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방법 논문

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

10K 조회수

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DOI:

10.3791/53156

⸱

2015년 9월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Department of Bioengineering, Clemson University

이 논문에서

요약

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

초록

조직 공학은 기능하지 않거나 손상된 조직의 대체품 구성에 중점을 두고 있습니다. 조직 공학에서 3차원 바이오프린팅을 활용하면 생체 모방 조직 구조를 제작하기 위해 세포와 매트릭스를 프린팅하는 새로운 방법이 생겨났습니다. 3차원 바이오프린팅을 위해 개발된 SFF(Solid Freeform Fabrication) 방법은 세포와 하이드로겔의 방울을 층별로 증착하는 적층 제조 접근 방식을 사용합니다. 바이오프린팅 제작은 3차원 구조에 생물학적 물질을 구체적으로 배치하는 것에 따라 달라지며, 프린팅된 구조는 천연 조직에서 세포 및 세포 외 기질의 복잡한 조직을 밀접하게 모방해야 합니다. 이 논문은 데카르트 바이오프린터인 팔메토 프린터(Palmetto Printer)의 사용과 공간적으로 조직되고 실행 가능한 구조를 생산하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있는 프로세스를 강조합니다. 이 방법론은 CAD(Computer-Aided Design) 및 CAD(Computer-Aided Manufacturing)를 활용하여 이러한 구체적이고 복잡한 형상을 생성합니다. 마지막으로, 이 접근 방식을 사용하면 제어 가능한 인쇄 매개변수에 의해 최적화된 제작된 구조물을 재현 가능한 생산으로 만들 수 있습니다.

서론

조직 공학은, 유지, 복원 또는 기본 조직을 강화하고 기능 대체의 개발에 생물학 및 공학의 원리를 사용합니다. 조직 공학뿐만​​ 아니라 세포 기반 센서, 약물 / 독성 검사, 조직 또는 종양 모델 및 기타 과학 및 기술의 발전을 촉진 할 필요에 입체 생체 모방 형 구조를 생성하는 능력. 면밀히 세포 및 조직에서의 원시 세포 외 기질의 고도로 조직화 된 상호 작용을 모방해야하므로 조직 공학 구조물의 3 차원 조직의 제조 방법의 기본적인 구성 요소이다.

생분해 성 및 성형 가공 삼차원 지지체는 세포가 세포의 이차원 층을 형성하기 때문에 신규 이주 조직 구조를 생성하는 중요한 요인이 있지만 선호 입체에서 성장하는 능력이 부족하다. 지지체는 세포의 임시 토대가됩니다부착 및 증식, 그래서 제어 다공성 생분해 성, 그리고 충분한 기계적 integrit와 물질로 구성되어야한다. 지지체 물질은 세포 독성이거나 호스트로부터 부정적인 반응을 만들면 안됩니다. 하이드로 겔은 일반적으로 조직 공학 기술에 사용되어 왔으며, 그들의 친수성 ​​하이드로 겔은 structur 걸쳐 유체 및 가스 교환을 허용한다. 다른 하이드로 겔을 조합하여, 합성 하이드로 겔의 특성은 별개의 애플리케이션 요건을 충족시키는 수정 가능하다.

기존의 조직 공학 방법은 세포 후 FABRICATIO 파종되는 무 세포 다공성 희생 비계의 생성을 포함한다. 많은 기술들은 섬유 접합체, 주조 용매로서 사용하고, 용융 성형하지만, 조직 공학 응용을위한 최소한의 성공적인 것으로 입증되어왔다. 섬유 접합 방법은 섬유가 특정 형상으로 배열 될 수 있도록하지만, 이들은 프로 만 할 수있다매우 얇은 비계으로 줄. 용매 주조 방법은 다공성 구조를 생성하지만 큰 제조 막은 thic 만 3 mm였다. 따라서, 입체적인 구조물을 만드는 것은 이러한 기술을 이용하여 가능하지 않다. 용융 성형 기술은 삼차원 지지체의 제조에 성공 입증 있지만, 이러한 고온은 생물학적 물질 생산 사전 처리 중에 혼입 될 수없는 것이 요구된다. 지지체는 미리 정의 된 또는 가변 마이크로 및 3 차원 지지체를 제조하는 조직 공학의 요구 사항을 충족 할 수있는 능력에 제한이 후 제조 시드. 고체 지지체에 파종 기술과의 또 다른 주요 문제는 혈관과 가난한 기계의 부족이다.

Bioprinting 이후 종래의 단점을 극복하는 비 독성, 생분해 성, 열 가역성 겔의 사용을 통해 입체적으로 확장되었다. 고체 프리폼 제조 t의 몇현재 사용중인 echniques 레이저를 이용한 bioprinting 및 잉크젯 인쇄입니다. 레이저를 이용한 bioprinting 기법 펄스 레이저 소스, 타겟 판과 입체감을 생성하는 수용 기판을 사용한다. 그러나,이 기술로 인해 낮은 스루풋, 낮은 세포 생존에 한정되고, 단지 광경 화성 프리폴리머는 가교 하이드로 겔을 형성하는데 사용될 수 있기 때문에, 제조 된 구조에만 한정 배열을 생성 할 수있다. 잉크젯 인쇄는 피코 리터의 잉크를 증착함으로써 기판 상에 디지털 화상 데이터를 재생 비접촉 방법으로 개발되었다. 그러나, 고해상도의 구조를 생성하지 않는 잉크젯 인쇄는, 경험 빠른 단백질 변성을 구성하고, 세포의 대부분은 증착 동안 용균.

현재, 새로운 첨가제 bioprinting 제조 방법이 개발되었다. 이러한 시스템에서 세포, 단백질, 성장 인자, 및 생체 모방 하이드로 겔은 일반적으로 매트릭스 메이터에 통합IALS 제조 공정 중에 동시에 밀접 고유의 미세 구조를 모방 한 입체 지지체 계 세포 함유 구조물을 생성하기 위해 컴퓨터 제어 액추에이터를 이용하여 증착. 세포 함유 하이드로 겔은 여러 세포 유형, 또는 균질 이루어진 이질적 일 수 bioink를 구성한다. 첨가제 제조 시스템 금고 bioink 드롭하여 놓기 X, Y, Z 방향으로 이동 가능한 컴퓨터 제어 또는 스테이지로 층별 일회용 주사기 팁 비아. 컴퓨터 소프트웨어를 통해, 인쇄 된 스캐 폴드의 구조가 용이하게 어플리케이션의 요구 사항에 따라 조작 될 수있다. 종래 기술과는 달리 입체 의료 기술 (자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영) 환자 별 구조를 생성, 디자인에 혼입 될 수있다. 작 제물은 더 높은 L로 제조되기 때문에 이러한 방법들은 또한 혈관 교체 제조 가능성을 허용OCAL 세포 밀도, 세포 - 세포 상호 작용을 허용하고 사후 주입 surviva의 가능성을 향상시킨다.

팔메 프린터 입체 이종 조직 구조 (도 1)를 생성하기 위해 프로그램 가능한 로봇 제조 방법을 사용하여 지정 구축 입체 멀티 디스펜서 시스템이다. 이 고유 조합의 복수의 재료의 사용은 이종 구조를 제조 할 수있다. bioprinter의 초기화는 당신이 bioprinted 구조의 인쇄 성을 최적화하기 위해 다양한 매개 변수를 설정할 수 있기 때문에 bioprinting에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다.

bioprinter은 사용자가 대화 형 터치 스크린 제어 패널을 통해 동작하는 프로그래머블 로직 컨트롤러 (PLC) (도 1)에 의해 제어되는 기동, 동작 및 종료 순서와 배치 식 공정을 포함한다. 생체의 오염을 방지하기 위해서논리 재료 bioprinter가 양으로 압력을 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 묶인 고효율 미립자 arrestance (HEPA)와 (PMMA) 챔버 공기 순환 시스템을 -filtered (도 1, B, C). 프린터 내부에는 내장 자외선 광원 (도 1, D)를 사용하여 멸균 할 수있다. bioprinter의 핵심 구성 요소는 재현성 10 마이크로 미터 (그림 1, E)의 정확도로 디스펜서 팁을 배치 할 수 있습니다 완전히 프로그램 위치 로봇입니다. 로터리 스크류를 사용하여 230 NL (그림 1, F)로 작은 볼륨을 입금 할 수있는 세 가지 디스펜서가 있습니다. 그들은 각각의 디스펜서에 대한 (그림 1, G)를 인쇄 매개 변수를 관리하는 별도의 컴퓨터를 사용하여 독립적으로 프로그래밍 할 수 있습니다. 회전 축 디스펜스 주사기 아래 팁 주사기 밖으로 이동 bioink 전동 스크류의 회전을 이용한다. 이 디스펜서는 pneumatical에 장착된다LY 제어 도구 네스트 (도 2A는, B), 로봇 제어 프로그램 (도 1, H) 하에서 Z 축 로보트 팔에 장착 된 디스펜서를 전환 할 수 있도록.

XYZ 로봇 (그림 1, I)를 실행하는 컴퓨터 디자인 소프트웨어에서 인쇄 명령을받습니다. 각 프로그램은 분배 위치, 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 각 디스펜서 물질을 증착 곳에 주로 XYZ로 구성되어 생성 된 구조의 디자인은 조정합니다. bioprinter는 XYZ이 시린지 선단의 좌표를 결정하는 두 개의 광학 광 센서 (도 2C)을 포함한다. 이 센서는 디스펜서 선단의 위치를​​ 계산하기 위해 다음을 사용하여 로봇에 좌표 정보를 보냅니다. ACCURA와의 거리를 측정하기 위해 30 × 100 마이크로 미터의 스폿 크기 633 nm의 적색 레이저 다이오드 빔을 투영 추가적인 변위 레이저 (도 2D)가 존재0.1 마이크로 미터의 CY. 빔이 고도로 집중되는 경우 로봇이 인쇄면의 Z 거리를 결정한다. 이 측정 및 Z의 선단의 광학 광 센서 측정은, 정확한 Z의 산출이 인쇄면에 대하여 팁 디스펜서를 배치하는 데 사용되는 좌표를 허용한다. 디스펜서 팁 Y 및 Z 센터를 찾는 X 축 배향 된 광학 광 센서를 통해 측 방향 및 수직으로 이동하고, 측 방향으로 Y 축 센서를 통해 X 축의 중심을 찾는. 표면이 분배 선단의 위치에 상대적인 위치를 결정할 CZ + = d만큼 도끼 + : 인쇄면은 XYZ 공간에서 평탄면에 대한 식을 사용하여 매핑된다. 프린터 단계 (그림 1, j)는 직경 80mm에 샘플 페트리 접시를 보유하고 설정 온도 (그림 1, K)를 유지하기 위해 재순환 수조를 사용합니다. 스테이지 온도는 -20의 범위로 설정하고 내에 안정적으로 유지 될 수있다. USB 카메라가 1 마운트Z 로봇 아암 상에 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 분배 팁의 확대도를 제공한다. 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 bioprinter의 완전한 뷰를 제공하는 챔버 내부의 상단을 향해 장착 번째 카메라가있다.

컴퓨터 지원 설계 드로잉 소프트웨어는 증착 패턴을 결정하고, 사용자가 점진적으로 이격 방울과 복잡한 구조 (도 3)를 생성하도록 허용한다. 세 가지 차원 경로를 수동으로 프린터와 호환되는 디자인 소프트웨어에 코딩 또는 별도의 컴퓨터 지원 설계 도면 소프트웨어 (그림 4, 표 1)에서 가져올 수 있습니다. 프린터 호환 소프트웨어 허용 같은 시린지 선단과 SUBST 사이 증착법 (단일 액적 증착 또는 연속적인 통로 증착) 경로의 입체 기하학, 증착 속도, 거리로 인쇄 파라미터 변동레이트 인쇄 표면, 개별 방울 및 높이를 증착하고 주사기를 가속화하는 시간은 방울의 증착 사이에 상승된다. 각 프로그램은 인쇄 중, 운영자의 개입없이, 무균 환경을 제공하기 위해 XYZ 분배 위치, 팁 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 로봇의 프로그램 가능한 논리 제어기 (PLC)를 설계 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터 명령어를 수신하고, 외부 컨트롤러의 이벤트의 타이밍 (예를 들면, 디스펜서)를 제어한다.이를 위해, PLC는 디스펜서를 제어하는 반복 기법을 사용 로봇 위치 결정 장치, 및 환경 요인.

회전 축, 액체 분배 시스템을 이용하여 입체적인 직접 기록 bioprinting보​​다 효율적 정확하고, 이전의 방법보다 쉬울에 셀을 증착하는 프로세스를 허용한다. 이 연구는 사용자 정의 내장 bioprinter는 CE를 생성 할 수 표시높은 세포 생존과 LL 함유 하이드로 겔 구축합니다.

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프로토콜

알긴산 히드로 겔의 3 차원 Bioprinting에 대한 젤라틴 함유 기판 1. 준비

  1. 고 함량의 감소와 연관된 가능성을 피하기 위해 Pataky 등 11에 의해 기술 된 칼슘 / 젤라틴 기재 방법에 따라 칼슘 / 젤라틴 기판을 준비한다. 칼슘 / 젤라틴 기판 방법은 아래에 나열되어 있습니다.
    1. 증류수에 염화칼슘에 탈수 (1.5 중량 %), 염화나트륨 (0.9 중량 %), 및 돼지 젤라틴 (2 중량 %)을 합하여 100 mM의 젤라틴 용액을 만들기 위해 2 분 동안 끓인다.
  2. 젤 O에 냉장고에 평평한 표면에, 100mm 표준 배양 접시에 젤라틴 / 칼슘 용액 5 ㎖를 붓고 심지어 표면에 코팅하기 위해 주변의 솔루션을 소용돌이, 장소 / N은 ​​(GEL 할 수 있도록 최소한 8 사용하기 전에 시간).
  3. 젤라틴 / CaCl2를 용액에 산화 티탄 (0.3 중량 %)를 추가하고, 기판 표면의 불투명도를 증가. 10 분 동안 교반한다. AUT그것을 살균 30 분 동안 액체 사이클에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액을 oclave.
    1. 이전에 조제한 젤라틴 판의 표면에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액 3 ㎖를 추가한다. 이 고르게 표면에 분산되어 있는지 확인하기 위해 혼합물을 소용돌이. 4 ° C 냉장고 O에 젤을 허용 / N (사용하기 전에 적어도 8 시간 겔 할 수 있습니다). 기판 3 일 이내에 사용해야합니다.

2. 알긴산 산화

  1. 후술 Bouhadir 동부 등 30에 의해 부분적으로 산화 알긴산 방법 다음 소듐 알지네이트 bioink 산화.
    1. 5 % 산화 알지네이트 용액을 증류수 100ml에 알긴산 나트륨 1g을 용해. 5 %의 산화 용액을 제조, 요오드 산 나트륨 수용액 (0.25 M, 0.25 밀리몰), 산화제를 추가한다. 실온에서 19 시간 동안 교반한다. REA을 종료 24 시간 후, 용액에 40 ml의 에틸렌 글리콜을 추가ction의.
    2. 용액에 염화나트륨 2.5 g을 용해. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 1,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기 및 증류수을 다시 녹인다. 에탄올 세척을 반복합니다.
    3. 동결 건조는 사용 전까지 -20 ° C에서 산화 알긴산 펠릿 저장합니다.
  2. 나트륨의 비율을 측정함으로써, 산화의 정도를 확인 에틸렌 글리콜에 의해 종료되기 전에 소비 요오.
    1. 요오드화 칼륨 용액 (V / w 20 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)과 thyodene 용액 (V / w, 10 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)을 준비한다. 실온에서 산화 알긴산과 두 개의 솔루션을 섞는다.
    2. 서서히 요오드화 칼륨과 theodyne 용액을 반응 혼합물에 알긴산 나트륨과 요오드 용액을 드롭. 분광 광도계로 426 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정한다. 이 도달하면최대, V 1과 알긴산 나트륨과 요오드 용액의 부피 이용을 기록한다.
    3. 반응은 figure-protocol-1 . 반응 요오드 산 나트륨의 양은 figure-protocol-2
    4. 나트륨의 양은 요오드 섭취를 결정하기 위해 원래의 농도에서 반응과 요오드 산 나트륨의 양을 뺀다. 이전의 공식을 사용하여, 아르 긴산의 최종 산화 정도를 결정한다.

3. 알긴산 펩타이드 활용

  1. 세포 부착 및 확산을 촉진하기 위해 아래에 설명 로리 등 (31)에 의해 RGD-알긴산 활용 방법을 수행하여 이전에 제조 된 산화 알긴산에 노출 된 아르기닌 - 글리신 - 아스 파르 테이트 시퀀스 (펩타이드)와 복합체 리간드.
  2. 수성 carbod를 사용하여G 4 RGDSPto 접합체 (31)와 iimide 화학.
  3. 0.1 M 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 5 % 산화 알긴산 1g을 용해 (MES) 완충액 (pH는 4 = 1- 에틸 - (디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC, 0.54 밀리몰)를 첨가하고, N- 히드 록시 2에서 NHS, 0.27 밀리몰) : 1 비율 아미드 중간체를 형성한다.
  4. 터미널 아민 통해 알기 네이트 중합체의 백본에 0.28 밀리몰 펩타이드, 커플 링을 추가합니다. RT O / N에서 저어.
  5. 용액에 2.5 g의 염화나트륨을 첨가하여 커플 링 반응을 정지. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 5 분 동안 4,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 세포 배양 후드에서 미디어 대기음 증류수에 침전을 재용. 에탄올 세척을 반복합니다.
  6. 이 완전히 건조 될 때까지 (흰색 가루 물질로 나타납니다) 침전물을 건조 동결하고 나중에 C 냉장고 °에서 -20 저장사용합니다.

4. 인간 지방 조직의 기질 세포 (hADSC의) 세포 배양

  1. 배양 인간 지방 조직의 간질 세포 (hADSC의) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 %의 글루타민, 및 1 % antimycin 15 ml의 낮은 글루코스 DMEM 덮여 세포 배양 플라스크 (T75 플라스크) 처리 75cm에서. 그들은 포화 상태 (80~90%)에 도달 할 때까지 매 2 일 세포 배양 후드에서, 미디어를 변경합니다.
  2. 합류 후에 세포 배양 후드 T75 플라스크를 전송하고 hADSC 이제 트립신 효소 절단 방법을 사용하여 정지.
    1. 후드, 셀 오프 세포 배양 배지를 모두 대기음. 칼슘과 마그네슘 (DPBS ++)와 둘 베코 인산염 완충 식염수 5 ㎖로 씻어. 세포 떨어져 DPBS ++를 대기음.
    2. 후드에있는 동안, 1 ml의 트립신 4 ml의 DPBS ++를 혼합하여 트립신과 DPBS ++의 솔루션을합니다. 각 플라스크 오디오 솔루션을 5 mL를 필요이온 그래서 합류 플라스크의 수에 해당하는 부피를. 각 플라스크에 트립신 / DPBS ++ 5 mL를 추가하고 2 분 동안 인큐베이터에 넣어.
    3. 2 분 후, 플라스크를 제거하고 가볍게 바닥에서 세포를 풀어 그들의 측면을 누릅니다. 세포가 일시 중단됩니다 확인하기 위해 현미경으로 각 플라스크 봐. 다시 세포 배양 후드에서 플라스크를 배치하고, 각 플라스크에 적당한 세포 배양액 3 ㎖를 추가한다. 이 트립신 반응을 종료합니다.
    4. 각 플라스크에서 세포 함유 미디어를 전송하고 50 ML 원뿔에 넣어. 5 분 동안 1,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 세포는 원뿔의 바닥에 작은 흰색 펠렛으로 표시해야한다. 다시 세포 배양 후드에 전송하고 미디어를 대기음. 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁.
    5. 현미경을 이용하여 혈구 세포를 카운트. 세포가 계산되고 나면, 미디어 배양 후드에서, 분취 량은 1.3 ~ 만 달러를 포함N 세포와 15 ML 원뿔로 전송. 원심 1,000 x g에서 5 분 동안 다시 세포를 함유하는 15 ml의 원추형.
    6. 배양 후드에서, 각각의 플라스크에 ~ 350,000 세포의 농도를 첨가 여러 T-75 플라스크에 남아있는 세포를 시드. DMEM 매체의 15 ML을 추가하고 다시 합류 할 때까지 인큐베이터로 돌아갑니다.
    7. 원심 분리기 사이클이 완료되면, 세포 배양 물에 15 ml의 원추형을 반환. 세포 펠렛으로부터 미디어 대기음, 종종 용액을 terteriating, bioink의 밀리리터 당 130 만개의 세포 농도로 수성 알지네이트 용액에 세포를 재현 탁하여 그렇게 bioink 걸쳐 세포의 분포가 균일하다. 멸균 프린터 호환 3 ML의 주사기로 세포 함유 솔루션을로드하고 멸균 22 G 플라스틱 팁에 나사.

5. Bioprinter 설정

  1. bioprinter, 디스펜서 각 컴퓨터 및 recirculat를 켭니다물 목욕을 보내고.
    1. 수동으로 겔화 메커니즘에 재순환 수조 온도를 설정합니다.
    2. 수동으로 상관 디스펜서 컴퓨터의 각 디스펜서에 대한 인쇄 매개 변수를 설정합니다. 0 backsteps 230 NL, 수에 분배 볼륨을 설정하고 분배 비율은 -sec 10μL 할 수 있습니다.
  2. 설계 소프트웨어와 컴퓨터의 USB 카메라의 디스플레이를보기위한 프로그램을 연다.
    1. 소프트웨어를 사용하여 수동으로 방울 사이에 2.4 mm의 간격이 5 × 5 점 배열에 대한 좌표를 입력합니다.
    2. 로 인쇄 매개 변수를 설정 선단과 기판 표면 사이의 거리 = 0.1 mm; 높이 주사기가 증언 사이에 상승 = 20mm; 당 증착 시간은 1 초 =.
    3. 프로그램을 저장하고 로봇을 보낼 수 있습니다.
  3. 4 ° C 프린터 무대에 젤라틴 / 이산화 티탄이 함유 배양 접시를 놓습니다. 닫고 챔버 문을 잠급니다.
  4. INI하기 위해 PLC를 사용하여자외선 광원 tialize, 90 초 동안 살균 챔버.
  5. 살균이 완료되면, 챔버를 열고 hADSC의 건에 알긴산 현탁 1. 근접 함유 주사기를로드 챔버 도어를 잠글.
  6. 팬 시스템을 켜 평형 내부 압력이 30 초를 기다려야 PLC를 사용합니다.
  7. 컴퓨터에서 기하학적 경로 및 인쇄 매개 변수를 포함하는 프로그램을 실행합니다.
  8. 인쇄 프로세스를 통해, 정확하고 균일 한 인쇄를 확인하기 위해 컴퓨터에 USB 카메라의 디스플레이를 본다.
  9. 인쇄가 완료되면, 구조는 40 분 동안 겔 할 수 있습니다.

6. 세포 생존 능력 평가

  1. 영상의 시간이 될 때까지 인큐베이터에서 즉시 DMEM에서 후 인쇄 및 저장을 이미지화 될 수 없습니다 구조를 커버.
  2. 구조물의 생존율을 정량화하기 위해, 형광 기반 생존력 / 세포 독성 분석을 사용하여 염색공 초점 현미경을 사용하여 차의 이미지입니다.
    1. 키트 지시에 따라, 칼 세인 AM을 및에 티듐 호모 다이머 -1을 함유하는 염색 액을 준비한다. , 염색 액 10 ㎖을 에티 디움 호모 다이머-1의 20 μL와 칼 세인의 5 μl를 추가하려면 멸균 10 ㎖에 오전, 조직 배양 등급 둘 베코 인산염 완충 식염수 (+ 마그네슘 + 칼슘, DPBS ++).
    2. 어둠 속에서 15 분 동안 염색 용액에 담가 bioprinted 구조.
    3. 화상 일 0과 8에 공 초점 현미경 시스템을 사용하여 염색 된 구조는 300 ㎛의 깊이에 걸쳐 30 광학 슬라이스 Z 스택 파라미터를 이용하여, 각 bioprinted 구조체의 다수의 사진을 촬영하고, 직접 세포를 카운트. 세포가 노란색 표시 또는 빨간색 경우 녹색 그들로 살아 카운트, 그리고 만약 그들이 죽은 계산합니다.
  3. 구조체의 셀의 총 개수로 나눈 생균 수와 세포 생존 비율을 계산하게하고; 세포 생존 = 수살아있는 세포 (녹색 + 노란색) / 총 세포 수 (녹색 + 빨강 + 노랑) × 100 %.
  4. 0 일에 세포 수로 나눈 8 일째의 세포 수와 같은 각각의 샘플에 대한 세포 증식의 양을 계산하게하고; 하루 8 / 살아있는 세포에 세포 증식이 = 라이브 세포 수는 일 0 X 100 %에 계산합니다.

7. RGD 펩타이드 활용 분석

  1. 알긴산에 RGD 펩티드 결합의 성공을 분석, RGD 공역 알긴산 및 비공 알긴산과 비교. ( '6 Diamidino -2- 페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드 4)를 사용하여 (DAPI)와 팔로이 딘 얼룩을이, 이미지 인쇄 구조를 수행합니다.
    1. DPBS ++의 200 μL와 메탄올 원액의 5 μl를 희석하여 솔루션을 작업 phalloidins합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
    2. (0.10509 G / L) / (350.3 g / 몰) = 3 × 10 -4 M = 0.0003 M = 0.300 밀리미터 = 300 μM : 방정식 다음 DAPI 얼룩의 300 μm의 주식 솔루션을 확인하십시오. 일을 확인E는 DAPI 원액을 희석 한 용액을 사용 : ++ DPBS 100 3 μM 용액을 얻었다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
  2. 완전히 4 % 파라 포름 알데히드에서 샘플 잠수함. 실온에서 1 시간 동안 품어. 이 솔루션은 5 분마다 세척 동안 앉아있게 DPBS ++로 3 회 세척 할 것. 그 과정에서 이상 젤을 내리고, 유리 슬라이드에 우물에서 젤 샘플을 전송합니다. 10 분 동안 0.1 % DPBS에서 트리톤 X-100 (0.1 g / 100 ㎖)에 ++ 겔 담가. 각각의 세척을 위해 5 분을 허용, DPBS ++로 3 회 세척 할 것.
  3. 작동 용액에 침지시켜 그들을 팔로이 딘으로 인쇄 얼룩 구조. 호일로 덮고 4 시간 동안 품어. 팔로이 딘 얼룩을 제거하고 DPBS ++로 3 회 세척한다. 첫 번째 세척은 후자의 세척은 5 분마다 앉아야, 빠른해야합니다.
  4. DAPI 작업 솔루션을 담금으로써 DAPI와 인쇄 구조를 얼룩. 호일로 덮고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 빨래각 세척을 허용 DPBS ++와 세 번, 5 분 동안 앉아있다. 공 초점 현미경 시스템에 샘플을 관찰하고 이미지입니다.

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결과

결과 bioprinter 정확하게 특정 입체 장소에서 세포를 함유 한 하이드로 겔 증착하고 일관 컴퓨터 지원 소프트웨어를 이용하여 입증 할 수있다. 이 소프트웨어는 각 방울의 위치를 확인하고 (그림 3,4) 분배에 대한 많은 매개 변수를 제어 할 수 있습니다. 적절하게 생체 물질을 증착하는 bioprinter의 반복은 조직 공학 응용 프로그램에서의 성공에 필수적입니다.

세포 생존, 성공적인 bioprinting 기술의 요구 사항 중 하나는, 1 시간, 후 인쇄 8일을 분석 하였다. 높은 세포 생존율은 생체 모방 형 구조를 제조하기위한 필수적이고 충분한 bioink의 직접적인 표현이다. RGD 펩티드 결합은 확산 셀을 홍보하여​​ 오랜 기간 동안 세포 생존 능력을 향상시킨다. 형광 현미경 법은 프린팅 공정 후 구조물은 세포 생존율을 정량화하는 데 사용되었다. CONCENTR와 알긴산 bioink15 %와 5 %의 산화 ATION는 0 일 98 %의...

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토론

조직 공학의 주요 초점은 복원 유지, 또는 기본 조직 능을 향상시킬 수있는 생물학적 대체품을 개발하여 장기 이식 부족과 요구 사이의 갭을 ​​연결한다. 이것은 내부 geometr을 통해 복잡한 해부학 적으로 정확한 외부 형상, 정밀 제어와 비계의 직접 제작하게되었다. 입체 bioprinting은 층별 approac를 이용한 디지털 모델의 다양한 크기와 형태의 입체 구조를 생성하기 위해 사용되는 방법이다. 입체 생체 모방 구조의 제조는 조직 공학의 발전에 중요한 역할을한다.

생성 된 구조의 생체 모방 능의 영향을 설계 프로세스의 중요한 측면이 있습니다. 생체 재료 및 기판의 온도를 제어하는​​ 능력은 하이드로 겔의 겔화기구 나 그 유지에 필수적인따라서 하이드로 겔 내에서 세포의 분포, 증식 및 분화에 영향을 미치는 기계적인 특성. 기관은 많은 세포 유형으로 구성되므로 다수의 디스펜서 이종 조직 형 구조의 제조에 중요하다. 외부 아키텍처의 컴퓨터 지원 설계는 별개의 상처 나 조직...

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공개 사항

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감사의 글

이 작품은 그랜트 번호 EPS-0903795 국립 과학 재단 (National Science Foundation), NIH NIDCR R01 - DE019355 (MJY PI)​​, 그랜트 8P20 GM103444 (YM PI)에 의해 수여 아래 정부 지원에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
포지셔닝 로봇 (JR2000 XYZ)자노메 
디스펜서: SDAV 선형 드라이브 SmartDispensersFishman Corporation
광학 광 센서: Keyensce
변위 레이저: OD MiniSICK
재순환 수조: PolystatCole-ParmerEW-12122-02
USB 카메라: Dino-Lite Premier 5MPAnMo Electrionics/YSC TechnologiesAD7013MT
프린터 호환 컴퓨터 설계 소프트웨어: JR-C 포인트Janome JanomeRobot 구매 시 제공
CAD(Computer-Aided Design Drawing) 소프트웨어: Visual PathBuilderRatioServ다운로드 가능: www.ratioserv.com/index.php/downloads
프린터 3cc 주사기: Fishman Corporation122051
22G 디스펜서 팁Fishman CorporationZ520122 
염화칼슘 이수화물시그마-알드리치10035-04-8
염화나트륨시그마-알드리치7647-14-5
돼지 젤라틴시그마-알드리치9000-70-8
이산화티타늄시그마-알드리치13462-67-7
프로타날 LF 20/40 알긴산(알긴산나트륨)FMC 바이오폴리머9005-38-3
염산Sigma-Aldrich7647-01-0
에틸렌 글리콜Mallinckrodt Baker, Inc9300-01
소듐 요드산염Sigma-Aldrich7790-28-5
hADSCLonzaPT-5006사용할 때까지 액체 질소에 바이알에 보관하십시오.
Dulbecco의 변형 된 독수리의 매체Gibco Life Technologies11965-092Warm in 37 ° C 사용하기 전에 물을.
트립신/EDTALonzaCC-5012웜 37 ° C 사용하기 전에 물을.
Calcein AMGibco Life TechnologiesC3100MP-80 °의 어둠 속에서 매장; C를 사용할 때까지.
Live/Dead 포유류 생존력 분석 키트Invitrogen Life TechnologiesL-3224-80 °의 어둠 속에 저장; C를 사용할 때까지.
MES 수화물시그마-알드리치M2933
N-하이드록시숙신이미드시그마-알드리치130672
1-에틸-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)시그마-알드리치E1769 10 지
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, +칼슘, +마그네슘라이프 테크놀로지1404013337°C에서 따뜻하게 합니다. C 사용하기 전에 물을.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, -칼슘, -마그네슘라이프 테크놀로지1419014437°C에서 따뜻하게 C 사용하기 전에 물을.
RGD 펩타이드국제 펩타이드
Alexa Fluor 546 Phalloidin StainInvitrogen Life TechnologiesA22283-20 °에서 저장; C 사용
까지(4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) StainLife TechnologiesR37606-20 °에서 저장; C 사용할 때까지

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