방법 논문

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

31.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

2015년 10월 29일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

이 논문에서

요약

여기에서는 새로운 항바이러스제를 식별하고 평가하기 위해 바이러스 진입의 특정 단계를 검사하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 기반 시스템은 항바이러스제를 발견하는 데 유용합니다. 바이러스 수명 주기, 특히 초기 진입 단계를 해부하면 바이러스 진입의 특정 단계를 표적으로 하는 항바이러스제를 식별하고 평가할 수 있는 기계론적 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 본 보고서에서는 C형 간염 바이러스를 모델로 하여 바이러스 불활성화, 바이러스 부착 및 바이러스 진입/융합을 이러한 목적을 위한 항바이러스 분석법으로 검토하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 바이러스 조기 진입을 위한 새로운 길항제/억제제를 발견하는 데 유용하며 추가 약물 개발을 위해 후보 항바이러스제의 범위를 확장하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

바이러스 감염은 공중 보건에 대한 끊임없는 위협이며 전 세계적으로 전염병, 질병 및 사망의 중요한 원인입니다. 바이러스 감염을 통제하는 구체적인 방법에는 백신 개발과 항바이러스 요법이 포함됩니다. 백신을 개발하려는 노력이 여러 바이러스에 대한 면역을 성공적으로 입증했지만, 뎅기열 바이러스(DENV), 인간 거대세포바이러스(HCMV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 포함한 많은 바이러스 병원체는 보호 백신이 없는 상태로 남아 있습니다1-5. 반면에 항바이러스제는 예방적 백신을 사용할 수 없을 때 이러한 바이러스 감염을 관리하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 현재까지 공중 보건을 위협하는 바이러스 병원체의 수에 비해 허가되고 비용 효율적인 항바이러스제는 거의 없습니다. 더 중요한 것은 전 세계 여행의 증가와 급속한 도시화로 인해 비원주민 지역에 유입되는 바이러스 감염의 출현/재출현으로 인한 전염병 발병 위험으로 인해 상황이 악화되고 있다는 것입니다6. 최근 중증급성호흡기증후군(SARS) 바이러스, 인플루엔자 바이러스(H1N1, H5N1, H3N2, H7N9), DENV, 웨스트나일 바이러스(WNV), 홍역 바이러스(MV), 중동호흡기증후군(MERS) 바이러스, 에볼라바이러스 6-12 등으로 인한 발병은 면역 및/또는 치료제가 불가능한 상황에서 항바이러스제 개발의 필요성을 반영합니다. 또한 현재 사용되는 항바이러스제에 의해 약물 내성 감염이 발생할 수 있는 잠재적 위험이 항상 존재합니다. 따라서 이러한 신흥/재출현 바이러스 감염에 대한 항바이러스제의 범위를 지속적으로 개발하고 확장하는 것은 더 나은 관리 전략을 제공하고 공중 보건을 보호하는 데 필요합니다.

대부분의 항바이러스 요법은 바이러스 수명 주기의 중요한 단계를 매개하는 특정 바이러스 단백질 또는 보조 인자를 표적으로 하는 직접 작용 항바이러스제(DAA)로 구성됩니다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체인 아시클로비르(Acyclovir)는 헤르페스 바이러스 DNA 중합효소를 억제하고, 프로테아제 억제제인 보세프레비르(Boceprevir)와 텔라프레비르(Telaprevir)는 HCV NS3를 길항하며, 오셀타미비르(Oseltamivir)와 자나미비르(Zanamivir)는 감염된 세포에서 인플루엔자 바이러스 입자의 방출을 차단하는 뉴라미니다아제 억제제입니다13-15. 그러나 HIV gp41을 표적으로 하여 융합을 방지하는 Enfuvirtide와 HIV 공동 수용체 CCR5를 차단하여 바이러스 진입을 방지하는 Maraviroc을 포함하여 허가된 바이러스 진입 억제제는 거의 없습니다16. 바이러스 진입에 대한 새로운 길항제/억제제를 탐색하는 것은 바이러스 감염을 더 잘 관리하기 위해 작용 기전이 다른 다른 항바이러스제와 병용하는 것과 같은 예방 또는 치료 사용을 위한 추가 치료제를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다17-19.

항바이러스제의 식별에는 구조 유도 약물 설계 및 후보 약물 스크리닝 기반 전략이 포함될 수 있습니다. 시험제의 항바이러스 활성을 평가하는 방법에는 효소 활성의 생화학적 분석과 세포 기반 시스템에 의한 평가가 포함됩니다20-23. 세포 기반 시스템에서 바이러스 수명 주기는 진입 이벤트(부착, 융합, 코팅 해제), 복제 단계(바이러스 게놈 복제 및 단백질 번역) 및 비리온 방출(조립, 성숙 및 방출)과 같은 뚜렷한 감염 단계로 해부할 수 있습니다. 다양한 도구와 방법을 사용하여 각 특정 단계를 조사하도록 분석을 조정할 수 있기 때문에 이 접근 방식을 사용하면 분석된 개별 단계를 표적으로 하는 특정 작용 기전을 가진 잠재적인 후보 항바이러스제를 식별/검사할 수 있습니다. 예를 들어, 숙주 세포에 결합하기 전에 유리 바이러스 입자에 대한 약물 효과를 특이적으로 분석하기 위해 '바이러스 불활성화 분석'을 수행할 수 있습니다. 이 분석에서 바이러스는 테스트 약물과 함께 배양한 다음 세포 단층을 감염시키기 전에 약물을 적정하기 위해 희석되도록 합니다. 바이러스 부착 및 진입/융합 단계와 같은 추가 단계도 감염 중 온도를 변경하여 개별적으로 분석할 수 있습니다. 많은 외피 바이러스의 경우, 숙주 세포막에서의 바이러스 진입/융합은 37°C에서 크게 촉진되지만 일반적으로 4°C에서는 차단되어 바이러스 결합24-29에 영향을 미치지 않습니다. 마지막으로, 리포터 바이러스 또는 세포 시스템을 사용하면 이러한 연구를 용이하게 하고 고처리량 분석을 수행할 수 있습니다.

우리는 이전에 세포 기반 접근법을 사용했으며 잠재적으로 바이러스 진입을 길항하는 항바이러스 화합물을 검사하기 위해 다양한 외피 바이러스의 조기 진입을 해부했습니다30,31. 본 명세서에서는 바이러스 불활성화(viral inactivation), 바이러스 부착(viral attachment), 바이러스 진입/융합 분석(viral entry/fusion assay) 등 사용되는 다양한 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

참고 : 세포 배양 및 바이러스 감염과 관련된 모든 절차가 처리되는 샘플의 바이오 안전성 수준에 적합한 인증 바이오 안전성 후드에서 수행되었는지 확인합니다. 프로토콜을 설명하기 위해 사용 된 것으로, Gaussia 루시페라아제 리포터 - 태그 모델은 HCV 바이러스 (32)로서 사용된다. 대표적인 결과의 맥락에서, 화합물 chebulagic 산 (CHLA) 및 퓨니 칼라 (PUG)는 31 단계 초기 바이러스 진입 동안 세포 표면 글리코 사 미노 글리 칸 당 단백질과 바이러스의 상호 작용을 표적 후보 바이러스제로서 사용된다. 많은 바이러스 30,31,33,34의 진입을 방해하는 것으로 알려져 헤파린이 이러한 맥락에서 양성 대조군 처리로서 사용된다. 기본 바이러스학 기술에 대한 배경, 바이러스의 전파, 바이러스 역가를 결정하고, 플라크 형성 단위의 감염 량 (PFU)의 발현을 위해, 형성 단위 (FFU), 또는 감염 (MOI)의 다양성에 초점을, 독자는 다시는35를 참조 ferred. 종래 예 및 대표적인 결과에 도시 된 바이러스를 사용 최적화 조건, 리더를 표 1,도 1a 및도 2a에 나열된 참조 30-32,36-39뿐만 아니라 상세한 설명에 언급된다.

1. 세포 배양, 복합 준비, 복합 세포 독성

  1. 바이러스 감염 시스템을위한 각 세포주의 성장은 (표 1)를 분석한다. HCV를 들면, 둘 베코 개질 된 이글 배지, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 200 U / ㎖ 페니실린 G, 200 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신에 응 - 7.5 세포 성장 및 0.5 μg의 / ml의 암포 테리 B.
  2. 각각의 용매를 사용하여 시험 화합물을 제조 및 제어 예를 들어, CHLA 및 디메틸 설폭 시드에 퍼 (DMSO)에 용해; 멸균 두 번 증류수에 헤파린을 준비합니다. 모든 후속 희석을 위해, 문화 미디어를 사용합니다.
    참고 : 최종 승낙을시험 화합물로 치료 DMSO의 비율은 실험에서 1 % 이하이고; 1 % DMSO는 비교 분석에서 음성 대조군 처리에 포함된다.
  3. 이러한 XTT 같은 시약을 결정 세포 생존을 사용하여 바이러스 감염 세포에 대한 시험 화합물 (예를 들면, CHLA 및 PUG)의 세포 독성을 결정 (2,3- 비스 [2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐] -5- 페닐 아미노) 카르 보닐] -2H-수산화 테트라 졸륨) :
    1. HCV의 경우, 96 웰 플레이트에 응 - 7.5 세포 (웰 당 1 × 104 세포) 시드와 단층을 얻기 위해, 5 % CO 2 인큐베이터 O / N에서 37 ° C에서 배양한다.
    2. 중으로의 배양 웰에 DMSO 제어 (1 %) 또는 시험 화합물 및 퍼 CHLA 증가 농도 (EX. 0, 10, 50, 100, 및 500 μM)을 적용한다.
    3. 다음, 72 시간 동안 37 ° C에서 품어 접시에 매체를 버리고 두 번 인산염 완충 생리 식염수 200 μL (PBS)와 세포를 씻으십시오.
    4. assayin 100 μl를 추가g 웰 각각 XTT 기반 관내 독성 분석 키트에서 용액 XTT 포르 마잔을 제조 할 수 있도록 또 다른 3 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다.
    5. 492 nm의 파장에서 테스트를 마이크로 플레이트 리더 및 690 nm의 기준 파장과 흡광도를 결정한다.
    6. . 시험 화합물의 흡광도 및 용매 제어 참조 (예, 1 % DMSO '로'100 %, '1'× AS / 세포 생존율 (%) =로하고 다음 식을 이용하여 세포 생존 비율을 계산할 각각) 치료. 제조사의 프로토콜에 따라 이러한 그래프 패드 프리즘 소프트웨어로 분석에서 시험 화합물의 50 % 세포 독성 (CC 50)의 농도를 결정한다.

바이러스 감염 2. 판독

참고 : 바이러스 감염의 판독이 사용 된 바이러스 체제에 따라 다릅니다 및 상패 분석​​ 또는 MEA 등의 방법을 포함 할 수있다기자 - 태그 바이러스에서 기자 신호를 가감하는. 루시퍼 라제 리포터 활동을 기반 리포터-HCV 감염을 검출하는 방법에 대하여 설명한다.

  1. 감염된 우물에서 상층 액을 수집하고 4 ℃에서 5 분 동안의 microcentrifuge에 17,000 XG에 명확히.
  2. Gaussia 루시퍼 라제 분석 키트에서 루시페라아제 기질 50 ㎕의 상등액을 시험 20 μL를 혼합하고 직접적으로 제조자의 지시에 따라 조도계로 측정한다.
  3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 그래프 패드 프리즘 소프트웨어의 알고리즘을 사용하여 HCV 감염에 대한 시험 화합물의 50 % 유효 농도 (EC 50) 바이러스 억제 (%)을 결정하기위한 기준으로 빛 단위 (RLU)의 로그 10 HCV의 감염을 표현하고 계산한다.

3. 바이러스 불 활성화 분석

참고 : 여러 바이러스를 배양 기간의 예 바이러스 투여도 1a에 나열 재. 바이러스의 높은 농도는 MOI / PFU를 증가시킴으로써 테스트 될 수있다.

  1. 어 시드 - 7.5 96- 웰 플레이트에있는 세포 (웰 당 1 × 104 세포) 및 단층을 얻기 위해, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
  2. 시험 화합물 또는 컨트롤을 품어 (최종 농도는 다음과 같습니다 CHLA을 = 50 μm의; PUG = 50 μm의 헤파린 = 1,000 μg의 / ㎖, DMSO = 1 %) 37 ° C (그림 1A에서 HCV 입자와, '장기' ) 1 : 1의 비율. 예를 들어, 1 × 104를 함유 FFU 100 μL 바이러스 접종으로, 100 μM CHLA 작업 희석액 100 ㎕를 추가; 이것은 50 μM의 최종 농도 CHLA 처리를 산출한다.
  3. 바이러스 약물 혼합물을 시험 화합물에 "서브 치료"(무효) 농도를 희석. 예를 들어, HCV에 대한 CHLA와 퍼그 효과 농도는 1 μm의 31에있다; 따라서이것은 (2 % FBS와 함께 세포 배양 배지) 기본 배지 9.8 ㎖로 수행 될 수 바이러스 약물의 혼합물을 50 배 희석을 요구한다.
    주 : 서브 치료 농도에 희석 시험 화합물과 숙주 세포 표면 사이의 중요한 상호 작용을 방지하고, 무 세포 비리에 치료 효과를 조사 할 수있다. 이러한 희석은 특정 바이러스 감염에 대한 시험 화합물의 항 바이러스 투여 량 반응에 의존적이며, 특정 분석 (31)를 수행하기 전에 결정되는 것에주의.
  4. 비교를 위해 시험 화합물과 바이러스를 혼합하고 즉시 서브 치료 농도 전에 감염 (도 1a '단기')으로 (더 잠복기)를 희석하지 않는다.
  5. 및 바이러스 있도록 37 ° C에서 3 시간 동안 배양; 응 - 7.5 세포 단층 상 희석 HCV 약물 혼합물 100 μl를 추가 (최종 MOI = 0.01 바이러스의 양이 1 × 2 FFU에서 지금)흡착.
  6. 감염 후, 희석 접종을 제거하고 부드럽게 두 번 PBS 200 μL와 우물을 씻으십시오.
    참고 : 세포를 해제하지 않도록 부드럽게 세척을 수행합니다.
  7. 각 웰에 기초 배지 100 μl를 적용하고 72 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  8. 2 '에 설명 된대로 루시 페라 제 활동에 대한 상층 액을 분석하여 그 결과 감염을 분석합니다. 바이러스 성 감염의 판독 '.

4. 바이러스 첨부 파일 분석

참고 : 여러 바이러스를 배양 기간과 바이러스 투여의 예는,도 2a에 열거 된 '첨부 파일'됩니다. 바이러스의 높은 농도는 MOI / PFU를 증가시킴으로써 테스트 될 수있다.

  1. 어 시드 - 7.5 96- 웰 플레이트에있는 세포 (웰 당 1 × 104 세포) 및 단층을 얻기 위해, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
  2. 4 ° C FO에서 접시에 세포 단일 층을 사전 진정R 1 시간.
  3. HCV 접종과 세포 (MOI가 0.01 =) 및 시험 화합물 또는 컨트롤 공동-치료 (최종 농도는 다음과 같습니다 CHLA을 = 50 μm의, DMSO = 1 % PUG = 50 μm의; 헤파린 = 1,000 μg의 / ㎖) 4 ° C에서 3 시간. 예를 들어, 1 × 2를 함유 FFU 90 μL 바이러스 접종으로, 500 μM CHLA 작업 희석액 10 μL를 추가; 이것은 CHLA 50 μM의 최종 농도로 처리하고 MOI에서 HCV에 의한 감염 = 0.01 세포 단층에를 산출한다.
    참고 : 바인딩 바이러스 수 있지만 가장 효율적으로 37 ° C에서 발생하는 항목을 배제하기 때문에 그것은 4 ° C에서 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 온도가 4 ℃로 유지되는 것을 보장하기 위해 얼음에 바이러스 및 시험 화합물의 추가와 4 ° C 형 냉장고에 계속되는 배양을 수행합니다.
  4. 상층 액을 제거하고 부드럽게 두 번 얼음처럼 차가운 PBS 200 μL와 세포 단층을 씻는다.
    참고 : 세포를 해제하지 않도록 부드럽게 세척을 수행 <./ 리>
  5. 각 웰에 기초 배지 100 μl를 적용하고 72 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  6. 2 '에 설명 된대로 루시 페라 제 활동에 대한 상층 액을 분석하여 그 결과 감염을 분석합니다. 바이러스 성 감염의 판독 '.

5. 바이러스 성 항목 / 퓨전 분석

참고 : 배양 기간과 각종 바이러스에 대한 바이러스 투여의 예는 그림 2A '입 / 퓨전'에수록되어 있습니다. 바이러스의 높은 농도는 MOI / PFU를 증가시킴으로써 테스트 될 수있다.

  1. 어 시드 - 7.5 96- 웰 플레이트에있는 세포 (웰 당 1 × 104 세포) 및 단층을 얻기 위해, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
  2. 1 시간 동안 4 ℃에서 플레이트에서 세포 단층을 미리 차게.
  3. 3 시간 동안 39 ° C에서 HCV와 셀 (MOI를 0.01 =) 감염. 예를 들어, 1 × 2 FFU 함유 100 μL 바이러스 접종 물을 사용한다.
    참고 : ADDI를 수행얼음에 바이러스 접종 물과 4 ℃로 냉장고에 계속되는 인큐베이션 기 바이러스 결합이 아닌 엔트리를 허용하는 4 ℃에서 온도를 유지한다.
  4. 상층 액을 제거하고 부드럽게 두 번 얼음처럼 차가운 PBS 200 μL와 세포 단일 층을 씻는다.
    참고 : 세포를 해제하지 않도록 부드럽게 세척을 수행합니다.
  5. (최종 농도는 다음과 같습니다; PUG = 50 μm의; 헤파린 = 1,000 μg의 / ㎖, CHLA = 50 μm의 DMSO = 1 %) 시험 화합물 또는 컨트롤 우물을 치료하고 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 예를 들어, 미디어의 90 μL에 500 μm의 CHLA 작업 희석의 10 μl를 추가 혼합하고, 우물을 치료; 이것은 50 μM의 최종 농도 CHLA 처리를 산출한다.
    주 : 37 ° C에서 42 ° C에서 변화는 이제 바이러스 성 항목 / 퓨전 이벤트를 용이하게하고, 따라서이 특정 단계에 시험 화합물 '효과의 평가를 할 수 있습니다.
  6. 약물 함유 뜨는을 기음과 비 내면화 제거시트르산 완충액 (50 mM의 시트르산 나트륨, 4 mM의 염화칼륨, pH를 3.0) 또는 PBS 200 ㎕를 가진 하나 세척하여 세포 외 바이러스. 72 시간 동안 37 ℃에서 배양하기 전에 기초 배지 100 μl를 적용합니다.
  7. 2 '에 설명 된대로 루시 페라 제 활동에 대한 상층 액을 분석하여 그 결과 감염을 분석합니다. 바이러스 성 감염의 판독 '.

결과

도 1에서, '바이러스 불 활성화 분석은'개의 특정의 천연 화합물이 PUG CHLA 및 무 세포 상태의 다른 외피 바이러스를 불활 화 및 후속 감염을 예방할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 수행 하였다. 이들 화합물의 세포 독성 및 항 바이러스 투여 량 반응은 역학적 연구 (31)를 수행하기 전에 결정되어왔다. 바이러스는 시험 화합물로 전처리 한 후, 바이러스 - 약물 혼합물은 각 바이러스 시스템에 대한 각각의 세포 단층 상에 접종하기 전에 서브 치료 농도로 희석 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, CHLA 및 PUG 모두 후속 감염으로부터 세포를 보호 단층 비가역 효과의 결과로, 무 세포와 상호 작용하는 비리 나타났다. 80 % 블록 MV 및 RSV에 대해 관찰 하였다 - 60 반면 두 시험 화합물, HCMV, HCV, 및 DENV-2에 대해 100 % 가까이 억제를 달성했다. 이러한 결과 suggEST CHLA와 퍼그을 비활성화하고 자신의 감염을 중화하여 이러한 무료 바이러스 입자에 직접 영향을 미칠 수있다.

그림 2에서, 첨부 파일 및 항목 / 융합 분석은 HCMV, HCV, DENV-2, MV, 그리고 RSV에서 이러한 초기의 바이러스 성 항목 관련 이벤트에 대해 CHLA와 퍼그 효과를 탐험하기 위해 수행되었다. CHLA 및 PUG 모두 효과적으로 얻어진 바이러스 감염 (: 밝은 회색 막대도 2 '부착')에 의해 도시 된 바와 같이 저해 각 숙주 세포 상에 조사 바이러스의 결합을 억제. 두 화합물에 의한 바이러스 부착에 대한 억제 효과는 HCMV (도 2B), HCV (도 2c)에 대해 유사 하였다, DENV-2 (도 2D), 및 (90)에 이르기까지 RSV (도 2F), - 100 %. 한편, 퍼그 TW에서 저해율와 결합 MV (도 2e) CHLA 대해보다 효과적인 것으로 나타났다50-80% 사이 변화 O 화합물. 많은 바이러스의 침입, HCMV의 부착도 억제, DENV-2, RSV, MV 광고를 차단하는 것으로 알려져 있지만, HCV에 대해 덜 효율적이었다되는 제어 처리 헤파린. 계속되는 '바이러스 성 항목 / 융합 분석은'CHLA와 PUG 바이러스 항목 / 융합 단계에서 그들의 활동을 유지할지 여부를 검사 (그림 2, '입 / 퓨전': 어두운 회색 바). 각각의 세포 단층에 90 % 보호 효과 - (50)를 산출, - 다시, CHLA과 PUG 모두 효과적으로 검사 바이러스 (F 그림 2B)의 바이러스 성 항목 / 융합 단계를 저해하는 것으로 관찰되었다. 헤파린은 강력하게 억제 항목 / DENV-2와 RSV 감염의 융합,하지만 HCMV, HCV, 및 MV (<평균 40 % 억제)에 대한 덜 효과​​적이었다.

바이러스 세포의 종류
HCMV HEL
HCV 허 - 7.5
DENV-2 베로
MV CHO-SLAM
RSV HEP-2

표 1. 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 유형은 대표적인 결과에 기재된 각 시스템 바이러스 감염에 사용되는 세포 유형이 표시된다. 세포에 대한 추가 사항은 기준 (31)에서 찾을 수있다.

figure-results-1
그림 1. 시험 화합물 CHLA 및 PUG 의한 바이러스 감염의 불 활성화는 다른 바이러스가 장기간 동안 시험 화합물로 처리 하였다. (1.5 인큐베이션 - 적정 전에 3 시간; 밝은 회색 막대) 또는 단기간 (즉시 희석 어두운 회색 서브 치료 집중하고에 희석 전에 37 ° C에서 바)기 및 각각의 숙주 세포에 감염의 후속 분석. 최종 바이러스 농도 (왼쪽 그림) 실험 (A) 회로도 (PFU / 웰 또는 MOI), 장기 바이러스 약물 잠복기 (I) 및 (ii) 이후의 배양 시간은 오른쪽에 테이블의 각 바이러스에 대한 지시. (B) HCMV, (C) HCV에 대한 분석은, (D) DENV-2 (E) MV, 및 (F) RSV 각 추가 패널에 표시됩니다. 결과는 3 개의 독립적 인 실험에서 평균 (SEM)의 표준 오차 ± 수단은 바이러스 감염에 대한 DMSO 음성 대조군 처리 및 표시되는 데이터에 대해입니다 그려. 이 그림은 참조 (31)로부터 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
도 2 바이러스 부착 및 입 / 융합에 대해 시험 화합물의 CHLA 및 퍼 바이러스 활동의 평가. (A) 실험 절차, 바이러스 농도 (PFU / 웰 또는 MOI) 및 시험 화합물과 함께 첨가하고 처리 시간 (난, II, III) 회로도 및 관련 테이블의 각 바이러스되게됩니다. 바이러스 부착 분석 (밝은 회색 막대)에서, 상이한 유형의 세포의 단층을 1 시간 동안 4 ℃에서 사전 냉각 가한 다음 4 ℃에서 각각의 바이러스 및 시험 화합물과 함께 공동 - 치료 (1.5-3 시간; I) 후속 인큐베이션 inoculates 및 시험 화합물을 씻어 전에 (37 ° C, II) 및 바이러스 감염의 진단. 바이러스 진입 / 융합 분석 (어두운 회색 막대)에서, 시딩 세포 단층을 1 시간 동안 4 ℃에서 사전 냉각 후 1.5이었다 4 ℃에서 각각의 바이러스 도전 - 3 시간 (I). 세포는 그 다음이었다세정 온도가 바이러스 진입 / 융합 이벤트를 용이하게하기 위해 37 ° C로 시프트하고 (ⅱ) 동안 추가 배양 기간 동안 시험 화합물로 처리 하였다. 인큐베이션의 끝에, 세포 외 바이러스는 어느 시트르산 완충액 (pH 3.0) 또는 PBS 세척에 의해 제거하고, 세포는 또한 바이러스 감염 분석 (III)을 배양 하였다. (B) HCMV, (C) HCV에 대한 결과, (D) DENV-2 (E) MV, 및 (F) RSV 각 추가 패널에 표시됩니다. 데이터는 바이러스 감염의 DMSO 음성 대조군의 치료에 대해 플롯과 3 개의 독립적 인 실험 ± SEM 의미로 표현됩니다. 이 그림은 참조 (31)로부터 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 보고서에서는 초기 바이러스 침입 사건을 해부하는 기계론적 접근 방식을 기반으로 항바이러스 화합물을 식별하고 평가하는 방법을 설명했습니다. 특히, 분석을 통해 유리 바이러스 입자, 바이러스 부착 및 바이러스 진입/융합에 대한 테스트 화합물의 효과를 조사할 수 있었습니다. 초기 바이러스 침입의 특정 단계에 대한 약물 효과를 명확하게 평가하기 위해 중요한 단계가 구현되었습니다. 예를 들어, '바이러스 불활성화 분석'에서 바이러스-약물 혼합물을 치료 이하 농도로 희석하면 약물을 '적정'하여 시험 화합물과 숙주 세포 표면 사이의 상당한 상호 작용을 방지할 수 있습니다. 이것은 숙주 세포의 후속 감염에 대해 관찰된 억제 효과가 바이러스 수용체를 포함하는 숙주 세포막 또는 막 관련 분자에 대한 시험 화합물의 효과가 아니라 시험 화합물과 무세포 비리온 사이의 직접적인 상호작용에 기인한다는 것을 보장한다(30). 유사하게, '바이러스 부착 분석' 및 '바이러스 진입/융합 분석'에서 4°C(바이러스 결합은 허용하지만 진입은 허용하지 않음)와 37°C(바이러스 진입/융합 용이성) 사이의 온도 변화는 이러한 각 특정 사건에 대한 테스트 화합물의 효과를 결정하는 데 중요합니다. 이것은 감염24-29의 이러한 단계 동안 외피 바이러스의 온도 민감성으로 인해 가능합니다. 따라서 결과의 정확성을 보장하기 위해 표시된 온도에서 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 얼음 위에서 실험을 수행하여 4°C로 유지하고 온도 변화를 위해 샘플을 37°C 인큐베이터에 직접 넣습니다. 또한 음성(예: 약물 준비를 위한 DMSO 용매) 및 양성(예: 헤파린 치료) 대조군도 분석의 정확성을 더욱 확립하는 데 도움이 됩니다. 이러한 방법의 유용성과 적용 가능성은 많은 항바이러스 연구에서 입증되었습니다26,30,31,40,41. 헤파린은 대표적인 결과의 맥락에서 세 가지 분석 모두에 대한 대조군으로 포함되지만 일반적으로 후속 융합/진입 단계( 그림 2의 데이터에 반영됨)가 아닌 초기 바이러스 결합을 차단합니다. 바이러스에 대한 중화 항체(바이러스 비활성화 분석용), 바이러스에 대한 세포 표면 수용체를 마스킹하는 항체(바이러스 부착 분석용) 및 막 융합 억제제(바이러스 융합/진입 분석용)와 같은 추가 대조군도 사용할 수 있습니다.

바이러스 감염의 초기 단계에 특정한 이 보고서에 설명된 분석은 일반적으로 바이러스 감염을 보다 광범위하게 표적으로 하는 1차 스크리닝에서 후보 약물의 작용 메커니즘을 특성화하기 위한 2차 테스트로 적용하는 측면에서 유용합니다. 또는 바이러스 비활성화제, 바이러스 부착 길항제 및 바이러스 진입/융합 억제제를 포함하여 초기 바이러스 침입 억제제를 구체적으로 찾고 있는 경우 1차 스크리닝에 통합될 수도 있습니다. 이 경우, 이들을 사용하면 메커니즘 특이적 항바이러스 후보를 식별하기 위한 보다 집중적이고 정확한 스크리닝 분석이 가능하며, 이는 결과적으로 다운스트림 약물 개발을 가속화할 것입니다.

항바이러스제를 식별하는 데 세포 기반 분석법을 사용하면 잠재적인 표적 외 효과(예: 세포독성)를 밝히고 시험제의 생체활성에 생리학적 관련성을 추가하는 것을 포함하여 생화학적 분석에 비해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다42. 이러한 문제는 후보 제제가 약물 개발의 후속 단계에서 지속하기에 가치가 있는지 여부를 결정하는 데 중요한 고려 사항입니다. 유사하게, 이 보고서에 설명된 초기 바이러스 진입 특이적 분석은 세포 수준에서, 보다 구체적으로는 시험관 내 실제 바이러스 감염의 맥락에서 뚜렷한 바이러스 진입 단계에 대한 약물 효과를 조사할 수 있습니다. 따라서 이러한 분석에서 얻은 결과는 테스트 화합물의 항바이러스 효능을 더 잘 예측하고 숙주 세포에 대한 잠재적으로 원치 않는 표적 이탈 효과를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 그러나 한 가지 잠재적인 한계는 시험관 내 세포 기반 분석이 자연 바이러스 감염의 맥락에서 실제 생체 내 진입 단계를 완전히 반영하지 않을 수 있다는 것입니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜에 제시된 분석은 새로운 항바이러스제의 메커니즘 기반 식별 및 평가를 위한 분석 플랫폼 역할을 합니다.

바이러스 감염량을 정량화하기 위한 리포터 바이러스 또는 리포터 세포 시스템의 개발은 항바이러스 화합물의 세포 기반 스크리닝 및 평가를 크게 촉진했습니다. 예를 들면 리포터 유전자를 운반하는 재조합 바이러스의 사용 또는 특정 바이러스 프로모터(31,43)에 의해 구동되는 리포터 유전자를 포함하는 재조합 인간 세포주를 이용하는 것이 있다. 이 보고서에서는 루시페라아제 태그가 부착된 HCV로 인한 감염을 리포터 신호를 정량화하여 쉽게 모니터링할 수 있어 데이터 분석이 용이합니다. 이러한 유용한 리포터 기반 도구를 통합함으로써 여기에 설명된 초기 바이러스 진입 분석은 본질적으로 소분자 라이브러리의 메커니즘 기반 스크리닝을 위한 고처리량 형식으로 적용될 수 있습니다.

결론적으로, 메커니즘 특이적 항바이러스 화합물을 식별하고 평가하는 수단으로 초기 바이러스 침입을 해부하는 분석을 위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이러한 분석은 바이러스 침입에 대한 새로운 길항제/억제제를 발견하는 데 유용하고 예방 및/또는 치료 치료로 개발을 위한 항바이러스제의 범위를 확장하는 데 도움이 될 것입니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 타이베이 의과대학 병원(102TMU-TMUH-19)과 대만 과학기술부(MOST103-2320-B-038-031-MY3)의 자금 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
페니실린-스트렙토마이신GIBCO15070-063
암포테리신 BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
체외 독성학 분석 키트, XTT 기반SigmaTOX2
PBS pH 7.4 GIBCO10010023
마이크로플레이트 리더Thermo Scientific89087-320
마이크로원심분리기Thermo Scientific75002420
BioLux Gaussia luciferase 분석 키트New England BiolabsE3300L     
광도계PromegaGloMax-20/20
구연산나트륨, 이수화물Sigma71402
염화칼SigmaP5405
륨

참고문헌

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

재인쇄 및 허가

태그

CPBS
초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.