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방법 논문

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53114

⸱

2015년 8월 14일

 ,  , 
1Institute of Oral Biology, Unit of Orofacial Development and Regeneration, University of Zurich

이 논문에서

요약

공동 배양은 신경과 표적 조직 및 장기 간의 상호 작용을 연구하는 귀중한 방법을 나타냅니다. Microfluidic 체계는 다른 배양 매체에 있는 신경절 및 전체적인 발달 기관 또는 조직을 CO 배양하는 것을 허용해, 따라서 신경세포와 그들의 표적 사이 누화의 생체외 학문을 위한 귀중한 공구를 대표

하.

초록

신경 분포는 기관 및 조직의 발달, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 그러나 이러한 현상의 기초가되는 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않는다. 특히, 치아 발달 및 재생의 신경 분포의 역할은 무시된다.

생체 내 연구의 여러 다양한 동물 모델의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나 이러한 접근 방법의 대부분은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다.

공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 유용한 방법을 구성한다. 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여 종래의 공동 배양이 매우 짧은 기간 동안 수행되었다 (예 이틀)감각 신경 섬유에 구강 및 치아 조직을 개발하는 매력 또는 반발 효과를 알아보고자 하였다. 그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사 할 필요가있다.

마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 우리는 최근 삼차 신경절 (TG) 및 치아 장기간 생존 할 수 있음을 증명하고있다 때 공 배양 미세 유동 장치에있어서, 그들이 이러한 조건들은 생체 내에서 보여 같은 신경 분포 패턴을 유지하는 것이다.

이를 바탕으로, 우리는 분리하고 미세 공 배양하면 시스템의 프로토콜에서 삼차 신경과 치아 세균을 개발하고 공동 문화가 간단하고 유연한 방법에 공동 배양 신경 / 신경과 표적 조직 등을 설명하는 방법을 설명하는 역할을 연구하기 제어 방식에서 이러한 상호 작용에 대한 특정 분자olled과 격리 된 환경을 제공합니다.

서론

신경 분포는 기관 및 조직의 1,2- 개발, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 5 - 또한, 신경 분포는 줄기 세포의 증식, 분화 및 동원 (3)의 조절에 관여한다. 실제로, 구강 안면 복합체의 조직에서 실현하는 최근 연구는 부교감 신경이 타액의 발달 및 재생 -6,7- 땀샘 중에 상피 전구 세포의 기능을 위해 필요한 것으로 나타났다. 11 - 마찬가지로,이 신경 분포는 입맛 (8)의 개발 및 유지 보수에 대한 필요가 있다고 입증되었다. 따라서, 예컨대 이빨 다른 중요한 구강 안면 기관 및 조직의 신경 분포의 개발에 아직 무시 역할을 분석하는 것이 중요하다.

성인 치아 풍부한 신경 분포에도 불구하고, 반면에 본체 develo의 다른 모든 기관 및 조직에핑 치아는 생후 초기 단계에서 신경 지배되기 시작. 치아는 구강 외배엽과 두개골 신경 능선 유래 중간 엽 사이의 순차 및 상호 작용의 결과로 개발한다. 이러한 상호 작용은 상피 유래 ameloblasts 에나멜과 상아질, 각각 (12)의 형성에 대한 책임이 있습니다 중간 엽 유래 상아 아세포에 상승을 제공합니다. (15) - 우수한 경추 신경에서 삼차 신경과 교감 신경의 감각 신경은 성인 치아 (13)을 신경을 분포시키다. 배아 동안, 신경 섬유가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절 프로젝트에서 나오는 점진적으로 그들을 둘러싸고 있지만 치과 유두 중간 엽 (13)에 침투하지 않습니다. 신경 섬유는 상아질 모세포의 분화와 상아질 매트릭스 증착 (16)와 상관 관계가 더 진보 된 발달 단계에있는 치과 펄프 중간 엽를 입력합니다. 치과 펄프 신경 분포는 COMPL입니다eted 곧 구강 (13) 치아 폭발 후. 19 - 다양한 semaphorins 및 뉴로이 odontogenesis 16시 신경 분포의 조절에 관여하는 것으로 이전의 연구 밝혀졌다. 이전 연구는 명확하게 신경 분포가 물고기 (20)의 치아 형성을위한 전제 조건임을 증명하고있다. 최근의 연구는 소닉 고슴도치 (쉬) (21)의 분비를 통해 감각 신경에 의해 조절된다 마우스 앞니 치과 간엽 줄기 세포의 항상성을 보여 주었다. 24 - 그럼에도 불구하고, 치아 개시, 개발 및 재생에 신경 분포의 역할은 여전히 포유 동물 (22) 매우 논쟁의 여지가있다.

생체 내 연구의 과다는 다양한 동물 모델 13,25,26의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나, 이들의 대부분은 아프로통증은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다. 29 - 공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경 (26)에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 가치있는 방법을 구성한다. 동시에, 공동 배양은 다양한 기술에 따라 조정된다. (32) - 예를 들어, 신경 및 특정 치아 조직 (예를 들면, 치과 펄프, 치과 대과, 치과 상피) 종종 30 시간의 긴 기간 동안 조직의 생존을 보장하기 위해 서로 다른 배지를 필요로한다.

29 - 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여, 종래의 공 배양 감각 신경 섬유 (27)에 구강 및 치아 조직의 개발은 매력적인 또는 반발 효과를 조사하기 위해 매우 짧은 기간 (예 이틀)에 대해 수행되었다.그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사하고, 표적 기관 내의 분기 신경 섬유의 역학을 연구 할 필요가있다. 따라서, 비 연속 공동 문화는 신경 - 치아 조직의 상호 작용에 대한 연구를 수행하는 것이 더 적합 할 것입니다.

마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 그들의 표적 조직 (33)을 포함 함을 향해 마이크로 채널을 통해 신경 세포체에서 축삭 성장을 허용하면서 이러한 장치에서, 치아 조직 및 신경 세포는 다른 구획으로 분리된다. 미세 유체 장치가 이미 암 및 혈관 신생 (35)에 세포 상호 작용에 뉴런과 마이크로 글 리아 (34, 35) 사이의 상호 작용뿐만 아니라 세포를 연구하기 위해 사용되었다. 더욱이, 이러한 시스템은 DORS 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다알 루트 신경과 조골 세포 (36).

우리는 최근 삼차 신경절 (TG)와 치아를 오랜 기간 동안 생존 할 수 있음을 입증 한 경우 공동 배양 한 미세 유체 장치 (37)에. 또한, 우리는 다른 발달 단계에서 이빨이 체외 조건들이 생체 (37)에 표시 삼차 신경 분포에 같은 반발 또는 매력적인 효과를 유지하고 있음을 증명하고있다. 이 프로토콜은 간단하고 강력하고 유연한 방식으로하는 공동 배양 신경 / 신경과 대상 조직 및 제어 및 격리 된 환경에서 이러한 상호 작용의 특정 분자의 역할을 연구에 대한 정보를 제공합니다.

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프로토콜

모든 마우스는 스위스의 동물 복지법에와 칸톤 수의학 사무실, 취리히의 규정에 따라 유지 관리 및 처리되었다.

해부 소재, 문화 미디어, 미세 유체 장치 1. 준비

  1. 오토 클레이브 마이크로 해부 집게와 가위 (121 ° C, 살균 시간 : 20 분) 및 멸균 용기에 보관.
  2. 37 ° C에서 진탕 기에서 24 시간 동안 1 M 염산으로 이들을 배양하여 커버 글라스 (24mm X 24mm)을 소독. 에탄올 99 %와 멸균 증류수로 2 O 3 배를 세 번 씻으십시오. 건조 후 37 ℃에서 또는 멸균 흐름 후드 된 커버. 마지막으로, 오토 클레이브 또는 살균을 완료하기 위해 자외선 (30 분)로 된 커버를 노출. 커버 슬립 후 70 % 에탄올에 저장 될 수있다.
  3. 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 패키지에서 축 축삭 격리 장치를 제거하고 멸균 페트리 접시에 배치합니다.
  4. 멸균 생검 펀치 사용 (O : 1mm은) 문화 챔버의 대응 샘플 당 하나의 구멍을 배양 할 (그림 1)를 작성합니다.
    참고 : 그들은 가해지는 압력에 의해 손상 될 수 있습니다로, 마이크로 그루브에 너무 가까이 펀치하지 마십시오.
  5. 에탄올 70 %에이를 immerging에 의해 축 축삭 격리 장치를 소독. 완전히 멸균 흐름 후드 아래에 드라이 후 축 축삭 격리 장치 및 커버 슬립. 진행하기 전에 3 시간의 최소를 기다립니다.
    참고 : 완전 건조는 미세 유체 장치의 결함 조립 발생합니다.
  6. 6 웰 플레이트에서 35mm 페트리 접시로 또는 우물에 각 coverslip에 배치합니다.
  7. 분리 장치와 유리 커버 슬립 사이의 완전한 접착력을 허용하기 위해 구부러진 끝 핀셋으로 조심스럽게 단단히 coverslip에 키를 누릅니다에 축 축삭 격리 장치를 놓습니다.
  8. 각 배양 챔버 내에, 피펫 폴리 D 라이신 150 μL (멸균 된 0.1 ㎎ / ㎖는, H 2 증류수O). 배양 챔버로부터 모든 공기를 제거하기 위하여 5 분 동안 진공 하에서 미세 유동 장치를 놓는다.
  9. 공기는 여전히 챔버 재 피펫 내의 챔버로 폴리 D 라이신 용액을 알 수있는 경우.
  10. 37 ° C에서 폴리 D 리신 O / N을 갖는 장치를 부화.
  11. 멸균 증류수 H 2 O와 챔버를 세 시간을 씻으십시오
  12. 150 (PBS에서 시그마 - 알드리치, 5 μg의 / ㎖, 또는 무 혈청 배지) μL 라미닌 작업 솔루션으로 챔버를 입력하고 37 ℃에서 O / N을 품어.
  13. 다음으로 이루어지는, 삼차 신경절 배양 37 배지 50 ㎖를 준비한다 : 48 ml의 배지로 Neurobasal 배지 1 mL의 B-27 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 5 NG / ㎖ 신경 성장 인자 (100) U (NGF) 0.25 오후 시토신 아라 비노 시드.
  14. 40 ㎖의 DMEM-F12, 10 mL의 소 태아 혈청 (FBS, 최종 농도 : 20 %)은 다음과 같이 이루어지는 치아 세균 배양 37 배지 50 ㎖를 준비, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 150 μg의 / ㎖ 아스코르브 산.

2. 마우스 배아 생성 및 해부

  1. (질 플러그 : 개발 0.5, E0.5의 배아 일) 질 플러그에 따라 배아 나이를 결정하고 형태 학적 기준을 통해 그것을 확인합니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 일반적으로 E14.5-E17.5 마우스 배아를 사용합니다.
  2. 해부 영역과 에탄올 70 %와 입체경을 청소합니다.
  3. 자궁 경부 전위를 통해 임신 어머니를 희생. 그리드에 제 1 및 제 2 손가락으로 마우스의 목을 차단하고, 결정 꼬리를 잡아 당깁니다.
  4. 낮은 복부 주위 피부를 해부하고, 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 자궁을 찾습니다 임신의 늦은 단계에서, 자궁이 풍부 복강을 입력합니다.
  5. 얼음에 PBS로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 때 얼음에, 조직은 여러 시간 동안 남아있을 수 있습니다. 제도적 지침에 따라 어머니의 시체를 버리고
    6. <리> 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 무료로 제공됩니다. 얼음에 PBS에서 배아를 놓습니다.
  6. 가위를 이용하여 배아 목을 벨, 마이크로 해부 가위 (도 2A)를 사용하여 헤드의 나머지 아래턱을 분리한다. 삼차 신경에 손상을주지 않고, 정확하게 아래턱을 제거; 후자는 아래턱에 근접 지역화 같이 그들의 사고 손상이 가능하다. 얼음에 아래턱과 차가운 PBS의 머리의 나머지 부분을 보존합니다.
  7. TG를 해부하기 위해 머리를 가지고 이전에 차가운 PBS로 가득 해부 유리 페트리 접시, 위에 놓습니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다. 다음 telencephalon 및 telencephalon 및 리프트 아래 집게를 배치하여 소뇌를 제거; telencephalon 및 소뇌 노출 두개골의 바닥을두고 함께 플립 것이다.
  8. (도 2b에 도시) 삼차 신경절 지역화. 집게를 사용하여삼차 신경에서 TG를 분리합니다. 칼으로 해부 바늘을 사용하여 삼차 돌기의 잔해를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 TG를 놓고 얼음에 보관하십시오.
  9. 차가운 PBS로 가득 이전 해부 유리 페트리 접시에, 두개골에서 분리 아래턱을, 배치, 배아 치아를 해부합니다. 칼 같이 해부 바늘을 사용하여, 혀와 턱 주변의 피부를 제거한다. 턱의 중심선을 따라 절단하여 좌우 헤미 턱 별개. 도 1c에 도시 한 바와 같이 치아 세균은 쉽게 볼 수있다. 해부 바늘을 사용하여 치아의 세균을 분리하고 비 치아 조직의 초과를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 치아 세균을 놓고 얼음에 보관하십시오.

3. 미세 유체 공동 문화

  1. 절개 후 미세 유체 장치에서 라미닌를 제거합니다. respecti 200 μL와 챔버를 채우미디어를했습니다.
  2. 집게로 (그림 1D)를 펀칭에 의해 생성 된 구멍에 ​​조심스럽게 해부 TG 치아 세균을 전송합니다. 치아의 세균이 떠 있지 않은지 확인하고이 된 커버에 닿을 때까지 그들은 침몰있다.
  3. 배양 37 ° C의 배양기에서 샘플, 5 % CO 2.
  4. 문화 매체마다 48 시간을 변경합니다. 완전히 챔버를 버리지 말 것, 그리고 문화 실에 직접 피펫하지 않습니다. 챔버 내의 기포의 형성을 초래 챔버 전체 비우는; 챔버에 직접 피펫은 축삭 손상을 초래할 것입니다. 우물의 외부 쪽을 향해 피펫을 가리키는 매체를 제거, 이러한 문제를 방지하려면; 마찬가지로, 챔버에 대향 위치한 웰의 측면에 새로운 배지를 피펫.
  5. 배양 기간 동안 공동 배양을 용이하게 시간 경과 현미경으로 묘화 될 수있다. 공동 배양은 10 일 이상 동안 유지 될 수있다.
  6. 문화 perio 후D는 실 당 하나의 우물에 PBS 150 μl를 피펫 팅하고, PBS를 실을 통해 세 번 흐를 수 있도록함으로써 실을 씻는다.
  7. PBS를 제거하고 챔버 당 하나의 잘 파라 포름 알데히드의 150 μL (PBS)에 4 %를 피펫 팅하여 샘플을 수정; 실온에서 15 분 동안 품어.
  8. 3.6에 기술 된 바와 같이 PBS로 두 번 챔버를 씻으십시오.
  9. 추가 분석을 진행합니다.

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결과

이러한 결과는 절연 삼차 신경절은 절연 치아 세균의 개발은 미세 유체 소자의 다른 구획에서 장기간 지속되어, 추가로, 미세 유체 소자의 한 구획에서 성장할 수 있음을 나타낸다. 다른 문화 매체는 두 구획에 사용되는, 두 구획 사이의 마이크로 그루브가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절에서 축삭의 확장을 할 수 있습니다. 그림 3 마우스의 공동 문화, 면역 형광 (37)를 통해 신경 미세 섬유의 시각화를 나타냅니다 설명 미세 공동 배양 시스템에서 배아 삼차 신경절 및 마우스 배아 절치. 마우스 앞니가 생체 내에서 개발하는 동안 신경 지배되지 않습니다. 지속적으로, 삼차 신경절에서 축삭만큼 10 일 문화의 개발 치아 세균에 의해 폐지되는 그림 3a는이의 축삭 챔버의 개요를 보여줍니다 공동 배양 시스템. 그림 3B 및 3C 쇼 축삭 챔버 및 마이크로 숲 ...

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토론

치아의 신경 분포의 시험 관내 연구에서 이전은 삼차 신경절 및 치아 조직 또는 세포 26,28,29의 기존의 공동 문화를 기반으로했다. 이러한 연구는 주로 감각 축색 돌기 (38)에이 세포 또는 조직의 매력적인 효과를 조사하기 위해 실시 하였다. 분야에서 상당한 발전을 가져 있지만, 몇 가지 기술적 인 문제가 발생했다. 치아 세균은 문화 (37)의 몇 일 후에 퇴화하기 시작합니다. 이러한 관찰에 기초하여, 동일한 배양 조건에서 성장하는 뉴런과 이빨이 두 조직 사이의 크로스 토크에 관여하는 분자의 임의의 최종 분석을 손상. 최적의 배양 조건은 삼차 신경절 및 치아 조직의 생리 분자량 프로파일을 유지하기 위해 필요하다.

마이크로 유체 시스템은 최적화 된 미디어 (34, 36)에 다양한 신경 세포 유형의 공동 - 배양 지금까지 사용되어왔다. 이 마이크로 유체 시스템은 더 믿음을 나타낼 수...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 취리히 대학의 자금 지원을 받았습니다. 저자는 공동 문화 조건을 확립하는 데 도움을 준 Estrela Neto와 Meriem Lamghari 박사에게 감사를 표

하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AXIS Axon Isolation DevicesMilliporeAX15010-TC다양한 길이의 마이크로채널 사용 가능
LamininSigma AldrichL2020
NeurobasalGibco21103-049
B27Gibco17504
재조합 마우스 beta-NGFR& D 시스템1156-NG-100인간 및 쥐 베타-NGF(R& D Systems)는
DMEM-F12Gibco11320-033
과 동등합니다.

참고문헌

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