CNS의 성상세포는 유해한 자극에 반응하여 기능적, 구조적 특성을 변화시킵니다. 이 보고서는 질병 상태 또는 치료 개입 후 3차원 성상세포 형태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
뇌 신경 교세포 같이, 성상 세포는 중추 신경계에서의 다양한 기능적 역할이있다. 유해 자극의 존재에서, 성상 세포는 기능 및 구조적 특성, 반응 astrogliosis라는 조건을 수정합니다. 여기에, 성상 세포의 형태 학적 특성 평가를위한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 지점 표면적 및 성상 세포 (성상 세포 지역)에 의해 덮여 조직, 지점, 전지 본체와 핵을 포함하는 전체 성상 세포의 부피, 즉 12 가지 파라미터 부량뿐 아니라 전체 길이 및 개수를 포함하는, 강도 성상 검출에 사용되는 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2)의. Volocity 6.3 측정에 사용 된 것처럼이 목적을 위해 3 차원 (3D) 공 촛점 현미경 이미지를 생성하고, 3D 이미지 분석 소프트웨어 등 하였다. 아밀로이드 베타 1-40에 노출 된 쥐의 뇌 조직 1-40) 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 또는 시험관 내 조건에서의 어느 하나로부터 다른 셀의 3 차원 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다.
서론
건강한 중추 신경계 (CNS)에서 별아교 세포는 혈류, 에너지 대사, 시냅스 가소성과 기능 및 세포 외 이온의 조절에 중요한 역할을하는 신경 전달 물질 및 1-3 항상성. 또한, 성상 세포는 다른 유해한 자극 및 비대, 증식 및 성상 세포 4,5의 기능 리모델링을 특징으로 반응 astrogliosis을 통해 외상, 감염, 허혈 또는 신경 퇴행과 같은 비정상적인 상태에 응답합니다.
반응성 astrogliosis은 치료 개입의 임상 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 조직에 염증 반응 및 복구 과정을 설계하고있다. 따라서, 성상 교세포는 중추 신경계에 영향을 미치는 질병의 다양한 치료 적 개입에 대 한 잠재적 인 대상으로 지난 수십 년 동안 신경 과학자로부터 주목을 받았다.
성상 세포는 일반적으로 잘-D와 별 모양이소마 6 퍼져 efined 가지. 뇌 질환 상태에서, 성상 세포는 복잡한 분기되고 베타 아밀로이드 (Aβ)의 존재하에, 예를 들면 팽윤 (7) 단부를 나타낸다.
이 문서에서는 공 초점 현미경으로 인수 성상 세포의 3D 이미지를 분석하기위한 프로토콜을 제공합니다. 각 성상 세포에 대한 정량적 십이 다른 파라미터를 측정 하였다 : 표면적 및 성상 세포의 영역 (성상 세포에 의해 덮여 조직), (분기 포함) 전체 셀, 전지 본체, 및 핵의 양; 총 길이와 가지의 수; 성상 검출에 사용되는 항체의 형광 강도; 및 성상 세포의 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2). 이를 위해, 우리는 함께 또는 항 염증 물질로서 게니 처리없이 Aβ 1-40의 주입 intrahippocampal 노출 래트에서 뇌 부분을 사용 하였다. 설명 프로토콜 형태 계측에 사용될 수있다시험 관내 또는 생체 내에서 서로 다른 조건에서 다른 세포 유형의 alysis.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
본 연구는 의료 과학이란 대학의 윤리위원회 (테헤란,이란)의 승인을 실험실 동물의 관리 및 사용 (NIH)에 대한 설명서에 명시된 정책에 따라 실시 하였다.
1. 동물, 수술 및 시료 준비
참고 : 3D 공 초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다.
- 두 그룹으로 무작위로 나누기 동물 : Aβ 1-40 -injection (N = 8)과 제니스 타인 처리와 Aβ 1-40 -injection (N = 8); 수술 전 위관 1 시간으로 제니스 타인 (예 : 폴리에 피마 자유 등의 차량에 희석하여 10 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취. 발가락을 곤란하게 한 후 철수 반사의 부족으로 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용합니다.
- 정위 장치 및 면도 헤드에서 동물을 놓습니다. IOD 적용오프라인 용액 두피 절개 전에 청소 및 감염의 위험을 최소화하기 위해 수술 중 무균 조작 위치를 유지한다. 쥐의 뇌 아틀라스 8 항에있어서, 브레 그마에 -3.5 mm 후방, 중간 선에 ± 2mm 측면 및 경막 아래 -2.8 mm의 해마에서 아밀로이드 베타 1-40 stereotaxically (4 μL)를 주입한다. 정위 방법은 이전의 출판물 (9)를 참조하십시오.
- 동물은 동물의 편안함을 보장하기 위해 완전히 의식 때까지 수술 후 관찰 / 치료를 제공합니다. 복구하는 동안 따뜻한 동물을 유지하고, 완전히 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에게 반환하지 않습니다. 수술 후 동물에서 감염의 징후에주의를 기울이십시오.
- 삼주 수술 후 케타민 (150 ㎎ / ㎏)에 의해 깊이 동물을 마취. 0.1 M PBS (PH = 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드 다음에 0.9 % 식염수 동물을 관류하여 transcardial 고정을 수행 한 후 제거하고 10에 기술 된 바와 같이 <뇌를 해결/ SUP>.
- 4 ℃에서 2-3 일 동안은 4 % 파라 포름 알데히드의 머리를 포스트 - 수정.
- 조직 포함 장비를 이용하여 파라핀 블록에서 조직을 포함, 그것은 올바른 정렬 또는 절편을 방해 할 수 있기 때문에 충전 언더 또는 오버 충전 카세트를 피할 수 있습니다. 파라핀 블록에서 조직의 방향에주의를 기울이십시오.
주 : 래트 해마는, 예를 들어 대뇌 반구의 후방 부에 가깝다. 따라서, 조직이 방법에 포함되어야 뇌의 후방 부에서의 단면 처리가 시작될. 원하는 해부학 적 구조에 도달하는 가이드로 Paxinos 아틀라스 (8)을 사용합니다. - 공기의 움직임이 어려운 부분의 취급을하기 때문에 멀리 공기 초안 또는 출입구에서 마이크로톰을 놓습니다.
- 이 깊이가 필요한 경우와 마찬가지로 완전한 성상 세포의 Z - 스택 이미지를 생산하기 위해 두께 ≥20 μm의와 섹션을 사용합니다. 그들이 원하지 않는 두께를 가질 수있다로 인해 열 전자에, 처음 몇 섹션을 사용하지 마십시오xpansion.
- (5 ± 2 C, 파라핀의 용융 온도 이하) 단지 충분히 부분을 평평하게 따뜻한 물 표면에 섹션을 놓습니다.
주 : 섹션의 확장 구조의 형태를 교란 할 위에. 신중하게 섹션을 전송하는 작은 붓을 사용합니다. 각 슬라이드에 2-3 섹션을 수집합니다. - 저장 수직 위치에서 랙에 슬라이드와 몇 시간 또는 O / N 37 ℃에서 그들을 건조 할 수 있습니다.
2. 면역 조직 화학
- Deparaffinize 크실렌 섹션, 2 × 10 분, 알코올 그라데이션을 통해 (99.8 %, 95 %, 70 %, 10 분마다) 및 PBS를 재수.
- 0.25 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.25 % 트리톤 X-100 및 3.5 % 정상 혈청 (4 ℃에서 O / N)를 함유하는 PBS로 1,500 : 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)에 대한 항체와 함께 인큐베이션 1 희석.
- 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 이차 알칼리성 인산 공역 antibodie으로 부화1 시간을위한 S (1 : PBS에 희석 (100), 21 ˚C).
- 3 × 5 분 동안 PBS의 섹션을 씻으십시오.
참고 : 배경 염색을 최소화하기 위해 이차 항체 후 제대로 부분을 세척하는 것이 중요합니다. - 액체 영구 레드 발색 (15 ~ 20 분)와 함께 어둠 속에서 섹션을 품어. 참고 : 사용하기 전에 더 이상 30 분 솔루션을 준비합니다.
- 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오.
- 마지막으로, 4-6-diamidino -2- 페닐 인돌과 핵 염색 (DAPI를 1 : PBS에 희석 500) 이전에 다루-미끄러 할 수 있습니다. 현미경 전에 냉장고에 24 ~ 48 시간에 슬라이드를 저장합니다.
3. 공 초점 현미경
주 : 정량적 평가 (아래 참조), 오류의 위험을 줄이기 위해 분기 겹치는 최소 명확하게 볼 DAPI로 핵 염색 성상 세포를 선택한다. Z 스택 이미지를 생산하는 것은 시간이 소요됩니다. 환자 수 및 처리하는 동안 중지하지 마십시오. 직립 공 초점 레이저 주사 현미경은 U 인성상 세포에서 3D 이미지를 만들 나오지.
- 현미경 단계에 슬라이드를 넣고 63X 목표를 선택합니다.
- 이미징 소프트웨어를 열고 시작 시스템을 클릭합니다. 찾기 탭을 클릭합니다. 할당로 이동, 적절한 빛을 조정 GFP를 선택합니다.
- 빛을 반영하기 위해 셔터를 엽니 다. 셔터의 오른쪽에있는 반사경 리볼버를 찾아 성상 세포 (녹색, 빨간색이나 보라색)에 의해 반영되어야 색상을 선택; (FSet20의 WF) 붉은 색은 여기에 사용되었다.
참고 : 현미경의 안구에 직접 사진을 집중하는 것을 잊지 마십시오. - 최적의 초점을 찾으려면, 모든 닫힌 클릭 화면 모드에서 현미경 핀을 넣어 취득 탭을 클릭합니다.
- 인수 탭에서 스마트 설치를 클릭; 창이 열립니다. 목록에서 (현재 프로젝트 즉, DAPI와 알렉사 플 루어 555) 적절한 형광을 선택합니다. 색상이 자동으로 선택됩니다.
- 최고의 신호를 클릭하고 적용을 한 후 설정 노출 클릭; 컴퓨터가 자동으로 노출 매개 변수를 설정합니다.
- 이미지를 최적화하기 위해, 채널 창으로 이동합니다. 표시 해제 트랙 2는, 트랙 1을 선택하고 라이브를 클릭합니다. 필요한 경우 이미지에 초점을 맞 춥니 다.
- 채널 창에서 다음 키를 조정; 자동으로 핀홀을 최적화 할 수 1AU을 클릭합니다. 그렇지 않으면 공 초점 영상이 최적이 될 것이다이 단계를 수행하는 것이 매우 중요합니다. 최고의 강도를 (추가 소음을 줄이기 위해 800 아래이 설정을 유지)하도록 게인을 조정합니다. 마지막으로, 2와 3 사이의 디지털 게인을 설정합니다.
- 표시 해제 트랙 1은 트랙 2를 클릭하고 트랙 2에 대한 단계 3.8를 반복합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다.
- 획득 모드 창으로 이동합니다. 프레임 크기를 최적화하고 평균하여 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 변경하려면 프레임 크기는 X * Y에 가서 X 1,024 1,024을 선택합니다. 더 나은 이미지를 만들 느린 속도를 선택합니다.
- 평균화로 이동하여 번호를 ≥4 선택합니다. 이 값은 평균 생산은 평균화 될 스캔의 수를 나타낸다획득 한 이미지를 이메일. 이제 스냅 버튼을 클릭하고, 촬영 된 2D 이미지를 저장합니다.
- 3D 영상의 경우, Z-스택 창을 엽니 다 원인이 스마트 설치의 Z-스택 항목을 표시합니다.
- 셀의 깊이, 즉, Z-스택에 대한 첫 번째 및 마지막 위치를 설정한다. 첫 번째 라이브를 클릭합니다. 그런 다음 Z-스택 시작하는 것입니다 조직 성상 세포의 최상 위치에 초점 현미경의 초점 드라이브를 사용합니다. 설정 먼저 클릭합니다. 그리고 Z-스택 검색이 중지해야 조직의 성상 세포의 가장 낮은 위치에 아래로 초점을 맞 춥니 다. 설정 마지막을 클릭합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다.
- 간격을 선택; 1.01 μm의 현재 연구에 사용되며, 선택 간격은 슬라이스의 개수를 설정하는 최적 클릭함으로써 이루어질 수있다.
- 시작 실험을 클릭합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 표면적 및 성상 세포 영역의 용적, 전체 성상 세포를 포함 브래지어 :이 이미지는 다음과 같은 파라미터의 측정에 사용한다nches, 세포체 및 핵.
- 단계 3.6에서 3.11 사이에 기술 된 바와 같이 또는 10X 20X 대물 렌즈를 이용하여 2 차원 화상을 취득. 이 이미지는 측정 된 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개수 / 1,000 ㎛의 2)의 강도를 이용할 수있다.
4. 성상 세포 밀도와 GFAP + 형광 강도
- 20X 2D 이미지를 엽니 다. 이미지 창 왼쪽에있는 히스 (Hisogram)을 클릭합니다.
- 성상 세포 밀도를 계산하려면, 20X 목표 아래 세 개의 연속 시야를 선택합니다. 필드에 지점을 중복, 최소 명확한 소마을 나타내는 성상 세포의 수를 계산합니다.
- 형광 강도를 정량화하기 위해, 이미지 윈도우의 바닥 글에 적절한 도구 (사각형 또는 원형)을 선택하고, 측정 영역을 선택합니다. 평균값과 표준 편차에 따라 자동으로 표시 이미지 참고. STR 간의 현재 연구에서, 0.7 mm의 직사각형 영역 (2)iatum 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 내측 블레이드를 사용 하였다.
5. 성상 세포 지점
- 분기의 길이와 수를 정량화하는, 화상 해석 소프트웨어 (20X으로 얻은) 3D 이미지를 사용한다. 선택한 성상 세포의 각 지점의 길이를 따라 수동으로 선을 그립니다. 그런 다음 라인 길이를 측정하는 전문 측정 툴을 선택합니다. 분기의 수를 정량화하기 위하여, 표시 항목의 수를 카운트하는 카운트 수단을 선택한다.
6. 볼륨 및 표면적
참고 : 3D 이미지 분석 소프트웨어에서 수동으로 구조를 표시 초점과 훈련을 필요로한다. 실험을 시작하기 전에 몇 번 연습.
- 성상 세포의 핵, 소마, 세포체와 영토의 부피와 표면적을 정량화하기 위해, 같은 Volocity 6.1로 3D 이미지 분석 소프트웨어 (단계 3.1-3.16에 인수) 3D 이미지를 전송합니다.
- 소프트웨어를 열고 새로 만들기도서관. 새 라이브러리에서 왼쪽 회색 컬럼에 모든 이미지를 드래그합니다. 그런 다음, 하나의 3D 이미지를 선택합니다. 오른쪽에, 다른 색상으로 다른 채널이 있습니다. 관심의 한 채널을 켜십시오; 예를 들어 DAPI에 대한 파란색 채널은 핵을 측정 할 때. 최적의 대비를 얻기 위해 수동으로 밝기를 변경합니다.
- [도구] 메뉴를 선택, 볼륨을 확인하고 Z 스택 이미지에서 하나의 3D 이미지를 생성로 이동합니다. 편집 메뉴에서 속성을 클릭하고 X는, Y 및 Z 속성이 제시되어 있는지 확인; 그렇지 않으면 차원 분석을 수행하는 것이 불가능하다.
- 도구 모음에서 자유형 RIO 도구 아이콘을 클릭합니다. 성상 세포 핵의 부피와 표면적을 측정하는 것은 DAPI 표지 된 핵 주위에 선을 그린다.
- 성상 전지 본체의 부피와 표면적을 측정하는 것은 분기 제외한 주위 소마 선을 그린다.
- 전체 성상 세포 (지점 포함 세포체)의 부피와 표면적을 측정하려면 다음 소마 주위에 선을 그립니다모든 지점의 표면.
- 성상 세포 영토의 부피와 표면적을 평가하는 것은 가지의 팁 사이에 선을 그립니다.
참고 : 눌러 원하지 않는 그림을 지울 키보드 삭제합니다. - 측정 프로토콜을 만들 수있는 이미지 창 상단의 측정 메뉴를 클릭; 다른 도구를 포함하는 창이 열립니다.
- 드래그는 윈도우 (창)의 상단에 개체를 찾을 수 있습니다. , 인구 1로 설명하는 이름을 부여 관련된 색상을 선택하고 측정을 클릭합니다. 또 다른 창이 열립니다.
- 매개 변수 즉, 볼륨 또는 표면 영역을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 데이터는 테이블에 나타납니다.
- 측정 메뉴에서 데이터를 클릭 저장 및 측정 항목 만들기를 선택합니다.
- 열린 창에서 호출 새로운 측정 항목을 선택합니다. 그런 다음 데이터에 이름을 지정하고 확인을 클릭합니다.
- 마지막으로, 그래프 패드로 통계 소프트웨어로 데이터를 내보내거나 프로그램을 엑셀. 데이터를 분석하는 t 테스트를 사용하여 다음 2D GR 플롯aphs.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 섹션은 3 차원 형태 계측 분석에 의해 생성 된 정량적 관찰의 예를 나타낸다. 앞서 언급 한 12 개의 모든 매개 변수의 완전한 결과를 위해, 우리의 이전 출판 (10)를 참조하십시오.
질적 관찰
성상은 Aβ 1-40 주입 쥐 (그림 1)에서 긴 보통이었다 얇거나 두꺼운 가지를 나타냈다. 짧은 지사와 함께 몇 가지 작은 별 모양의 성상 세포는 대뇌 피질에서 관찰되었고, 성상 세포의 소형 네트워크는 뇌량에서 발생했습니다.
제니스 타인 처리하여 Aβ 1-40 -injection와 동물의 뇌 조직에서 성상 세포 (그림 2) 10 짧고 얇은 분기 별 모양의 형태를 보였다. 성상 세포는 몇 위축성 모습을 보였다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 프로토콜에서, 우리는 성상 세포의 형태와 관련이 있었다 (12) 다른 매개 변수를 평가하는 3D 공 초점 형태 계측을 고용했다. 이러한 목적을 위하여, Aβ 1-40와 쥐의 해마 조직 - 또는 소염제로서 게니 전처리없이 유도 astrogliosis가 사용되었다. 3D 이미지 및 형태 계측 학적 소프트웨어를 사용하여, 우리는 아스트로 사이트의 형태 즉 astrogliosis에 제니스 타인 효과를 표시 할 수 있었다.
뇌 조직의 세포 외 인트라 및 환경의 변화는 세포 / 조직의 체적 및 / 또는 크기를 변경할 수있다. 이러한 변화는 다양한 뇌 손상 3,11에서 병리학 적 특징으로 간주됩니다. 이러한 변화를 정량화하기 위해, 다수의 기술이 사용된다. 대부분의 연구는 단지 CE의 작은 부분에 대한 정보를 제공 또는 라이트 - 전자 현미경 (EM)에 의해 캡쳐 된 2 차원 저해상도 영상을 기반으로하여LL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이 작품은 의료 과학 대학이란 (테헤란,이란)에서 외스 테르 예틀 란드의 지방 협의회, (스웨덴)과 세포 및 분자 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.
감사의 글
저자는 공개할 것이 없습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아밀로이드 베타 1-40 | 시그마 Aldrich | 79793 | -70 °에 보관하십시오. C |
| Genistein | 시그마 Aldrich | 446-72-0 | -20 °에서 유지; 신경 |
| 단백질에 대한 C 다결장 토끼 항체 | DAKO | Z0334 | |
| 알칼리성 인산염 결합 돼지 항토끼 IgG 항체 | DAKO | ||
| 액체 영구 발색 DAKO | K0640 | ||
| 액체 영구 적색 기질 버퍼 | DAKO | K0640 | |
| 크레모퍼 EL | 시그마 알드리치 | 27963 | 폴리에톡실화 피마자유-단계 1.1 |
| LSM 700 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 Carl | Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| 이미지 분석 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
참고문헌
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
