성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

Summary

CNS의 성상세포는 유해한 자극에 반응하여 기능적, 구조적 특성을 변화시킵니다. 이 보고서는 질병 상태 또는 치료 개입 후 3차원 성상세포 형태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

뇌 신경 교세포 같이, 성상 세포는 중추 신경계에서의 다양한 기능적 역할이있다. 유해 자극의 존재에서, 성상 세포는 기능 및 구조적 특성, 반응 astrogliosis라는 조건을 수정합니다. 여기에, 성상 세포의 형태 학적 특성 평가를위한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 지점 표면적 및 성상 세포 (성상 세포 지역)에 의해 덮여 조직, 지점, 전지 본체와 핵을 포함하는 전체 성상 세포의 부피, 즉 12 가지 파라미터 부량뿐 아니라 전체 길이 및 개수를 포함하는, 강도 성상 검출에 사용되는 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 ^2)의. Volocity 6.3 측정에 사용 된 것처럼이 목적을 위해 3 차원 (3D) 공 촛점 현미경 이미지를 생성하고, 3D 이미지 분석 소프트웨어 등 하였다. 아밀로이드 베타 _1-40에 노출 된 쥐의 뇌 조직 1-40) 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 또는 시험관 내 조건에서의 어느 하나로부터 다른 셀의 3 차원 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다.

Introduction

건강한 중추 신경계 (CNS)에서 별아교 세포는 혈류, 에너지 대사, 시냅스 가소성과 기능 및 세포 외 이온의 조절에 중요한 역할을하는 신경 전달 물질 및 ^1-3 항상성. 또한, 성상 세포는 다른 유해한 자극 및 비대, 증식 및 성상 세포 ^4,5의 기능 리모델링을 특징으로 반응 astrogliosis을 통해 외상, 감염, 허혈 또는 ​​신경 퇴행과 같은 비정상적인 상태에 응답합니다.

반응성 astrogliosis은 치료 개입의 임상 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 조직에 염증 반응 및 복구 과정을 설계하고있다. 따라서, 성상 교세포는 중추 신경계에 영향을 미치는 질병의 다양한 치료 적 개입에 대 한 잠재적 인 대상으로 지난 수십 년 동안 신경 과학자로부터 주목을 받았다.

성상 세포는 일반적으로 잘-D와 별 모양이소마 ⁶ 퍼져 efined 가지. 뇌 질환 상태에서, 성상 세포는 복잡한 분기되고 베타 아밀로이드 (Aβ)의 존재하에, 예를 들면 팽윤 ^{(7) 단부를} 나타낸다.

이 문서에서는 공 초점 현미경으로 인수 성상 세포의 3D 이미지를 분석하기위한 프로....

Protocol

본 연구는 의료 과학이란 대학의 윤리위원회 (테헤란,이란)의 승인을 실험실 동물의 관리 및 사용 (NIH)에 대한 설명서에 명시된 정책에 따라 실시 하였다.

1. 동물, 수술 및 시료 준비

참고 : 3D 공 초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다.

1. 두 그룹으로 무작위로 나누기 동물 : Aβ _1-40 -injection (N = 8)과 제니스 타인 처리와 Aβ _1-40 -injection (N = 8); 수술 전 위관 1 시간으로 제니스 타인 (예 : 폴리에 피마 자유 등의 차량에 희석하여 10 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다.
2. 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취. 발가락을 곤란하게 한 후 철수 반사의 부족으로 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용합니다.
3. 정위 장치 및 면도 헤드에서 동물을 놓습니다. IOD 적용오프라인 용액 두피 절개 전에 청소 및 감염의 위험을 최소화하기 위해 수술 중 무균 조작 위치를 유지한다. 쥐의 뇌 아틀라스 ⁸ 항에있어서, 브레 그마에 -3.5 mm 후방, 중간....

Results

이 섹션은 3 차원 형태 계측 분석에 의해 생성 된 정량적 관찰의 예를 나타낸다. 앞서 언급 한 12 개의 모든 매개 변수의 완전한 결과를 위해, 우리의 이전 출판 ^(10)를 참조하십시오.

질적 관찰

성상은 Aβ _1-40 주입 쥐 (그림 1)에서 긴 보통이었다 얇거나 두꺼운 가지를 나타냈다. 짧은 지사와 함께 몇 가지 작은 별 모양의 성상 세포는 대뇌 피질에서 관찰되었고, 성상 세포의 소형 네트워크는 뇌량에서 발생했습니다.

제니스 타인 처리하여 Aβ _1-40 -injection와 동물의 뇌 조직에서 성상 세포 (그림 2) ¹⁰ 짧고 얇은 분기 별 모양의 형태를 보였다. 성상 세포는 몇 위축성 모습을 보였다.

Discussion

현재 프로토콜에서, 우리는 성상 세포의 형태와 관련이 있었다 (12) 다른 매개 변수를 평가하는 3D 공 초점 형태 계측을 고용했다. 이러한 목적을 위하여, Aβ _1-40와 쥐의 해마 조직 _- 또는 소염제로서 게니 전처리없이 유도 astrogliosis가 사용되었다. 3D 이미지 및 형태 계측 학적 소프트웨어를 사용하여, 우리는 아스트로 사이트의 형태 즉 astrogliosis에 제니스 타인 효과를 표시 할 수 있었다.

뇌 조직의 세포 외 인트라 및 환경의 변화는 세포 / 조직의 체적 및 / 또는 크기를 변경할 수있다. 이러한 변화는 다양한 뇌 손상 ^3,11에서 병리학 적 특징으로 간주됩니다. 이러한 변화를 정량화하기 위해, 다수의 기술이 사용된다. 대부분의 연구는 단지 CE의 작은 부분에 대한 정보를 제공 또는 라이트 - 전자 현미경 (EM)에 의해 캡쳐 된 2 차원 저해상도 영상을 기반으로하여LL........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아밀로이드 베타 1-40	시그마 Aldrich	79793	-70 °에 보관하십시오. C
Genistein	시그마 Aldrich	446-72-0	-20 °에서 유지; 신경
단백질에 대한 C 다결장 토끼 항체	DAKO	Z0334
알칼리성 인산염 결합 돼지 항토끼 IgG 항체	DAKO
액체 영구 발색 DAKO		K0640
액체 영구 적색 기질 버퍼	DAKO	K0640
크레모퍼 EL	시그마 알드리치	27963	폴리에톡실화 피마자유-단계 1.1
LSM 700 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 Carl	Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
이미지 분석 2000	Tekno Optic
Streotaxic apparatus	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.