미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Summary

공동 배양은 신경과 표적 조직 및 장기 간의 상호 작용을 연구하는 귀중한 방법을 나타냅니다. Microfluidic 체계는 다른 배양 매체에 있는 신경절 및 전체적인 발달 기관 또는 조직을 CO 배양하는 것을 허용해, 따라서 신경세포와 그들의 표적 사이 누화의 생체외 학문을 위한 귀중한 공구를 대표

하.

Abstract

신경 분포는 기관 및 조직의 발달, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 그러나 이러한 현상의 기초가되는 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않는다. 특히, 치아 발달 및 재생의 신경 분포의 역할은 무시된다.

생체 내 연구의 여러 다양한 동물 모델의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나 이러한 접근 방법의 대부분은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다.

공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 유용한 방법을 구성한다. 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여 종래의 공동 배양이 매우 짧은 기간 동안 수행되었다 (예 이틀)감각 신경 섬유에 구강 및 치아 조직을 개발하는 매력 또는 반발 효과를 알아보고자 하였다. 그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사 할 필요가있다.

마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 우리는 최근 삼차 신경절 (TG) 및 치아 장기간 생존 할 수 있음을 증명하고있다 때 공 배양 미세 유동 장치에있어서, 그들이 이러한 조건들은 생체 내에서 보여 같은 신경 분포 패턴을 유지하는 것이다.

이를 바탕으로, 우리는 분리하고 미세 공 배양하면 시스템의 프로토콜에서 삼차 신경과 치아 세균을 개발하고 공동 문화가 간단하고 유연한 방법에 공동 배양 신경 / 신경과 표적 조직 등을 설명하는 방법을 설명하는 역할을 연구하기 제어 방식에서 이러한 상호 작용에 대한 특정 분자olled과 격리 된 환경을 제공합니다.

Introduction

신경 분포는 기관 및 조직의 ^1,2- 개발, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. ^{5 -} 또한, 신경 분포는 줄기 세포의 증식, 분화 및 동원 ^(3)의 조절에 관여한다. 실제로, 구강 안면 복합체의 조직에서 실현하는 최근 연구는 부교감 신경이 타액의 발달 및 재생 ^{-6,7- 땀샘} 중에 상피 전구 세포의 기능을 위해 필요한 것으로 나타났다. ^{11 -} 마찬가지로,이 신경 분포는 입맛 ^(8)의 개발 및 유지 보수에 대한 필요가 있다고 입증되었다. 따라서, 예컨대 이빨 다른 중요한 구강 안면 기관 및 조직의 신경 분포의 개발에 아직 무시 역할을 분석하는 것이 중요하다.

성인 치아 풍부한 신경 분포에도 불구하고, 반면에 본체 develo의 다른 모든 기관 및 조직에핑 치아는 생후 초기 단계에서 신경 지배되기 시작. 치아는 구강 외배엽과 두개골 신경 능선 유래 중간 엽 사이의 순차 및 상호 작용의 결과로 개발한다. 이러한 상호 작용은 상피 유래 ameloblasts 에나멜과 상아질, 각각 ^(12)의 형성에 대한 책임이 있습니다 중간 엽 유래 상아 아세포에 상승을 제공합니다. ^{(15) -} 우수한 ....

Protocol

모든 마우스는 스위스의 동물 복지법에와 칸톤 수의학 사무실, 취리히의 규정에 따라 유지 관리 및 처리되었다.

해부 소재, 문화 미디어, 미세 유체 장치 1. 준비

1. 오토 클레이브 마이크로 해부 집게와 가위 (121 ° C, 살균 시간 : 20 분) 및 멸균 용기에 보관.
2. 37 ° C에서 진탕 기에서 24 시간 동안 1 M 염산으로 이들을 배양하여 커버 글라스 (24mm X 24mm)을 소독. 에탄올 99 %와 멸균 증류수로 ₂ O 3 배를 세 번 씻으십시오. 건조 후 37 ℃에서 또는 멸균 흐름 후드 된 커버. 마지막으로, 오토 클레이브 또는 살균을 완료하기 위해 자외선 (30 분)로 된 커버를 노출. 커버 슬립 후 70 % 에탄올에 저장 될 수있다.
3. 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 패키지에서 축 축삭 격리 장치를 제거하고 멸균 페트리 접시에 배치합니다.
4. 멸균 생검 펀치 사용 (O : 1mm은) 문화 챔버의 대응 샘플 당 하나의 구멍을 배양 할 (그림 1)를 작성합니다.
   참고 : 그들은 가해지는 압력에 의해 손상 될 수 있습니다로, 마이크로 그루브에 너무 가까이 펀치하지 마십시오.
5. 에탄올 ....

Results

이러한 결과는 절연 삼차 신경절은 절연 치아 세균의 개발은 미세 유체 소자의 다른 구획에서 장기간 지속되어, 추가로, 미세 유체 소자의 한 구획에서 성장할 수 있음을 나타낸다. 다른 문화 매체는 두 구획에 사용되는, 두 구획 사이의 마이크로 그루브가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절에서 축삭의 확장을 할 수 있습니다. 그림 3 마우스의 공동 문화, 면역 형광 ^(37)를 통해 신경 미세 섬유의 시각화를 나타냅니다 설명 미세 공동 배양 시스템에서 배아 삼차 신경절 및 마우스 배아 절치. 마우스 앞니가 생체 내에서 개발하는 동안 신경 지배되지 않습니다. 지속적으로, 삼차 신경절에서 축삭만큼 10 일 문화의 개발 치아 세균에 의해 폐지되는 그림 3a는이의 축삭 챔버의 개요를 보여줍니다 공동 배양 시스템. 그림 3B 및 3C 쇼 축삭 챔버 및 마이크로 숲 내의 신경 .......

Discussion

치아의 신경 분포의 시험 관내 연구에서 이전은 삼차 신경절 및 치아 조직 또는 세포 ^26,28,29의 기존의 공동 문화를 기반으로했다. 이러한 연구는 주로 감각 축색 돌기 ^(38)에이 세포 또는 조직의 매력적인 효과를 조사하기 위해 실시 하였다. 분야에서 상당한 발전을 가져 있지만, 몇 가지 기술적 인 문제가 발생했다. 치아 세균은 문화 ^(37)의 몇 일 후에 퇴화하기 시작합니다. 이러한 관찰에 기초하여, 동일한 배양 조건에서 성장하는 뉴런과 이빨이 두 조직 사이의 크로스 토크에 관여하는 분자의 임의의 최종 분석을 손상. 최적의 배양 조건은 삼차 신경절 및 치아 조직의 생리 분자량 프로파일을 유지하기 위해 필요하다.

마이크로 유체 시스템은 최적화 된 미디어 ^{(34, 36)에} 다양한 신경 세포 유형의 공동 - 배양 지금까지 사용되어왔다. 이 마이크로 유체 시스템은 더 믿음을 나타낼 수.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	다양한 길이의 마이크로채널 사용 가능
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
재조합 마우스 beta-NGF	R& D 시스템	1156-NG-100	인간 및 쥐 베타-NGF(R& D Systems)는
DMEM-F12	Gibco	11320-033