광학적으로 투명한 제브라피시 배아는 병원성 미생물과 선천성 면역 세포 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하고 시각화하는 데 널리 사용됩니다. 형광 이미징과 결합된 Mycobacterium abscessus의 미세 주입은 제브라피시 배아의 탯줄 형성과 같은 필수 병원성 특징을 면밀히 조사하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라피시(Danio rerio) 배아는 숙주-병원체 상호 작용에서 척추동물의 선천성 면역 체계의 기능을 연구하기 위한 감염 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다.많은 수의 배아를 쉽게 얻을 수 있는 것, 외부 발달로 인한 접근성, 광학적 투명성, 광범위한 유전/면역학 도구 및 형질전환 리포터 라인 컬렉션의 가용성, 이 모델의 다양성에 기여합니다.이와 관련하여, 본 원고는 Mycobacterium abscessus 감염의 연대기를 조사하기 위한 생체 내 모델 시스템으로 제브라피시를 사용하는 것을 설명합니다. 이 인간 병원체는 세포벽 구성에 따라 매끄럽게(S) 또는 거친(R) 변이체로 존재할 수 있으며, 제브라피시 배아와 유충에서 각각의 독성을 이미지화하고 비교할 수 있습니다. S 또는 R 형광 변이체를 꼬리 정맥을 통해 혈액 순환에 직접 미세 주입하면 각각 만성 또는 급성/치명적 감염을 유발합니다. 이 생물학적 시스템을 통해 농양 형성을 촉진하는 마이코박테리아 코딩의 역할을 고해상도로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 또한 형광 대식세포를 보유한 형질전환 제브라피시 계통과 함께 형광 박테리아를 사용하면 숙주-병원체 상호 작용의 다중 색상 이미징을 위한 고유한 기회를 얻을 수 있습니다. 이 논문은 균질한 M. abscessus inoculum의 준비 및 대식세포와의 상호 작용에 대한 후속 형광 이미징을 위한 제브라피시 배아의 정맥 주사에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 탯줄 형성에 결함이 있는 돌연변이와 관련된 향후 조사의 길을 열었으며 이것이 전체 척추 동물의 M. 농양 병원성에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 전념하고 있습니다.
서론
미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 1,2,3,4에서 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 - 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) 5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 7 caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 (10)에 관심과 폐 이식 (11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다.
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프로토콜
Zebrafish의 실험 절차는 관련 기관 및 정부 규정을 준수해야합니다. 본 연구를 위해, 제브라 피쉬 실험은 실험 동물의 처리를위한 유럽 연합 (EU) 지침에 따라, 대학 몽펠리에에서 (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)을 수행하고, 기준에 따라 승인 CEEA-LR-13007.
시약 및 미세 주입 장비 1. 준비
- 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 저장 (20 분 동안 120 ° C)를 소독하기 위해 압력솥, 1 L의 증류수 (31)에 0.06 g의 인스턴트 오션 바다 소금을 용해하여 물고기의 물을 준비합니다.
- 1 L 증류수에 메틸렌 블루의 1g을 용해하여 메틸렌 블루 용액을 준비합니다. 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 살균 및 저장하는 오토 클레이브, 푸른 물고기 물을 얻기 위해 1 L 물고기 물에 메틸렌 블루 용액 300 μl를 추가합니다.
참고 : additi물고기 물에 메틸렌 블루의에 곰팡이의 성장을 방지 할 수 있습니다. - 인산염 완충 생리 식염수의 준비 (PBS)
- 5.696 g의 나 2 HPO 4, 68....
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결과
다양한 해부학 적 부위 (32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁액은 30 HPF 배아 (그림 3A) (19)의 꼬리 정맥에 주입된다. S 변이체는 대조적으로, R의 morphotype 중추 신경계 (CNS) (도 3c) 내에 세균성 농양의 급속한 발전에 의해 특징 지브라 피쉬 배아 (도 3B)에서 더욱 강력하고 치명적인 감염을 유발한다. R과 S 변종 모두 전신 주사는 중추 신경계 감염과 차이가 발생할병리학 및 독성 표현형은 형광 현미경.......
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토론
제브라 피쉬는 최근 실시간 (36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠의 독성 생체 내 농양은 야생형 골든 지브라 피쉬 (37)의 사용 덕분에 조사 될 수있다. M. 사이의 상호 작용을 연구하는 19 대 식세포를 시각화 : 농양 및 골수 세포를 호스트는 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 Tg (mCherry MPEG1) 등을 사용할 수있다. (38) 또는 Tg는 (lyz :을 DsRed) 39w
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 도움이 토론에 대한 각각 tdTomato와 사비의 발현을 허용 pTEC27과 pTEC15의 관대 한 선물을 사러 - 클로드과 L. 라마 크리슈를 제공하는 케이 Kissa에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 기관의 프로젝트 (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009과 DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) 및 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의이 작품의 일부를 형성 (FP7-사람들-2011-ITN) 부여 계약에 따라 NO. PITN-GA-2011-289209 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 FishForPharma합니다. 우리는 CM 듀폰에 자금을 지원하기위한 협회 그레고리 Lemarchal 및 Vaincre 라 Mucoviscidose (RF20130500835)을 감사하는 것이 좋겠다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
| 소 혈청 알부민 | Euromedex | 04-100-811-E | |
| 소 간에서 카탈라아제 | 시그마-알드리치 | C40 | |
| 디프코 미들브룩 7H10 한천 | BD 생명과학 | 262710 | |
| 디프코 미들브룩 7H9 육수 | BD 생명과학 | 271310 | |
| 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인) | 시그마-알드리치 | A5040 | |
| 올레산 | 시그마-알드리치 | O1008 | |
| 파라포름알데히드 | 델타 Microscopie | 15710 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich 319244 | ||
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
| Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
| 저녹는 아가로스 | Sigma-Aldrich | ||
| 인스턴트 오션 Sea Salts | Aquarium Systems Inc | ||
| 붕규산 유리 모세혈관 | 셔터 기기 Inc | BF100-78-10 | 1mm O.D. X 0.78mm I.D. |
| 마이크로피펫 풀러 장치 | Sutter Instrument Inc | Flamming/Brown Micropipette Puller p-87 | |
| Microinjector | Tritech Research | 디지털 마이크로인젝터, MINJ-D | |
| 트위저 | 사이언스 툴 inc | Dumont # M5S | |
| Microloader 팁 | Eppendorf |
참고문헌
- Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
- Aitken, M. L., Limaye, A., et al.
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재인쇄 및 허가
