광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

요약

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

초록

베타 아밀로이드 (Aβ)는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견 노인반의 주요 구성 성분이다. Aβ는 β 및 γ - 세 크레타에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 분열에서 파생됩니다. AD 병리에 Aβ의 중요성에도 불구하고, 이러한 분열의 세포 내 현지화가 잘 확립되어 있지 않습니다. 우리 실험실에서 직장 및 다른 세포 표면에서 내재화 후 APP 처리에 엔도 솜 / 리소좀 시스템 연루. 그러나, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 상대적으로 파악 하였다입니다.

세포 표면 단백질은 많은 라벨링 기술에 수정할 수있는 반면, 골지체에서 막 단백질의 거래를위한 다음의 간단한 방법은 없다. 이를 위해, 우리는 C- 말단에서 사진 기동 GFP (paGFP)로 태그 한 응용 프로그램 구조를 만들었습니다. 합성 후 paGFP 낮은 기저 형광을​​ 가지고 있지만 413 nm의 빛을 t로 자극 될 수있다O 강한, 안정적인 녹색 형광을 생산하고 있습니다. 사용하여 골지 마커 락토 트랜스퍼 대상 시안 형광 단백질 (GALT-CFP)에 결합 된, 우리는 트랜스 골지 네트워크 APP photoactivate 정확하게 할 수있다. 이 형광 식별 하류 구획 (트래픽) 초기 엔도 좀 (Rab5), 후반 엔도 좀 (Rab9)와 리소좀 (램프 1)에 대한 구획 마커 단백질 태그로 사진 활성화 APP-paGFP은 다음에 할 수 있습니다. 또한, 클로로퀸 또는 γ 세 크레타 제 억제제 인 L685, 458을 포함 APP 처리에 억제제를 사용하여, 우리는 단일 세포에서 APP의 프로세싱을 조사 펄스 추적 실험을 수행 할 수있다.

우리는 APP의 많은 부분이 세포 표면에 나타나는없이 리소좀에 빠른 속도로 이동 한 다음 세 크레타 같은 분열에 의해 리소좀에서 삭제되는 것을 찾을 수 있습니다. 이 기술은 이리저리 세포 내 단백질의 인신 매매 및 처리를 다음과 같은 사항에 대해 paGFP의 유틸리티를 보여줍니다하류 구획 골지을 해요.

서론

알츠하이머 병 (AD)의 특징은 노인성 플라크와 뇌의 신경 섬유 엉킴 (NFTS)의 존재이다. 노인성 플라크의 주성분은 β - 아밀로이드 (Aβ)입니다. Aβ는 그 전구체에서 파생 된; 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) ^1. 응용 프로그램의 아밀로이드 분열은 β-크레타 제 ^2에 의해 APP에서 ectodomain의 제거를 시작합니다. 남은 잔류 물을 99 카복실 말단 단편 (CTF)는 Aβ ^3-7을 생산하는 γ 세 크레타 제에 의해 절단 될 수있다. 많은 실험 엔도 솜 / 리소좀 시스템으로 세포 표면에서 내재화 후 세포 표면 APP의 분열을 설명하고 있지만, 최근 다수의 연구는 APP의 세포 트래 피킹 또한 그 처리 ^8-11을 조절하는데 중요하다는 것을 제안 하였다.

γ 크레타 제 저해제 및 아밀로이드 베타 immun으로 Aβ의 수준을 조절에서 시도의 숫자가 있었다otherapies. 그러나, 이들 치료법에 대한 최근의 임상 시험은 경우에 ^피해를 야기 ^12, 더 유익 없었다하고. 아밀로이드 베타의 생산을 조절하는 개발되지 않은 전략은 APP의 하위 세포 현지화 및 γ-크레타 제의 상호 작용을 변경하는 것입니다. 골지, 세....

프로토콜

1. 전지 도금 및 형질

1. 세포 배양 후드에서, 플레이트 ~ 300,000 ~ 500,000 SN56 세포 (박사 제인 Rylett의 일종 선물) 35mm의 유리 바닥 공 초점 접시에와 (둘 베코의 수정 이글 배지, DMEM는, 보충 사전 형질 미디어 커버 10 % FBS).
2. 증식 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
   참고 : 세포가 약 50 %의 형질 전환 이전에 70 %의 합류해야한다.
3. 세포 배양 후드에서, 형광 단백질을 발현하는 플라스미드 트랜 세포는 형광 단백질 여기 구획 표식 (태그 리소좀 관련 막 단백질 1 LAMP1를 태그 TGN 마커 (GALT-CFP 시안 형광 단백질에 결합 갈 락토 실 전이 효소)를 태그 MRFP), 및 paGFP (βAPP-paGFP 태그 관심의 단백질). (이러한 구조는 이전 ³⁰ 기재되어있다)
4. 형질 전환 시약 및 플라스미드 DNA의 F와 세포를 품어또는 5 % CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 24 시간. 최적의 균형 세포 독성 및 형질 전환 효율을 형질 에이전트의 5 μL (예를 들어, 리포 펙 타민 2000)에 DNA의 ~ 2 μg의 비율을 사용합니다. 실....

결과

일반적인 결과는 βAPP (그리고 그림 1a b)는 TGN를 떠나 빠르게 램프 1 트래픽에 나타납니다 보여줍니다. 광 활성화 기간 동안에, 소체는 리소좀 (도 1B)로 향하는 골지체를 벗어남을 알 수있다. TGN에서 사진 활성화가 동안 억제제 치료를하지 않으면, paGFP 형광은 리소좀에서 볼 수 있습니다. photoactivation을 중지 한 후, βAPP-paGFP 빠르게 (1B에 그림 1a 비교) 리소좀에서 지워집니다. nocodazole과 치료는 구획을 표시 GALT - CFP 내에서 응용 프로그램의 축적에 이르게와 리소좀 (그림 1C)에 인신 매매를 방지 할 수 있습니다.

APP 스웨덴 변이 (APPsw)은 10 배 ^(34)에 의해 β-분열의 속도를 증가시킨다. βAPPsw-paGFP의 급속한 분열로, paGFP 형광은 세포질.......

토론

이러한 기술은 후속 매매 및 분열을 시각화 TGN에 paGFP 태그 막 단백질의 정확한 광 활성화를 설명한다. paGFP ²⁵ 일 전 십 년간 생성 된 반면,이 하류 구획에 초기 단백질의 인신 매매를 수행하는 정확한 사진 활성화의 첫 번째 예입니다. APP-paGFP를 사용하여 이전의 연구 사진을 활성화 골지 ^(11)로 간주 된 세포의 요정 핵 영역을 구성한다. 그러나, 우리의 현미경 사진, 리소좀, 초기 엔도 좀, 늦게 엔도 좀 같이 분명 또한이 지역 (그림 1 참조 30)에서 찾을 수 있습니다. 마우스 뉴런의 형질 전환 효율이 낮지 만 이들 실험은 HEK293 세포, COS7 세포, 신경 세포 SN56, SH-SY5Y 세포와 마우스 뉴런에서 성공적으로 실행되어왔다. 유사한 실험은 지난 112 아미노산을 포함 전체 길이 APP 구조 단축 구조를 사용하여 수행되었다APP의 산은, β- 및 γ-분열 사이트와, paGFP에​​ 융합. 단축 제물 형질과 높은 형광.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 유리 바닥 문화 접시	Matek	P-35G-1.5-20-C
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	Life Technologies	14190-144
Hanks Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-092
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
Dulbecco의 Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	15140-122
디부티를 순환 AMP	시그마	D0627
활성화된 태아 소 혈청 내 열	Life Technologies	10082147
가열 현미경 스테이지 인서트 P	PeCon GmbH
Tempcontrol 37– 2 디지털 2채널	PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META 레이저 스캐닝 현미경	레이저 다이오드, 아르곤 레이저, HeNe1 레이저가 장착된	Carl Zeiss
63X 1.4 개구 오일 이멀젼 렌즈	Carl Zeiss
L685, 458	EMD Millipore	565771	DMSO
cholorquine에	시그마	C6628	물에 용해
Nocodazole	Sigma	M1404	DMSO
디메틸 설폭사이드	시그마	472301
이마리스	Bitplane

용해됩니다.는 에 용해되었습니다.공동 현지화 패키지가 있는