방법 논문

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

⸱

2015년 12월 22일

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

이 논문에서

요약

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단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

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단백질-단백질 상호작용(PPI)은 생물학의 핵심 분자 사건입니다. 그러나 기존 광학 현미경의 해상도는 회절이 ~250nm로 제한되기 때문에 세포에서 충분한 해상도와 감도로 PPI를 시각화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 광활성화 국소화 현미경(PALM)을 결합하여 단일 분자 감도와 나노미터 공간 분해능으로 세포에서 PPI를 시각화할 수 있습니다. BiFC는 형광 단백질을 두 개의 비형광 단편으로 분할하는 형광 대비로 PPI를 시각화하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다. PALM은 광활성 형광 단백질(PA-FP)과 같은 광변형 가능한 형광 프로브를 사용하여 나노미터 및 단일 분자 규모에서 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 최신 초고해상도 현미경 기술입니다. BiFC-PALM은 PALM과 호환되는 PA-FP인 PAmCherry1을 분할하여 단량체 특성, 우수한 단일 분자 밝기, 높은 명암비 및 화학량론 측정에 대한 유용성을 입증했습니다. 아미노산 159와 160으로 분리할 때 PAmCherry1은 PPI에 대한 특이성이 높고 비특이적 재형성이 낮은 37°C에서 효율적으로 재용해되는 BiFC 프로브로 만들 수 있습니다. Ras-Raf 상호 작용은 BiFC-PALM이 나노미터 규모 및 단일 분자 분해능으로 상호 작용을 조사하는 데 어떻게 도움이 되는지 보여주기 위한 예로 사용됩니다. 이들의 확산은 단일 분자 추적(smt-) PALM을 사용하여 살아있는 세포에서 추적할 수도 있습니다. 이 프로토콜에서는 BiFC-PALM을 위한 융합 단백질을 설계할 때 고려해야 할 요소에 대해 논의하고, 시료 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석 단계를 설명하고, 몇 가지 예시적인 결과를 보여줍니다. 높은 공간 분해능, 특이성 및 감도를 제공하는 BiFC-PALM은 온전한 생물학적 샘플에서 PPI를 연구하는 데 유용한 도구입니다.

서론

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단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 생물학 1 기본적인 단단히 많은 시간과 길이 스케일에서 시공간 메커니즘을 통해 조절된다. 세포막 시그널링 세포에 관한 연구는 예를 들어, 특정 프로톤 펌프 억제제 및 세포 과정 (2)을 용이하게 동적 나노 스케일 공간 구획을 밝혀냈다. 따라서, 충분한 공간 및 시간 해상도, 높은 특이성 및 고감도 생물학적 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 검사 할 수있는 능력은 생물의 기계적 이해를 달성하기위한 키이다.

5 - 이분자 형광 보완 (BiFC)는 세포 내 해상도와 라이브 셀 호환성 3 셀에 프로톤 펌프 억제제를 시각화에 대한 몇 가지 기존 도구 중 하나입니다. 이 기술은 비교적 간단하고 두 비 형광 조각으로 형광 단백질의 분리를 포함한다; 유전자 두 개의 상호 작용하는 단백질에 태그 때근접하게, 단편은 형광 신호를 산출 완전한 형광 단백질을 형성하도록 재구성 할 수있다. 적절하게 설계하면 BiFC 프로브 자발적 프로톤 펌프 억제제의 부재하에 재구성 안된다. 이와 같이, BiFC 분석에서의 형광 신호 만 높은 특이성 프로톤 펌프 억제제의 직접적인 시각화를 가능하게 프로톤 펌프 억제제의 존재하에 일....

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프로토콜

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1. 복제

  1. 복제와 링커를 선택할 수있는 구성을 결정합니다. 그들의 적절한 현지화을 방해하지 않도록 N- 또는 C- 말단에 파편 태그 단백질은 아래에 설명 된대로. 이러한 (GGGGS) X2로 유연한 링커를 사용합니다.
  2. 유전자 PAmCherry1 조각에 관심있는 단백질에 태그를. 하나의 옵션으로, MCS 시퀀스를 측면으로 조각 RN (PAmCherry1 잔류 1-159) 및 RC (메트로 플러스 PAmCherry1 잔류 물 160-236)를 포함하는 재료 목록에 나열된 복제 플라스미드를 사용합니다.
    1. 삽입 포인트에서 단편 RN 및 RC와 역 PCR (또는 제한 다이제스트)을 함유하는 플라스미드를 선형화. 역 PCR 프라이머는 표 1에 나와 있습니다. 아래는 저자의 실험실에서 사용되는 예 PCR 프로토콜 (이 프로토콜에서 사용되는 정확한 자료에 대한 자료 목록 참조).
      1. 물을 50 μL의 최종 부피로 자랐다 함께 PCR 반응 믹스 : 얇은 벽ED PCR 튜브, 물, 배 마스터 믹스 25 μL, 순방향 및 역방향 프라이머의 0.5 μL 각 (20 μm의 희석 주식, 0.2 μm의 최종 농도) 및 템플릿의 1 NG를 추가합니다. 다음 사이클링 조건을 사용하여 98 ° C를 30 초, 98 ° C의 30....

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결과

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표시된 BiFC-PALM 예제 CRaf의 도메인 (RBD) (그림 1A)를 결합 라스와 상호 작용 KRAS G12D 돌연변이입니다. 논의 된 바와 같이 그것의 라스 막 지역화 때문에 생물학적 활성을 방해 할 것이기 때문에, RN 또는 RC 라스 단편의 C- 말단에 태그되지 않았다. 이 네 가지 (그림 1B)에 여덟에서 가능한 조합을 감소시켰다. 이러한 네 개의 조합들 각각은 렌티 바이러스를 사용하여 감염 U2OS 세포에 도입 하였다. 프로토콜에서 설명하는대로 세포를 고정하고, BiFC 신호는 팜 설정을 사용하여 평가 하였다. 405 nm의 레이저가 켜져 때 긍정적 인 BiFC 신호와 세포 형광의 급격한 증가에 의해 확인되었다; 561 nm의 레이저 이미징 실험 내내이었다. 형광이 갑작스러운 변화는 405 nm의 레이저와 조명에 따라 BiFC-재구성 PAmCherry1의 photoactivati​​on 때문이다. 샘플의 복수의 영역은이 방법을 사용하여 평가 하였다및 B.......

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토론

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PALM 그대로 생체 시료의 나노 이미징을 가능하게하는 최근 단일 분자 수퍼 해상도 현미경 기법 동안 BiFC는 검출 셀에서 프로톤 펌프 억제제를 시각화 기술에 일반적으로 사용되어왔다. 손바닥 BiFC의 조합은 나노 미터 공간 해상도와 단일 분자 감도 세포 내에서 프로톤 펌프 억제제의 선택 영상을 달성했다. BiFC-PALM은 두 가지 기술의 유틸리티를 확장하고,이 연구에서 입증 된 바와 같이, 그 나라의 셀룰러 맥락에서 프로톤 펌프 억제제의 분자 세부 사항을 공개 큰 약속을 보여줍니다. 특히, 나노 미터 해상도는 생물 의학 연구에 도전하고있다 분자 규모에서 특정 프로톤 펌프 억제제의 공간 및 시간 규제, 자세한 조사를 할 수 있습니다. 앞서 언급 그러나, BiFC-PALM은 보완 느린 발색단 성숙의 비가역성에 의해 제한된다.

스플릿 PAmCherry1은 원칙을 증명하기 위해 사용 된 UBiFC-PALM의 tility. PAmCherry1 널리 우수한 광 물리 특성에 대한 P.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 Steven Chu 박사와 Joe W. Gray 박사, BiFC-PALM 프로젝트의 초기 작업에 대해 Henry Marr, 기술적 도움을 준 Alexis Shoemaker에게 감사를 표합니다. 이 작업은 OHSU에서 X.N.으로 시작하는 창업 자금으로 지원됩니다. Nan 실험실의 연구는 NIH 5U54CA143836-05, Damon Runyon 암 연구 재단, MJ Murdock 자선 신탁 및 FEI 회사의 지원도 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
현미경 프레임NikonTi-U
60X 오일 이멀젼 TIRF 대물렌즈(1.49 NA포함) NikonCFI Apo TIRF 60x H
EMCCD 카메라AndoriXon Ultra 897
561 nm 레이저옵토 엔진MGL-FN-561
405 nm 레이저CoherentCUBE-405 50mW
561 nm 이색성 미러셈록  Di01-R405/488/561/635-25x36
561nm 필터SemrockFF01-525/45-25
405/561nm 노치 필터SemrockNF01-405/488/568-25
온도 및 CO2 제어 단계Tokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgene
http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD 클로닝클론텍639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus PackagingLife TechnologiesK497500
X-tremeGENE 형질주입 시약Roche13873800
Lab-Tek II 챔버 커버 글라스Thermo Scientific155409#1.5 유리 바닥 접시
U2OS 셀ATCCHTB-96
293T/17 셀ATCCCRL-11268
페놀 레드 DMEM라이프 테크놀11995
DMEM 페놀 레드라이프 테크놀21063
태아 소 혈청라이프 테크놀10082
Leibovit's L-15, 페놀 레드 없음라이프 테크놀스 21083-027
감소 혈청 매체라이프 테크놀스31985
인산염 완충 식염수Life Technologies14040
주사기BD Biosciences309604
주사기 필터MilliporeSLHV033RB
렌티바이러스 농축기Clontech631231
레트로바이러스 농축기Clontech631455
10cm 배양 dishBD Biosciences353003
6-well culture plateBD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycin
DoxycylineFisherBP2653
Tris base피셔BP152
EDTA시그마EDS
수산화나트륨시그마S5881
파라포름알데히드시그마158127
글루타르알데히드시그마G6257
파이프시그마P6757
HEPES시그마H4034
EGTASigma3777
황산 마그네슘SigmaM2643
수산화 칼시그마221473
염화나트륨FisherBP358
염화 마그네슘FisherM33
100nm 금 입자BBI SolutionsEM. GC100
분자 등급 물Life Technologies10977
Dpn1New England BiolabsR0176
PCR 정제 키트Qiagen28104
Miniprep 키트Qiagen27104
Midiprep 키트Macherey-Nagel740410
0.6 ml 마이크로 원심 분리기 튜브Fisher05-408-120
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브Fisher05-408-137
15ml 튜브Fisher05-539-12
5ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브BD Biosciences352063
14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브BD Biosciences352059
50ml 튜브BD Biosciences352070
PCR 튜브GeneMateC-3328-1
SOC 매체Life Technologies15544
LB 육수BD Biosciences244610
Kanamycin sulfateFisherBP906
유능한 세포Life TechnologiesC4040
MatlabMathworks
스 스 스 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.

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재인쇄 및 허가

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태그

Ras Raf

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