영상 병인과의 Cording를 해독하고 미코 농양 Zebrafish의 배아에서

Summary

광학적으로 투명한 제브라피시 배아는 병원성 미생물과 선천성 면역 세포 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하고 시각화하는 데 널리 사용됩니다. 형광 이미징과 결합된 Mycobacterium abscessus의 미세 주입은 제브라피시 배아의 탯줄 형성과 같은 필수 병원성 특징을 면밀히 조사하는 데 사용됩니다.

Abstract

제브라피시(Danio rerio) 배아는 숙주-병원체 상호 작용에서 척추동물의 선천성 면역 체계의 기능을 연구하기 위한 감염 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다.많은 수의 배아를 쉽게 얻을 수 있는 것, 외부 발달로 인한 접근성, 광학적 투명성, 광범위한 유전/면역학 도구 및 형질전환 리포터 라인 컬렉션의 가용성, 이 모델의 다양성에 기여합니다.이와 관련하여, 본 원고는 Mycobacterium abscessus 감염의 연대기를 조사하기 위한 생체 내 모델 시스템으로 제브라피시를 사용하는 것을 설명합니다. 이 인간 병원체는 세포벽 구성에 따라 매끄럽게(S) 또는 거친(R) 변이체로 존재할 수 있으며, 제브라피시 배아와 유충에서 각각의 독성을 이미지화하고 비교할 수 있습니다. S 또는 R 형광 변이체를 꼬리 정맥을 통해 혈액 순환에 직접 미세 주입하면 각각 만성 또는 급성/치명적 감염을 유발합니다. 이 생물학적 시스템을 통해 농양 형성을 촉진하는 마이코박테리아 코딩의 역할을 고해상도로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 또한 형광 대식세포를 보유한 형질전환 제브라피시 계통과 함께 형광 박테리아를 사용하면 숙주-병원체 상호 작용의 다중 색상 이미징을 위한 고유한 기회를 얻을 수 있습니다. 이 논문은 균질한 M. abscessus inoculum의 준비 및 대식세포와의 상호 작용에 대한 후속 형광 이미징을 위한 제브라피시 배아의 정맥 주사에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 탯줄 형성에 결함이 있는 돌연변이와 관련된 향후 조사의 길을 열었으며 이것이 전체 척추 동물의 M. 농양 병원성에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 전념하고 있습니다.

Introduction

미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 ^{1,2,3,4에서} 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 - 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) ^5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 ⁷ caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 ^8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 ^(10)에 관심과 폐 이식 ^(11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다.

M. 농양 표시 다른 임상 결과로 이어질 부드러운 (S) 또는 거친 (R) 식민지 형태 형. S 균주 달리, R 박테리아 로프 또는 끈형 구조 ^{(12, 13)로} 이어지는 단으로 성장하는 경향이있다. 세포 또는 동물 중 모델을 기반으로 여러 독립적 인 연구는 연구의 하이퍼 독성 표현형은 ^{14, 15를} morphotype 밝혔다. 역학 연구, M.의 가장 심각한 경우 가입일 농양, 폐 감염이 연구와 관련이있는 것으로 나타납니다하는 유일한 변형 ^{16 개의 변종이}감염된 호스트 ³ 년 동안 지속하는 것으로 나타났습니다. morphotype 차이는 표면 관련 glycopeptidolipids (GPL) ¹² (S)에 존재 또는 (R)에서 손실에 의존한다. 그러나, 현재 이용 가능한 셀룰러 / 동물 모델의 본질적인 한계는 M.에 의한 연구를 사용 농양 감염, R 또는 S 변종의 병태 생리 학적 사건에 대한 우리의 지식은 불분명 남아있다. 정맥 또는 에어로졸 경로를 통해 면역 능력이 쥐의 감염은 지속적 감염 및 생체 내 약물 감수성 검사 ^(17)에 대해 연구하는 마우스의 사용을 방해, 일시적 식민지로 연결됩니다. 따라서, 호스트 응답의 조작 의무가 동물 모델을 개발하는 것은 큰 도전이다. 이러한 맥락에서, 감염의 포유 동물 모델 비는 비용, 속도 및 윤리적 양호성 O 등 여러 가지 이점을 제공한다 ^(18)를 포함 초파리 melanogaster의 최근 개발되어왔다마우스 모델을 VER. 감염의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 모델은 또한 비 침습적 영상, M.의 진행과 연대하여, 시각적으로 탐구하고있다 살아있는 동물 ¹⁹ 농양 감염. 중요한 개념의 증거는 엠에 대한 생체 내 항생제 평가에 대한 적합성을 입증하기 위해 설립되었다 ^{17, 20} 농양.

제브라 널리 다양한 병원균과 숙주 면역 시스템 ⁽²¹⁾ 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어왔다. 이 다른 척추 동물 모델의 증가 성공 동기 부여 및 다수의 바이러스와 세균 감염 ^{19,22,23,24,25,26,27,28,29의} 더 나은 이해를 위해 사용을 검증 주요 독특한 기회에 의존합니다. 대부분의 다른 동물 모델에 반해, 제브라 피쉬 배아는 비 침습적 형광 이미징 ^(30). 이는 헥타르 있도록 광학적으로 투명M. 공부를 LED에 농양은 세균의 형태 학적 가소성의 예를 나타내는 세포 외 cording의 설명과 남중, 전례없는 세부 제브라 피쉬 배아를 감염. Cording는 면역 체계의 파괴의 새로운 메커니즘 및 급성 엠의 발병을 촉진하는 핵심 메커니즘을 나타냅니다 농양 감염 ^(19).

이 보고서는 M.의 병태 생리 학적 특성을 해독하는 제브라 피쉬 배아를 사용하는 새로운 도구와 방법을 설명합니다 감염 농양과 간균과 선천성 면역 시스템 사이의 친밀한 상호 작용을 연구하는. 먼저, 그 자체 박테리아 접종원 배아 준비, 감염의 처리를 포함하는 마이크로 인젝션 상세한 프로토콜이 제시된다. 구체적 방법은 M.를 평가하도록 같은 호스트의 생존과 세균 부담 등의 다양한 매개 변수를 측정하여 농양 독성이되게됩니다. 특별한 초점은 방법에 기재되어 있습니다, 시공간 수준에서, 운명과 진행 감염과 엠에 호스트 면역 반응을 모니터링 비디오 현미경을 사용하여 농양. 또한, M. 동안의 기여와 대 식세포의 역할을 조사하기 위해 감염 농양, 방법 (genetically- 또는 화학적 기반 중 하나 방법을 사용) 대 식세포가 고갈 된 배아 설명되어 있습니다를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 고정 또는 생활 배아를 사용하여 대 식세포 나 호중구가 문서화와 특정 상호 작용을 시각화합니다.

이 보고서의 목적은 엠에 새로운 광명을 비춰하는 추가 연구를 자극하는 것입니다 농양 독성 메커니즘 및 제어되지 않은 급성 감염 프로세스의 확립에 cording 특히 역할.

Protocol

Zebrafish의 실험 절차는 관련 기관 및 정부 규정을 준수해야합니다. 본 연구를 위해, 제브라 피쉬 실험은 실험 동물의 처리를위한 유럽 연합 (EU) 지침에 따라, 대학 몽펠리에에서 (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)을 수행하고, 기준에 따라 승인 CEEA-LR-13007.

시약 및 미세 주입 장비 1. 준비

1. 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 저장 (20 분 동안 120 ° C)를 소독하기 위해 압력솥, 1 L의 증류수 ^(31)에 0.06 g의 인스턴트 오션 바다 소금을 용해하여 물고기의 물을 준비합니다.
2. 1 L 증류수에 메틸렌 블루의 1g을 용해하여 메틸렌 블루 용액을 준비합니다. 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 살균 및 저장하는 오토 클레이브, 푸른 물고기 물을 얻기 위해 1 L 물고기 물에 메틸렌 블루 용액 300 μl를 추가합니다.
   참고 : additi물고기 물에 메틸렌 블루의에 곰팡이의 성장을 방지 할 수 있습니다.
3. 인산염 완충 생리 식염수의 준비 (PBS)
   1. 5.696 g의 나 ₂ HPO _4, 680 mg을 KH ₂ PO _4, 969 mg의의 KCl과 78.894 g의 NaCl을 1 L의 증류수에 용해시켜 10 X PBS 주식 솔루션을 준비하고 HCl로 7.0 pH를 조정합니다. 1 X PBS를 얻기 살균 120 ° C에서 20 분 동안 물을 증류 제거하고, 오토 클레이브에 900ml의 10 X PBS 용액 100 mL로 희석.
   2. 최대 1 년 동안 실온에서 1 X PBST를 얻기 0.05 % 트윈 80을 추가하고 저장.
4. 다음 용액을 멸균 필터 소 간, 1 L의 증류수에 올레산 0.5 g 8.5 g의 NaCl, 50g 소 혈청 알부민, 20g D- 글루코스, 40 mg의 카탈라제 용해 올레산 포도당 카탈라제 (OADC) 농축을 준비 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 보관합니다.
5. 400 mg을 용해시켜 tricai 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 메탄 술폰산 (tricaine) 스톡 용액 100 ㎖를 제조97.9 용액에 NE 분말은 증류수. 7.0에서 pH를 조정하고 -20 ° C에서 솔루션을 저장하기 위해 1 M 트리스 (PH 9)의 2.1 ML을 추가합니다.
6. 다음 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러 장치 사용 붕규산 유리 모세관 (1mm 외경 X 0.78 mm의 ID)를 잡아 당겨 마이크로 캐 필러 주입 바늘을 준비 : 공기압 650; 999 가열; (50)를 당겨; 속도 (80); 시간 (200).
7. 푸른 물고기 물에 1.5 % 한천 솔루션을 준비하고 100mm 배양 접시에서 용융 한천의 25 ml에 붓는다. 녹은 한천의 위에, 특정 채널을 각인하기 위해 만든 금형을 배치합니다. "V"모양의 채널 위치 배아에 사용되는 계란 (그림 1) ^(31)에 사용되는 모양 "U"동안. 응고되면, 신중하게 인쇄물을 제거합니다.
   참고 : 최대 2 개월 동안 4 ℃에서 탈수 및 저장을 피하기 위해 푸른 물고기 물과 한천을 커버.

제브라 피쉬 주사 그림 1. 위치 챔버. (A) 계란 (왼쪽 패널)와 배아를위한 V 자형 채널 (오른쪽 패널)에 대한 U 자형 채널. Zebrafish의 계란 / 배아는 채널에 배치하고 동일한 축을 따라 정렬된다. (B)보기 챔버 현미경 관찰을 위해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 준비 및 엠의 저장 농양 접종

1. M. 농양 성장 조건
   1. 엠을 플레이트 OADC의 10 % 및 0.5 % 글리세롤 (7H10 ^OADC) 및 적절한 항생제 형광 단백질을 코딩하는 벡터에 의해 운반 내성 마커에 따라 보충 함유 미들 7H10 한천 상으로 -80 ° C 글리세롤 스톡으로부터 농양. 번호판을 품어4-5일 30 ° C에서.
   2. 형광 긍정적 인 마이코 박테리아 식민지를 선택하고 15 ml의 멸균 플라스틱 튜브에 필요한 항생제 OADC 보충 1 ml의 미들 7H9 국물, 0.2 % 글리세롤, 0.05 % 트윈 80 (7H9 ^{OADC / T)를} 접종. 흔들림없이 1 주간 30 ° C에서 품어.
      참고 : 트윈 80은 응집 및 세균 집계를 제한합니다.
   3. (약 5.10 ⁷ 박테리아 / ㎖에 상응 함), 최종 0.1 OD ₆₀₀ 150cm ² 조직 배양 플라스크에 50 mL의 미들 7H9 ^{OADC은 / T} 2.1.2에서 얻어진 예비 배양을 재현 탁하고 4 30 ℃에서 추가 배양 일이 기하 급수적으로 성장하는 문화 (OD ₆₀₀ = 0.6 ~ 0.8)을 얻었다.
      참고 : 응집을 최소화하기 위해, 특히 거친 변종, 배양 5 일 초과 할 수 없습니다. 모두 매끄럽고 거친 변이체 유사한 성장 속도를 표시.
2. 엠의 준비 농양 접종(60);
   참고 : 인해 거친 엠의 높은 성향에 농양 큰 응집체를 형성하는 단계 및 코드를 생성하기 위하여, 특정 치료 전에 배아 microinjections에 균일하고 정량적으로 제어 접종원을 생성 할 필요가있다. 이 치료는 또한 거친 균주보다 낮은 정도이기는하지만, 골재를 생산 세균을 매끄럽게하기 위해 적용된다.
   1. 수확은 4에서 원심 분리하여 150cm ² 조직 배양 플라스크에서 문화를 기하 급수적으로 성장하고, 000 50 ml의 멸균 플라스틱 튜브에 실온에서 15 분 동안 XG 및 1 ml의 7H9 ^{OADC / T에} 박테리아 펠렛을 재현 탁. 나누어지는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세균 현탁액 200 μL.
      주 : 1 ml를 주사기로 작은 볼륨으로 작업하는 것은 매우 균일 한 현탁액을 얻을 필요가있다.
   2. 각 초음파 자체 사이에 10 초 휴식으로 (10 초 (15 상하 서열) 초음파 처리를 세 번 26 G 바늘 세균 현탁액을 균질화수조의 초음파기를 사용하여 quence). 간단히 7H9 ^{OADC / T와} 소용돌이의 1 ML을 추가합니다. 100 × g에서 원심 분리기 3 분.
   3. 조심스럽게 덩어리를 방지하고 50 ml의 멸균 플라스틱 튜브의 균일 한 현탁액을 풀 수있는 마이코 박테리아 함유 상층 액을 수집합니다.
   4. 결국 남아있는 세균 집계의 존재를 시각적으로 확인합니다.
      참고 : 집계가 여전히 존재하는 경우, 2 분 동안 100 XG에 추가 원심 분리 단계로 진행하고, 상층 액을 수집합니다.
   5. 원심 분리기는 현탁액 5 분 4,000 XG에 200 μL 7H9 ^{OADC / T에} 펠렛을 재현 탁하고 주사로 진행합니다.
   6. 7H10 ^{OADC 한천에} (1 × PBST에) 연속 희석 도금 및 30 ℃에서 4 일간 배양 한 후 집락 형성 단위 (CFU)를 계산하여 최종 세균 농도를 평가합니다. CFUs 각각의 새 배치에 대한 결정되어야한다.
   7. -80 & #에서 5 μL 씩 저장하여 냉동 접종 주식 준비176; C.
      주 : -80 ° C의 동결 분취 CFU 평가는 냉동 / 해동 접종 박테리아 생존에 영향을 미칠 수 있으므로 가능한 박테리아의 정확한 수를 결정하는 필수 조건이다. 이러한 냉동 접종원 후속 주입에 사용될 준비가되었다. 모든 분취 액 CFU의 동일한 수를 포함하기 때문에, 또 하나의 실험에서 재현 가능한 방식으로 박테리아를 주입 가능.
3. 접종 품질 관리
   주 : (마이코 박테리아에만) Ziehl-Neelsen 염색 전에 및 2.2에 기술 된 절차 균질화 후 세균 현탁액의 품질을 비교하는 데 사용될 수있다.
   1. 스폿과 유리 슬라이드에 균질화 세균 현탁액의 한 방울을 확산하고, 완전히 건조 65-70 ^{O C} 및 얼룩이 Ziehl-Neelsen 염색 프로토콜을 사용하여 설정된 핫 플레이트에서 적어도 30 분 동안 스미어를 고정 할 수 있도록 .
   2. 현미경 (100)를 이용하여 세균 도말 표본을 관찰X 목적 및 비 처리 된 세균 현탁액 스미어와 비교 (도 2).

분산 M. 그림 2. 준비 농양 접종. R 또는 S의 Ziehl-Neelsen 염색은 (상단 패널) 어떤 치료를하기 전에 국물 매체에서 재배 변종 또는 처리 (낮은 패널) 후 마이코 박테리아 골재의 크기와 수 (해서 주입, 초음파 및 경사의 연속적인 단계)을 줄이기 위해 . 박테리아는 100 X APO 오일 1.4 NA 목표)와 현미경을 이용하여 관찰 하였다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. Zebrafish의 배아를 준비

1. 제브라 피쉬의 알을 산란 및 수집
   1. 의 전날저당 잡히기, 2 명의 남성과 1 여성을 배치하여 품종 성인 제브라 피쉬 : 달걀 수집 바구니 ^(31)과 별도의 수조로 구성, 번식 실에 (일반적으로 2 : 1 비율이 최적의 수정 속도를 지원한다).
      참고 : 달걀 수집 바구니는 부모에 의해 먹게되는 계란을 보호하고 계란 수확을 용이하게하기 위해 사용된다.
   2. 28.5 ℃에서 25 ml의 푸른 물고기 물 (최대 100 접시 당 배아)하고이를 유지 가득 100mm 페트리 접시에 1 HPF, 수확 계란 만 제대로 개발 된 배아에서. 비 수정란은 폐기된다.
2. 주사를위한 제브라 피쉬 배아의 준비
   1. 약 24 시간 후 수정 (HPF)에서, 100mm 페트리 접시에 미세 핀셋으로 배아를 d​​echorionate 28.5 ℃에서 보관하십시오.
   2. 피펫을 사용하여 30-48 HPF 배아를 수집하고 물고기 물 25 ㎖를 270 ㎎ / ℓ의 tricaine을 포함 가득 "V"모양의 위치 챔버로 전송.쉽게 마이크로 조작에 최적화 된 수제 microloader 팁 도구 (집에서 클리핑 마이크로 로더 팁)를 사용하여 채널에서 제대로 배아를 놓습니다.
      참고 : 꼬리 정맥 또는 꼬리 근육 주사에 대한 위로 등의 측면에서 정맥 주사에​​ 대한 아래 등쪽의 방향을.

4. 마이크로 주입 절차

참고 : M. 용 마이크로 인젝션 절차 농양은 M.에 대해 이전에 설명 된 것과 유사하다 marinum ^(32)를 주사. 엠의 연대기를 평가하기 농양 감염 (생존, 세균성 부하, 운동 및 감염의 특성), 30 HPF 배아의 꼬리 정맥에 주사가 바람직하다. 면역 세포의 채용을 시각화하기 위해, 주사 48 HPF의 배아에서 꼬리 근육에 같은 지역화 된 사이트에서 이루어집니다.

1. CFU의 수에 따라 1 × PBST (의 마이코 박테리아 접종을 희석적절한 삽입을 확인하는 10 %를 함유하는 페놀 레드, 단계 2.2.6)에서 결정된 바와 같이 투여 될 수있다.
2. microloader 팁을 사용하여 박테리아 접종원 5-10 μL와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을로드 인젝터에 연결된 삼차원 미세 조작기의 홀더에 마이크로 인젝션 용 바늘을 연결을 수득 미세 핀셋 바늘의 상단을 끊는 5-10 μm의 직경을 개방.
3. 미세 주입 압력 (20 ~ 50 고전력 증폭기)와 시간 (0.2 초)을 조정하여 주입 볼륨을 보정합니다.
   주 : 필요한 주입량은 배아 노른자위로 토출 액적 직경의 육안 판정에 의해 교정된다.
4. 꼬리 정맥 주입의 경우, (3.2.2 절에 설명 된대로) 바늘을 직면하고있는 복부 측면과 배아를 놓고 꼬리 정맥을 대상으로 비뇨 생식기 구멍에 바늘 끝 가까이, 배치, 부드럽게 배아에 바늘의 끝 부분을 밀어 그냥 caud을 관통 할 때까지알 정맥 영역입니다. 일반적으로 약 100 CFU / NL을 포함 1-3 NL, 세균 준비의 원하는 볼륨을 제공합니다.
5. 근육 주사를 들어, (섹션 3.2.2에서와 같이) 바늘을 향 등의면 배아를 놓고 한 체절을 통해 바늘을 놓고 접종의 작은 볼륨 (1 NL)를 주입.
   참고 : 꼬리 정맥 주사에​​ 관해서는, 근육 내 감염도 수행 할 도전이다. 케어는 주변 조직을 손상 수있는 오버로드를 방지하기 위해주의해야합니다.
6. 주사 과정의 끝에서, 7H10 ^OADC 도금 및 CFU를 계산 한 다음 멸균 PBST의 드롭에 세균 현탁액의 동일한 양을 주입하여 접종의 크기를 제어한다. 약 100 배아는 바늘로 주입 될 수있다.
   참고 : 때문에 거친 M. 농양이 바늘에 집계를 형성하기 위해 계속, 주사 접종 준비 직후에 수행 될 필요가있다.
7. 감염된 FIS 이동2 ㎖ / 잘 물고기 물과 28.5 ° C에서 부화를 포함하는 시간을 개별적으로 24 웰 플레이트. 1-3 NL 1 X의 PBST 주입 배아는 컨트롤로서 사용될 수있다.
8. 배아에 형광 박테리아의 적절한 감염은 형광 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

대 식세포가 고갈 된 배아의 5 세대

참고 : 조직에서 대 식세포의 선택적 고갈 감염 동안 자신의 기여와 역할을 조사하는 데 사용됩니다. 대 식세포의 적절한 고갈을 시각화하기 위해서는 mCherry 특별히 식세포 특이 MPEG1 촉진제 ^(19)의 제어하에 발현되는 형광 식세포와 트랜스 제닉 라인을 사용하는 것이 권장된다.

1. 리포 - 클로드 기반 절차
   주 : 리포 - 클로드 절차는 조직에서 대 식세포의 선택 고갈 (있지만 호중구) ^(19)를 할 수 있습니다. 이 화합물은 둘 배아 나 AF의 생존을 변경하지 않는다박테리아의 무결성에는 영향. 리포좀 캡슐화 클로드를 제조 상세한 프로토콜은 이전에보고 된 바있다 ^(33).
   1. 24 HPF에서 배아를 d​​echorionate 및 3.2.2에 기술 된 바와 같이, 주입 절차의 종료까지 마취 상태에서 배아를 유지 tricaine 보충 물고기 물로 채워진 "V"자형 주입 접시로 옮긴다. 아래 등쪽의 방향을.
   2. 리포좀 캡슐화 클로드 (의 Lipo-클로드)와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을로드 삼차원 미세 조작기의 홀더에 미세 주입 바늘을 연결하여 10 ㎛의 선단 개구 직경을 얻기 위해 미세 핀셋 바늘의 상단을 끊는.
   3. 주입 부피를 보정하기 위해, 고전력 증폭기 (20)에 마이크로 인젝션 압력 및 0.2 초의 주입 시간을 조정한다. 꼬리 정맥을 대상으로, 비뇨 생식기 구멍에 바늘 끝 가까이 배치하고 부드럽게에 바늘의 끝 부분을 밀어배아 단지 꼬리 정맥 영역을 관통하고 용액 원하는 볼륨 (2-3 NL, 3 회)를 제공 할 때까지.
      참고 : 리포 - 클로드 서스펜션은 매우 끈적이고 배아의 혈관 시스템과 살인을 막지 않도록 주입하기 전에 와동해야합니다. 그것은 작은 볼륨의 여러 연속 주사로 진행하는 것이 중요하다.
   4. 물고기의 물을 포함 100mm 페트리 접시에 배아를 전송하고 감염까지 28.5 ° C에서 보관하십시오.
   5. 형광 현미경에 의한 대 식세포의 적절한 고갈을 제어 할 수 있습니다.
      참고 : 전체 대식 세포 고갈 리포-clodoronate 투여 후 4 일 동안 유효합니다.
2. 모르 폴리 노 기반 절차
   1. (2) 남성과 번식 실에서 플라스틱 장벽으로 구분 한 여성을 배치하여 산란, 번식 성인 제브라 피쉬 전날.
   2. 다음 날, 빛이 제브라 피쉬 시설에 온 그 이후 ≈ 30 분, 분리 장벽을 제거남성과 여성. 수정 속도를 최적화하기 위해 산란의 시작 후 약 20 분 동안 기다립니다. 계란을 수확하고 차가운 푸른 물고기 물 (4 ℃)로 가득 100mm 페트리 접시에 그들을 전송하여 자신의 개발을 느리게.
      참고 : 산란의 제어는 morpholinos 기반의 실험을 위해 매우 중요합니다. Morpholinos은 4 개의 셀 스테이지까지 알에 주입 될 수있다.
   3. 피펫을 사용하여 계란을 수집하고 차가운 푸른 물고기 물이 가득 "U"모양의 사출 실에서 계란을 예금 만든 microloader 팁 도구를 사용하여 채널에서 계란을 차단합니다.
   4. ⁽¹⁹⁾ 이전에 설명한 바와 같이, 페놀 레드의 10 %를 함유 PU.1의 모르 폴리 용액을 제조 하였다. 모르 폴리 제제와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을 넣고 삼차원 미세 조작기의 홀더에 미세 주입 바늘을 연결하고 obtai하는 미세 핀셋 바늘의 선단을 끊는5-10 μm의 NA의 선단 개구 직경.
   5. 주입 부피를 보정하기 위해, 고전력 증폭기에 20-50 마이크로 인젝션 압력 및 0.2 초의 주입 시간을 조정한다. 계란에 가까운 바늘 끝을 놓고 부드럽게 원하는 모르 폴리 노 솔루션 볼륨, 일반적으로 3-5 NL을 난자에 융모막을 통해 바늘의 끝 부분을 밀어 제공합니다.
   6. 마이크로 주입 한 후, 물고기 물에 100mm 페트리 접시에 계란을 전송하고 감염 절차를 시작하기까지 28.5 ° C에서 품어.
   7. 30-48 HPF에서 형광 현미경으로 PU.1의 morphants에서 대 식세포의 적절한 (전체) 고갈을 _{분석합니다..}
      참고 : 주입 농도에 따라, P는 u.1의 morpholinos는 초기 호중구의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 호중구의 수를 변경하지 않고 식세포 고갈 적절한 확인을 위해, 그것과 GFP (형광 호중구와 대 식세포 및 이중 형질 전환 지브라 피쉬 라인을 사용하도록 권장특히 MPX 프로모터에 의해 구동 식) ^19.

6. 세균 부담 부량

1. CFU 열거에 의해 결정
   1. 원하는 시점에서, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 감염된 태아의 그룹 (조건에 따라 5) (1 배아 / 튜브), 10 분 동안 얼음에 배양하여 배아를 냉동이 - 마취와 tricaine의 과다 복용을 사용하여 안락사 (300-를 수집 500 ㎎ / ℓ)
   2. 두 번 멸균 수와 배아를 씻고 새로운 튜브를 분배,를 Lyse 각각 배아 2 % 트리톤 X-100 26 G 바늘을 사용하여 완전 용해 될 때까지 정지를 균질화 한 X PBST에 희석. 현탁액을 원심 분리기 및 0.05 % 트윈 균질의 80 연속 희석은 미들 7H10 ^OADC에 도금 업체에서 권장하는대로, BBL MGIT PANTA으로 보완하여 1 × PBST에 펠렛을 재현 탁.
      참고 : M. 수산화 나트륨 treatmen에 더 민감되고 농양M.보다 T 엠에 영향을주지 않고 물고기 해물의 marinum는, 오염 제거 농양 성장 성공적 BBL MGIT PANTA 항생제 칵테일을 사용하여 달성 될 수있다.
   3. 30 ° C 카운트 식민지에서 4 일 동안 번호판을 품어.
2. 형광 픽셀로 결정 라이브 배아 (FPC) 측정 카운트
   참고 : 형광 방출을 통해 세균 하중을 결정하기는 감염된 태아의 일련의 이미지를 획득하고, FPC (입자 분석에 의한 세균의 식별)에 의해 측정 된 형광 강도는 ImageJ에 프리웨어 개발 만든 매크로를 사용. 입자 분석은 배경에서 관심의 형광 신호를 식별 할 수있는 임계 값 범위에 의존하는 이진 흑백 이미지를 필요로한다.
   1. 3.2.2의 설명에 따라 원하는 시점에서, 35mm 배양 접시에 감염된 태아 (조건에 따라 5-10) tricain - 마취.
   2. 물과 subme 제거RGE 배아와 물고기 물에 1 % 저 융점 아가로 오스와 전체 요리면, 다음 옆으로 배아를 맞 춥니 다. 물고기 물이 tricaine를 포함와 응고 아가 로스를 커버.
   3. 10 X 목적으로 표면 형광 현미경을 이용하여 전체 배아의 형광 이미지를 획득.
      주 : 형광 이미지 획득이 FPC 측정 절차의 중요한 단계입니다. 이 색상 교정 탐침 교정 모니터를 사용하는 것이 중요하다. 취득 된 신호의 포화를 방지하는 동안 최적의 노광 시간을 조정하면 최소 배경을 얻었다. 이미지는 8 비트 TIFF 형식이어야한다. 동일한 설정을 정량적 목적을 위해 전체 실험 기간 동안 유지됩니다.
   4. 수제 microloader 팁 도구를 사용하여 배아에서 조심스럽게 아가로 오스를 제거합니다. 필요한 경우, 이들 배아는 후속 분석을 위해 사용될 수있다. 세균 부하의 정량화에 앞서, 각각의 화상은 품질이 관리되어야한다. 로이미지를 nalyze 물고기 당 FPC로 형광 강도를 변환, ImageJ에 프리웨어를 엽니 다.
      주 : FPC 값이 박테리아 부담을 반영 이전에 M.를 사용하여 그림과 같이 marinum ^(34).
   5. 감염되지 않은 태아의 영상을 사용하여 이미지 분석에 필요한 임계치를 결정 (여러 제어 배아 평균 임계치를 획득하기 위해 사용될 수있다). →이 → 임계 값을 조정하고 배경이 완전히 검은 색이 ​​될 때까지 (즉, 제로에 있어야 배경을 구하는) 오른쪽에있는 임계 값 창에서 하단의 슬라이더를 이동하여 이미지로 이동합니다. 해당 값을 기록한다.
   6. 이미지 J 내에서 FPC 매크로 (추가 파일)을 열고 화면의 지시를 따릅니다 : 이미지의 폴더를 측정 할 찾아 이전에 결정하고 "확인"을 클릭으로 다음 임계 값을 입력합니다.
      참고 : 매크로가 자동으로 배경을 뺍니다. 임계 값은 적용된다. 형광 신호는 식별자이다입자 분석 다음 얘기들이었다.
   7. 복사는 데이터 분석에 대해 원하는 소프트웨어 요약 창에서 데이터를 붙여 넣기합니다.
      주 : CFU 결정 방법과 대조적으로, FPC 방법은 비 침습적이며 역학 모니터링, 중요한 것은, 후속 분석을 위해 배아를 재 - 사용 및 허용 / 개별적으로 세균 부담의 동력학. 이 때문에, 상당히 윤리 규정과 일치, 동물의 수를 감소 할 수있다.

7. 영상 M. abscessus- 감염된 태아

1. 엠의 라이브 영상 농양 감염
   1. 마운트 tricaine - 마취 배아 (3.2.2 참조) 표면 형광 현미경 관찰 이전에 35mm 페트리 접시에 1 % 저 융점 아가로 오스. 반전 공 초점 현미경이나 똑바로 공 초점 현미경을위한 하나의 공동 우울증 슬라이드에서 유리 바닥 접시를 사용합니다. 원하는 위치와 덮개에 배아의 방향을물고기 물 tricaine 함유 함께 응고 아가.
   2. 전체 배아의 순차적 형광 수집 및 전송 이미지 10 X의 목적으로 표면 형광 현미경을 사용합니다. 대안 적으로, 감염 후, 면역 세포의 활성을 시각화 40X 63X 또는 목표와 공 촛점 현미경을 사용한다.
2. 이미징 M. 고정 농양 감염 배아
   1. 6.1.1에 설명 된 배아를 안락사 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 1 X PBST로 4 % 파라 포름 알데히드에서 배아를 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 전송하고 고정한다. 10 분 동안 1 X PBST로 두 번 배아를 세척하여 파라 포름 알데히드를 제거합니다.
      참고 : 형광을 유지하려면 고정 된 배아가 빛으로부터 보호해야합니다.
   2. 조직 및 형광의 무결성을 유지하기 위해, 배아에 대해, (1 X PBST로 희석하여 10, 20, 30, 40 및 50 %)의 글리세롤의 농도의 용액을 연속적으로 증가하는 인큐베이션조건 당 10 분.
      참고 : 고정 배아는 4 ° C에서 50 % 글리세롤에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
   3. 볼 챔버 (도 1b) ^(31)에 50 % 글리세롤에 매립 배아를하다.
   4. 공 초점 현미경에 40X 또는 63X 목표를 사용하여 이미지.

Results

다양한 해부학 적 부위 ^(32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁액은 30 HPF 배아 (그림 3A) ^(19)의 꼬리 정맥에 주입된다. S 변이체는 대조적으로, R의 morphotype 중추 신경계 (CNS) (도 3c) 내에 세균성 농양의 급속한 발전에 의해 특징 지브라 피쉬 배아 (도 3B)에서 더욱 강력하고 치명적인 감염을 유발한다. R과 S 변종 모두 전신 주사는 중추 신경계 감염과 차이가 발생할병리학 및 독성 표현형은 형광 현미경...

Discussion

제브라 피쉬는 최근 실시간 ^(36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠의 독성 생체 내 농양은 야생형 골든 지브라 피쉬 ^(37)의 사용 덕분에 조사 될 수있다. M. 사이의 상호 작용을 연구하는 ¹⁹ 대 ^식세포를 시각화 : 농양 및 골수 세포를 호스트는 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 Tg (mCherry MPEG1) 등을 사용할 수있다. ⁽³⁸⁾ 또는 Tg는 (lyz :을 DsRed) ^39w

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
소 혈청 알부민	Euromedex	04-100-811-E
소 간에서 카탈라아제	시그마-알드리치	C40
디프코 미들브룩 7H10 한천	BD 생명과학	262710
디프코 미들브룩 7H9 육수	BD 생명과학	271310
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)	시그마-알드리치	A5040
올레산	시그마-알드리치	O1008
파라포름알데히드	델타 Microscopie	15710
Phenol Red	Sigma-Aldrich 319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
저녹는 아가로스	Sigma-Aldrich
인스턴트 오션 Sea Salts	Aquarium Systems Inc
붕규산 유리 모세혈관	셔터 기기 Inc	BF100-78-10	1mm O.D. X 0.78mm I.D.
마이크로피펫 풀러 장치	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector	Tritech Research		디지털 마이크로인젝터, MINJ-D
트위저	사이언스 툴 inc		Dumont # M5S
Microloader 팁	Eppendorf