위치 및 노출 용량에 따라 약물 중단 후에도 오랫동안 감지할 수 있음을 보여주었으며14-17 현재 프로토콜은 마우스18에서 7일(30mg/kg)의 코카인 치료 후 10개월까지 감작을 감지하는 데 사용되었습니다. 이 테스트는 다양한 크기와 모양의 장치에서 광빔 또는 비디오 추적 기술을 사용하여 수행할 수 있으므로 많은 실험실에서 간단하게 수행할 수 있습니다. 운동 감작의 견고한 특성, 단순성 및 지속성으로 인해 이 평가는 약물 유발 행동의 장기적인 변화의 기본 메커니즘을 조사하는 데 이상적인 부분으로 만듭니다.

논의에서 자세히 설명했듯이, 운동 감작 분석을 수행할 때 중요한 고려 사항은 약물이 가정 환경에서 투여되는지 아니면 테스트 케이지 환경에서 투여되는지 여부입니다. 약물 투여가 가정 케이지 밖에서 이루어질 때 발생하는 강력한 감작을 활용하기 위해 이 프로토콜은 이 방법을 사용합니다. 그러나 동물이 약물에 노출되기 전에 새로운 환경에 적절하게 습관화되지 않은 경우 1일차에 신규성 유도 천장 효과가 발생하여 감작의 진행적 특성을 부분적으로 또는 완전히 가릴 수 있는 것으로 관찰되었습니다. 이것은 신규성과 함께 약물의 시너지 운동 활성화 효과를 나타낼 가능성이 높으며, 이러한 효과의 기저에 있는 메커니즘은 흥미로울 수 있지만, 설명된 방법은 신규성의 역할을 줄이고 약물의 효과를 보다 독립적으로 측정할 수 있도록 설계되었습니다. 이 방법은 다른 운동 감작 약물의 평가에 유용할 것으로 예상되지만, 주로 C57BL/6 마우스에서 코카인에 대한 효과를 평가했습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 맥린 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 참고 : 다음 프로토콜은 다른 성공적인 프로토콜 (예를 들어, 라이트 - 대 어두운 상 시험, 연속 대 간헐적 투여 등)과 다른 많은 세부있는 CPP와 전위의 민감성에 하나의 접근 방법을 설명합니다. 초보자는 손에서 실험 질문 (들)을 기반으로 문헌에서 변화 적응, 이러한 프로토콜로 시작하거나 가이드로 사용하실 수 있습니다. 자동화 된 측정 방법이 설명되어 있습니다; 그러나, 각각의 분석 (예를 들어, 비디오 녹화, 손 득점) 비 자동화 된 수단을 사용할 수있다.

1. 에어컨 장소 환경 설정

  1. 장비 및 객실 설정 :
    1. 시험을하기 전에 적어도 3-5일를 들어, 1-3 분 매일 실험 쥐를 처리합니다.
      참고 :-처리하지 마십시오 마우스는 챔버 헤어 구조 강화에서 제거를 찾을 수 있습니다ssful, 방해하거나 에어컨을 변경할 수있다.
    2. 바람직하게는 자동화 된 데이터 수집 (18) photobeams을 갖춘 네 개 이상의 세 챔버 CPP 장치를 얻습니다. 확인 각 챔버가 제기 될 수있다 문을 통해 작은, 중간 챔버에 연결하는 두 개의 큰하여 시각 및 촉각-별개의 챔버를 가지고 / 액세스를 제어 할 수 낮췄다. 각 챔버의 뚜껑은 마우스의 삽입 / 제거 열립니다 작은, 개별적으로 제어 (디밍) 등 (챔버 당 하나)에 장착 될 수있다.
      주 : CPP 챔버 설계는 다양하고 시판 구입 또는 연구자에 의해 구성 될 수있다. "균형 잡힌"디자인, 추천 방식은 하나의 큰 흰 벽과 와이어 그리드 바닥 챔버와 검은 색 벽과 바 바닥으로 다른 것입니다. 중간 챔버는 회색 벽과 단단한 회색 플렉시 유리 바닥이 있어야합니다. 설명을 목적으로,이 챔버 "는"흰색 "블랙"및 "중간이라고한다."뚜껑은 명확 플렉시해야한다. 다른 구획 구성 (1 또는 2 챔버) (토론 참조) 다른 곳도 가능하고 논의한다.
    3. 설치는 테스트 중에있을 것 같은 방 : 전원을 끄거나 가장 어두운 설정으로 머리 위의 조명을 설정하고 문을 닫습니다. 중간 챔버가 시간을 보내는에서 쥐를 억제하기 위해 검은 색과 흰색 실 (6 ~ 10 룩스)보다 (15 ~ 20 룩스) 약간 밝게되도록 각 챔버 내부의 빛 측정기를 사용하고 뚜껑 등을 설정합니다.
      주 : 중간 소비 된 평균 시간만큼 또는 검은 색 또는 흰색의 챔버보다 크면, 상기 단계 1.1.3에 기재된 조명 콘트라스트를 증가시킨다. 또한, 중간 덜 매력적인 바닥을 사용합니다. 하지만, 그 중간 시간에 감소하기 위해이 챔버 어떤 변화 혐오. 파일럿을 피하기 총 탐험 감소로 인해 수 없습니다 (횡단) (예를 들면은, ~ 220 0.5 cm 직경의 구멍이 균일하게 6 × 3.5 X ¼ "플렉시 글라스에 간격) .
    4. 피자동화 된 데이터 수집 ( "절차"그림 1A)를 rogram 또는 수동으로 다음과 같은 매개 변수에 따라 데이터를 수집합니다. 설정 시험 중 하나를 조절 실에서 제 1 빔 휴식에 시작합니다. 설정 "테스트"세션의 길이는 20 분 할하고 각 챔버에 소요되는 시간 및 빔 휴식을 추적 할 수 있습니다. 설정 "조절"세션은 각 실에 빔 나누기를 측정 (옵션) 30 분 길이 될 수 있습니다. 재판 중 조명 모든 실 등을 설정합니다.
    5. 손에 실험에 필요한 코카인 솔루션의 전체 볼륨을 준비합니다. 0.1 ml / 10 g 체중의 주입량에 최종 농도로써 0.9 %의 NaCl (생리 식염수)에 코카인 염산을 용해 (5 ㎎ / ㎏의 투여 량에 대해, 예를 들면 용액의 농도는 0.5 ㎎ / ㎖ 임). RT에서 소용돌이 30 ~ 45 초 동안 혼합, 살균 필터 (0.2 μm의 주사기 필터) 및 저장.
  2. 테스트 :
    참고 : CPP의 일반 타임 라인은 PRE-TEST, 컨디셔닝 및다음 POST-TEST. 예비 시험 1 내지 3 일까지 에어컨으로부터 분리 될 수있다; 그러나, 에어컨 및 사후 테스트 일 연속 일 (그림 2A)에 개최한다. 이 타이밍은 동일한 실험에서 모든 집단에 대해 동일하게 유지되어야한다.
    1. 일간에 걸쳐 각 동물에 동일한 장치를 이용하여 동물의 광 위상 동안 시험.
    2. 각 시험 날 (즉, 테스트 및 컨디셔닝 일), 행동 대기실에 마우스를 이동하고 재판 전에 1.5 시간 동안 자신의 홈 새장에 그대로 앉아 할 수 있습니다. 재판이 시작되면 마우스가 최소한의 중단, 장치에 자신의 케이지에서 신속하게 이동할 수있는 위치를 선택합니다. 시험 (예를 들면, 장비 팬)와 관련된 잡음이 존재 있도록 모든 장비의 전원을 켭니다.
    3. 철저하게 각 장치 (내부 벽, 바닥과 트레이) 경도와 청소, 알코올, 글리콜 에테르 - 또는 암모니아 기반 소독 이전과 이후 물티슈 각 마우스 (SAM을 사용하여실험을 통해 청소기의 전자 형). 방치 바닥 밑바닥하지 마십시오.
    4. 확인의 객실 조명은 하루의 시작 부분에 (해제 또는 흐리게) 적절하게 설정된다.
    5. 를 진행합니다 다음은 "테스트"또는 "조화"하루 여부에 따라 :
      1. 시험 일 1과 6 일 (즉, 사전 및 사후 검사)는 개방 위치 (그림 2B)에 간 실 문을 배치합니다.
      2. (해당되는 경우) 다음 (그림 1B)를 시작 명령을 발행, "테스트"컴퓨터 프로그램을로드하고 동물 ID를 (그림 1A)를 입력합니다.
      3. 다시 벽에 직면 할당 된 장치의 중간 챔버로 각 마우스 조심스럽게 이하, 부드럽게 뚜껑을 닫습니다. 모든 챔버가로드되면, 검사실두고 잡음을 최소화한다.
      4. 각 장치 내부에 마우스를 남겨 모든 쥐에 대한 실험 (그림 1C)를 종료 / 닫을 때까지. 내보내기 시험 자료.
      6. <리> 직전에 또는 사전 테스트에 따라, 동물의 무게. 에어컨 동안 선량 계산이 가중치를 사용합니다.
    6. (즉, "블랙 마이너스 화이트"& "흰색 마이너스 블랙"다른에서 이들 각각에 소요되는 시간을 뺀 흑백 챔버 각 마우스의 사전 테스트 "기본 설정"을 계산, 조절 시험을 준비하기 위해; 참조 그림 3, 열 9 & 10).
    7. 강력한 초기 설정으로 마우스 어렵게 균형을 확인하기 때문에, (예를 들어, <총 시험 시간의 33 %) 선호도 점수에 대한 허용 한계를 설정하고 계산에서 초과 마우스를 제외합니다. 마찰 가능성이있을 때 테스트가 완료된 후 (때문에 오프 대상 수술 조작에, 예를) 포함을 극대화하기 위해 자유 제한 (<총 시험 시간의 66 %)를 사용합니다.
      주 : 한계를 초과 마우스는 여전히 자신의 균형을 사전 테스트 환경을 유지하기위한 시도로, 테스트를 할 수있다. 나중에, t필요한 경우 HESE 마우스는 사전 테스트 점수를 균형, 분석에서 제외 될 수있다. 극단적 인 사전 테스트 바이어스 (즉,> 800 초) 불균형 한 그룹에 영향을 미칠 경우, 컨디셔닝 환경을 변경 및 / 또는 다른 분석을 사용하는 것이 좋습니다.
    8. 각 마우스에 대한 약물 페어링 실 같은 검은 색 또는 흰색 실을 선택, 그 사이에 마음에 다음과 같은 우선 순위와 각 그룹 내에서 대응하는 사전 테스트 환경 점수를 합산 :
      주 : 각 집단 내에서뿐만 아니라 이전의 집단에서 집단 간의 점수의 균형을주의하십시오.
      1. 가능한 한 동등한 모든 그룹에 대한 금액을 확인합니다.
      2. 가능한 제로 (즉, 일부 마우스 및 다른 사람에 대한 비 바람직한 측면의 바람직한면을 선택)에 가까운 금액을 확인합니다. 거의 제로 합이 주어진 그룹 불가능한 경우 약간 마이너스 그룹 위에 합산 선호 밀접 제한 기위한 최선 얻어지는 점수 맞게 다른 모든 재조정양.
      3. 만큼 가능한, 흰색, 심지어 각 그룹 내에서 약물 짝 비 선호 챔버 대 바람직 대 블랙의 할당을 유지합니다.
      4. 그것을 상기 목표를 달성하는 것이 항상 가능한 것은 아니기 때문에, 이후의 코호트 대향 균형을 고려함으로써 편차를 보정; 그러나, 격렬하게 서로 다른 평균 사전 테스트 환경과 동료를 생산하지 않도록하려고합니다.
    9. 컨디셔닝 일 2-5에서 폐쇄 위치 (그림 2C)에서 인터 실의 문을 배치합니다.
    10. 코카인 개별 주사기를 준비 (일 2 & 4) 또는 식염수 단계 1.1.5에 설명하고 사전 테스트에서 측정 된 체중을 기반으로 (일 3 & 5) 솔루션.
      참고 : 용량은 실험의 기대에 관해서는, 소개에서 언급 한 고려 사항 및 잠재적 인 바닥과 천장 효과를 선택해야합니다. 또한, 적어도 두 개의 다른 투여 량을 사용하여 독립적 인 실험을 수행하는 것이 최상이다.
    11. 로드 "C해당되는 경우 onditioning "컴퓨터 프로그램을 입력 동물 ID를 (그림 1A)를 선택한 다음, (그림 1B)를 시작 명령을 실행합니다.
    12. 목덜미는 부드럽게 뚜껑을 닫고 즉시 다시 벽에 직면 할당 된 장치의 적절한 검은 색 또는 흰색 챔버로 저하, 각 마우스 (IP)을 주입합니다. 모든 챔버가로드되면, 검사실두고 잡음을 최소화한다.
    13. (다른 마우스는 여전히 에어컨 동안 즉, 첫 번째 쥐가 자신의 방에서 제거)로 가능한 정확하게 30 분에 자신의 챔버에서 쥐가 가까이 제거합니다. 소음을 도입하지 않고, 조용히 가능한 한 동물을 제거합니다.
  3. 통계 분석:
    1. 분석의 방법을 선택합니다. 어느 시점부터 사후 테스트 중에 식염수 쌍 측에 소요 빼기 시간은 사후 테스트 (코카인 - 식염수, 초) 동안 코카인 쌍 측에 지출 또는 사후 테스트의 약물 쌍 챔버에서 보낸 시간을 사용마이너스 사전 테스트 시간은 약물 쌍의 챔버에 보내었다.
      참고 : 첫 번째 방법을 사용하는 경우, 평균 시간도 플롯 선 그래프는 각 그룹에 대한 사전 및 사후 시험 중에 중간, 생리 식염수와 약물 쌍 실에서 보냈다. 사전 테스트에 비해 사후 테스트는 약물 쌍의 측면에서 증가 된 시간을 표시하고 식염수 쌍 측 (설명을 그림 6, 바닥 및 토론 참조)에 소요되는 시간을 감소해야한다.
    2. 자연 및 그룹의 개수에 따라 비교되는 것은, t 시험을 사용하여, 1 또는 2 웨이 ANOVA, 상기 제시 감산 스코어를 분석 할 가능성 사후 분석 적절.
      주 : 코카인 기본 점수 변수 경향, 또한, (즉, 약물 - 쌍이 측면 혐오 나타냄) 네가티브 일 수있다. 이 결과는 GR 사이의 차이를 결정하는 정상 및 가능성이 중요하기 때문에 혐오감을 표시 마우스는, (그들은 통계적 이상치하지 않는 한) 제거 할 수 없습니다한다oups. 치료 효과의 크기에 따라 그룹별로 12-30 동물의 샘플 크기를 필요로 할 것으로 예상된다.

2. 운동력이 과민성

  1. 장비 및 룸 설정
    1. 4 × 8 (X x 및 y) photobeam 배열 (외부 치수 11.5 "× 20")을 얻었다. 블랙 플렉시 유리로 만들어진 오픈 얹어 실 구축 (내부 크기를 22 1/6 "X 13 ¾"X 9 3/8 ") 배열 (그림 4A)를 수용 할 수.
    2. 레드 라이트 (천장에 또는 벽에 설치)를 테스트하는 동안 사용할 수 있도록 테스트 룸을 준비합니다.
    3. 매일 습관화 및 사출 시험을위한 별도의 프로그램 세션을 준비합니다.
      1. 설정 요법 이니 시험은 60-120 분 (그림 5B) 사이에 30 ~ 60 분, 주입 실험 사이 여야합니다. 각각의 권장 길이는 60 분입니다. 같은 실험에서 여러 동료 일관성 재판 길이를 유지합니다.
      2. 설정 시험은 RECO을 시작합니다시작 신호 (그림 5B) 개시 후 발생하는 제 1 빔 휴식시 rding. 주입 시험의 경우, 가능하면 박스 (하지 일체) 개별적으로 시작할 수 있도록하는 시작 신호를 설정합니다.
      3. 집합 빔 나누기 "빈"사용자 정의에 기록되는, 바람직하게는 5 분마다 (도 5b).
    4. 손에 실험에 필요한 코카인 솔루션의 전체 볼륨을 준비합니다. 0.1 ml / 10 g 체중의 주입량에 최종 농도로써 0.9 %의 NaCl (생리 식염수)에 코카인 염산을 용해 (5 ㎎ / ㎏의 투여 량에 대해, 예를 들면 용액의 농도는 0.5 ㎎ / ㎖ 임). RT에서 소용돌이 30 ~ 45 초 동안 혼합, 살균 필터 (0.2 μm의 주사기 필터) 및 저장.
  2. 테스트
    주 : 시험의 초기 단계는 10 ~ 11 일 연속 실행됩니다. 습관화 (사출 무료) 및 사출 : 마우스는 두 매일 재판을받을 수 있습니다. F에 처음 세에 대한 식염수를 관리같은 용량 (예., 15 ㎎ / ㎏ / 일)를 사용하여 다음 7에 대한 우리의 일 (식염수 습관화의 중요성에 대한 토론을 참조), 코카인.
    1. 매일, 1 시간 30 분 동안 행동 대기실에 자신의 홈 케이지에서 마우스를 적응.
    2. 신선한 침구 (예를 들면, 소나무 칩)의 매우 얇은 층으로 깨끗 표준 마우스 크기의 명확한 아크릴 주택 새장을 준비하지 모호한 photobeams하기 위해, 해당되는 경우 (그림 4C & D).
    3. 다섯 빔의 길이를 따라 균등하게되도록 한쪽 끝 근처 photobeam 배열의 Y 축에 대한 장소 케이지. X 축 광선이 시험 (도 4C 및 D)에서 사용되지 않는다.
    4. 임의의 순서로, 목덜미에, 자신의 홈 케이지에서 마우스를 가져다 무게. 직접 할당 된 운동 케이지에 자신의 (지원) 꼬리와 장소의 시설에 의하여 무게 보트에서 각 마우스를 제거합니다. 표준 필터 상단 뚜껑 각 케이지를 커버.
    5. w 개별 주사기를 준비당일의 체중에 기초하여, 단계 2.1.7에서 설명 된 바와 같이 i 번째 코카인이나 생리 식염수 용액. 15 또는 20 ㎎ / ㎏의 투여 량으로 시작하고, 더 높거나 더 낮은 투여 량을 사용하여 두 번째 실험을 고려 (관련 요소에 대한 논의 참조).
    6. 습관화 시험은 모든 새장을 위해 종료되면, 사출 프로그램을로드합니다.
    7. 한번에 한 그들의 시험 케이지 목덜미에서 쥐를 제거 및 주입 (IP)을 얻었다. 그 테스트 케이지에 마우스를 반환하기 전에 신속하게 케이지 (그림 5C, 아래)의 시작 신호를 시작합니다.
    8. 모든 주입 시험이 종료 한 후, 자신의 홈 케이지 및 주택 방에 마우스를 반환합니다.
    9. 7 일 동일한 복용량 도전 전에 3 내지 7을 있도록 식염수 후 원래의 절반 용량 이중 용량, 동일 량 : 원하는 경우, 마우스는 다음과 같은 인출 기간 및 약물 도전 일련 받도록 허용 각각의 추가 도전하기 전에 일. 무엇이든 도전의 선택을, maintai실험 집단 내에서 N과 유사한 금단 기간.
      주 : 원래 투여 량은 높은 (예를 들어, 상기 30 ㎎ / ㎏ 또는) 인 경우, 이중 용량 스킵 또는 저용량으로 대체되어야한다. 식염수 도전 형 코카인 쌍이 환경에 의한 조절 된 운동 활성을 계시하고, 그 과정에서, 코카인 의존 민감화 운동력의 양 (설명을 참조).
  3. 통계 분석
    1. 분석에 사용되는 각 시험의 부분 (들)을 선택합니다. 설치류 가장 코카인 유발 운동은 제 ~ 15-30 분 후 약물 주입 내에 일어난다. 여러 시간 윈도우 (예를 들면, 제 15, 30, 60 및 / 또는 120 분)에 대한 누적 운동을 분석, 관련 변수를 고려 따라 또는 재판의 독립적 인 부분에 초점을 맞 춥니 다.
    2. 프레임이 선택된 시간을 사용하여, 별도로 다음 습관화 및 주입 시험을 위해 하루 각 동물에 대한 빔 휴식을 요약각 그룹에 대한 합계 verage. 플롯을 의미하고 모든 일 선 그래프의 평균 (SEM)의 표준 오차. 치료 마우스, 초기 및 / 또는 후기 각 매일 시험에서 약물에 반응하는 방법을 변경할 수있는 바와 같이 각 매일 재판의 과정을 통해 5 분 빈에 의해 평균 그룹 빔 나누기를 플롯.
      참고 : 습관화 및 주입 시험을위한 일상 활동 평균 (예를 들어, 처음 15 분) 플로팅는 인위적으로 그 운동이 생리 식염수 주입에 의해 약화되어 나타납니다,하지만 (대부분) 그 활동이 기억 요법 이니의 마지막 하루가이 수준으로 감소한다 .
    3. 개별적으로 반복 측정은 (RM) ANOVAs가 적절하게 설계의 모든 간 주제 요소를 포함한 일 / 시간의 내 - 과목 요인을 갖고 사용하여 연속 식염수와 약물 치료 일을 분석합니다. 코카인 (급성 노출)의 1 일에 그룹의 차이, 그리고 도전에 대한 다변량 분산 분석을 조사하기 위해 t 검정 또는 편도 ANOVA를 사용합니다. 적절한 경우, significanc를 수행사후 검사 또는 단 변량 ANOVAs와 전자.

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결과

CPP 분석의 대표적인 결과는 대략 세의 구주를 야생형 C57BL / 6N 마우스를 사용하여 그림 6에 표시됩니다. 연구 설계 시험 (전후)의 내 - 과목 변수로, 2 × 3 혼합 요인이었고,이 치료 (생리 식염수와 코카인 5, 10 ㎎ / ㎏)의 변수를 사이에-과목. RM ANOVA 두 시험에서 관찰 유의 한 주 효과 대신에 해석 된 테스트 및 치료 (F 2,20 = 3.68, P <0.05) 사이에 유의 한 상호 작용을 보여 주었다 (F 1,20 = 9.86을, P <0.01) 및 치료 (F 1,20 = 4.37, P <0.05). 사후 비교는 그룹 중에 사전 검사 중에 서로 차이가없는 것으로 나타났다. 사후 테스트에서, 5 ㎎ / ㎏, 10 mg을 / kg은 서로 유의 한 차이가 없었다; 10 ㎎ / ㎏, P & 5 ㎎ / ㎏, P <0.5 : 그러나, 두 그룹은 식염수 전용 대조군보다 코...

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토론

이 프로토콜은 약물 유발 행동 가소성의 양상을 평가하기 위해 평균 랩에 의해 사용될 수있는 각각의 조건화 된 장소 선호도 전위의 증감에 대한 방법을 설명한다. 대부분의 행동 테스트와 마찬가지로, 기본 프로토콜 이외의 추가 가치 고려 사항이 있습니다. 우선, 이들 기술들 각각은 두 단계, 유도 식을 갖는 것으로 생각할 수있다. "유도"행동을 위해 컨디셔닝 동안 발생 CPP의 개발을 포함하고, 감작 대 (일반적 연속) 약물 노출의 초기 기간이다. 과민성에 대한이 철수 한 후 또는 단순히 마지막 연속 노출로 어느 특정 약물 문제로 정의 할 수 있습니다 동안 CPP에 대한 "식", 사후 테스트입니다.

더 나은 자신의 잠재적 영향을 분석 할 수있는 다른 대 다음 단계 중 하나에 제한 조작을 고려하는 가치가있다. 일시적으로 제한 효과와 바이러스 (예를 들어, HSV) 또는 약물의 공동 정부 / 전처리 (예를 들어, 작용...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 행동 테스트에 대한 도움말은 카렌 디 에츠와 샤리 번바움 행동 설계 고려 사항에 이전 입력 및 로렌 PECA 감사합니다. 저자는 또한 시몬스 재단 (CWC에 시몬스 재단 자폐증 연구 이니셔티브 부여), NIDA (DA008277, DA027664 및 DA030590 CWC, RDP에 LNS에 F32DA027265 및 F32DA036319에), FRAXA 연구 재단과 엘레과 마일의 관대 한 지원을 인정 해안 원정대 프로그램 (LNS에 교제 지원), 그리고 존 Kaneb 원정대 프로그램 (MT에 교제 지원).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cocaine Hydrochloride USPMallinckrodt Pharmaceuticals0406-1520연구 목적으로 구매 및 사용 (Schedule II 통제 물질)은 주 및 연방법에 따른 준수와 면허를 필요로 합니다. 
조건화된 장소 선호,  MouseMed-Associates Inc.MED-CPP-MS 및 MED-CPP-3013우리 실험실에서는 이 상자를 사용했지만 많은 대체 상자를 사용할 수 있으며 사용할 수 있습니다.
PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam ArraysSan Diego Instruments2325-0223 & 7500-0221우리 실험실은 텍스트에 설명된 대로 맞춤형 챔버 내부에 이러한 어레이를 보관합니다.  사용 가능한 대안이 있습니다.
일회용 Sani-Cloth 해산 물티슈PDI13872
용 수동 도어 및 조명이 있는 3칸 장치

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