방법 논문

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑 2 +와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

DOI:

10.3791/53166

⸱

2015년 9월 10일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

초록

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Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ 핸들링은 정상적인 흥분-수축 결합에서 중요한 역할을 하며 비정상적인 SR Ca2+ 핸들링은 특정 유형의 부정맥에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 부정맥은 공간적으로 구별되는 창발적 현상이기 때문에 조직 수준에서 조사해야 합니다. 그러나 온전한 심장에서 SR Ca2+를 직접 조사하는 방법은 여전히 제한적입니다. 이 논문은 Langendorff-관류된 토끼 심장에서 막관통 전위(Vm) 및 자유 intra-SR [Ca2+]([Ca2+]SR)의 이중 광학 매핑을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 친화성이 낮은 Ca2+ 지표 Fluo-5N을 활용하는데, 이 지표는 세포 내 [Ca2+]([Ca2+]i)가 상대적으로 낮은 세포질에서 최소한의 형광을 보이지만 [Ca2+]SR이 밀리몰 범위에 있는 SR 루멘에서 상당한 형광을 나타냅니다. 이 접근법은 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+ 특성을 공간적으로 드러내는 것 외에도 Vm을 동시에 모니터링할 수 있는 뚜렷한 이점이 있어 Vm과 SR Ca2+ 사이의 양방향 관계와 부정맥 현상에서 SR Ca2+의 역할에 대한 조사를 할 수 있습니다.

서론

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온전한 Langendorff-관류 심장에서 세포 내 Ca2+ 및 막관통 전위(Vm)의 이중 광학 매핑은 부정맥 및 흥분-수축 결합1-4의 메커니즘을 포함하여 심장 전기생리학 연구의 주류가 되었습니다. 이 접근법은 정상 및 비정상 전기생리학에 대한 전례 없는 지식을 제공했으며, 중요하게는Vm과 세포 내 Ca2+ 사이의 양방향 관계에 대한 지식을 제공했습니다. 그러나 친화성이 높은 형광 지표(예: Rhod-2 및 Fluo-4)를 사용한 세포 내 Ca2+의 광학 매핑은 세포 내 Ca2+의 벌크 변화만 보고하며 이러한 변화가 막관통 Ca2+ 플럭스, 세포 내 저장소로의 방출 및 재흡수로 인한 것인지 아니면 대부분의 경우 두 가지 모두의 조합으로 인한 것인지 구별할 수 없습니다. 또한, 친화도가 높은 Ca2+ 지표는 온-오프 역학이 느리고 Ca2+ 농도5의 급격한 변화를 정확하게 보고하지 못할 수 있습니다.

각 활동 전위는 세포 내 Ca2+ 과도 (CaT)로 알려진 세포 내 Ca2+의 상승을 유발합니다. 포유류의 심장에서 전체 CaT의 약 70 – 90%는 리아노딘 수용체(RyRs)의 개방을 통해 근소포체(SR)에서 Ca2+의 방출로 인한 것입니다6. SR 내에서 총 Ca2+의 약 절반은 칼세퀘스트린(CSQ) 및 기타 SR 내 완충액7에 결합되어 있으며, 이는 SR Ca2+ 항상성8,9에 중요한 역할을 합니다. free SR Ca2+의 양은 SR Ca2+ 방출의 원동력과 RyR의 게이팅을 결정하므로 세포 내 CaT에 상당한 영향을 미칩니다. 또한, SR Ca2+ 방출 또는 재흡수의 변경은 차례로 전기발생 Na+-Ca2+ 교환을 통해 Vm에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 부정맥 유발 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 CaT 외에도 free SR Ca2+의 모니터링은 수축 및 전기생리학적 기능 장애에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

지난 몇 년 동안 연구자들은 고립된 심장 근세포와 온전한 심장의 단일 위치에서 SR Ca2+를 모니터링하는 데 상당한 진전을 이루었습니다. 이러한 방법 중 하나는 RyR을 열기 위해 빠른 카페인 펄스를 필요로 하며, 그런 다음 세포 내 Ca2+10의 즉각적인 상승으로부터 SR Ca2+ 함량을 추론하거나 계산합니다. 또 다른 흥미로운 접근법은 자유 SR Ca2+에 결합하는 Fluo-5N11 또는 Mag-Fluo412와 같은 낮은 친화도 Ca2+ 지표를 사용합니다. 이러한 지표는 10 – 400 μM 범위의 해리 상수(Kd)를 가지므로 Ca2+ 농도([Ca2+]SR)가 밀리몰 범위에 있는 SR 루멘에 비해 세포질에서 최소한의 형광을 나타냅니다. 낮은 친화성 Ca2+ 지표를 사용하여 분수 SR Ca2+ 방출 및 Ca2+ 대체13,14의 메커니즘을 포함하여 분리된 근세포 수준에서 SR Ca2+ 사이클링의 여러 측면을 조사했습니다. 그러나 온전한 심장에서 SR Ca2+ 순환의 이질적인 특성과 공간적으로 구별되는 부정맥 현상에서 SR Ca2+의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 온전한 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+를 영상화하는 방법이 필요하다15.

이 기사에서는 친화도가 낮은 Ca2+ 지표 Fluo-5N을 사용하여 온전한 Langendorff 관류 토끼 심장에서 자유 SR Ca2+ 및 Vm의 이중 광학 매핑 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 심장의 심외막 표면을 가로질러 SR Ca2+ 특성을 공간적으로 드러내는 것 외에도Vm을 동시에 모니터링할 수 있는 이점이 있어 Vm과 SR Ca2+ 사이의 양방향 관계를 조사할 수 있습니다.

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프로토콜

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동물과 관련된 모든 절차는 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 건강의 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 부착했다.

1. 준비

  1. 4 ° C에서 사전 및 저장소에 수정 된 타이로드의 솔루션의 두 집중 (25X) 주식을 준비한다 : (1) 주식 I (MM에서 : 염화나트륨 3205, 염화칼슘 2 32.5, KCl을 117.5,의 NaH 2 PO 4 29.75,의 MgCl 2 26.25) 및 (2) (MM의 :의 NaHCO3 500) 주식 II.
    1. (DI)을 염화나트륨 128.2, CaCl2를 1.3의 KCl 4.7의 MgCl 2 1.05의 NaH 2 PO 4 1.19의 NaHCO3 (20) 및 탈 이온수 1840 ㎖에 결합하여 11.1 글루코스 : 갓 (㎜)에하기 조성의 2 L 타이로드의 용액을 제조 물 80 ml의 스톡 I, II의 스톡 80 ㎖, 및 글루코스 4g. 직접 주식 나는 그리고 스톡 II를 함께 사용하지 마십시오 추가1,840 ml의 DI에 m은 침전을 방지 할 수 있습니다.
  2. 사전에 10 mg을 무수 디 메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 / ㎖에서 여기 수축 uncoupler의 blebbistatin의 주식 솔루션을 준비하고 4 ℃에서 원액을 저장합니다.
  3. 형광 염료의 스톡 용액을 제조한다 : (1) 전압에 민감한 염료 RH237 (DMSO에 1 ㎎ / ㎖), (2) 낮은 친 칼슘 지시등 FLUO-5N AM 제조자의 권장 사항에 따라 (DMSO 2 ㎎ / ㎖)를. 적재 능력의 후속 손실 분해를 방지하기 위해 즉시 준비를 사용합니다.
  4. 프라임 산소화 함께 재순환 랑겐 돌프 관류 시스템 (95 % O 2, 5 % CO 2)의 타이로드 용액. 7.4 ± 0.05의 타이로드 용액의 pH를 유지하기 위해, O2 / CO (2)의 흐름을 조정한다. 지속적으로 관류를 필터링 : 인라인 나일론 짠 그물 필터 (11 μm의 기공 크기)를 사용합니다.
    1. 이후 loadi으로 실온에서 국무 관류 시스템,FLUO-5N 오전 NG 실온에서 수행됩니다. FLUO-5N 오전 로딩, 순환 관류의 작은 볼륨 (~ 150 ㎖)를 사용합니다. 염료로드 한 후, 관류의 더 큰 볼륨 사용 (1-2 패, 그림 1C 참조).
  5. 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 심전도 및 관류 압력을 지속적으로 모니터링 준비합니다. 압력 모니터링 시스템을 준비합니다 관류 라인에 압력 변환기를 연결하고 transbridge 앰프 관류 압력을 모니터링 할 수 있습니다. 심장이 관류 시스템에 연결되지 않은 경우 0 mmHg로 기준선 관류 압력을 조정합니다.
  6. V 분 및 SR 칼슘 신호 사이의 공간 정렬을 보장하기 위해 광학 매핑 카메라를 맞 춥니 다.
    1. 첫째, 통치자 또는 관류 접시에 텍스트 개체를 배치하여 카메라 초점을 맞 춥니 다. 라이브 뷰 모드로 매핑 카메라를 켜고 텍스트가 선명하고 선명해질 때까지 초점을 조절합니다. 각각의 카메라로부터 하나의 프레임 화상을 취득.
    2. 오버레이두 이미지가 볼 수 있도록 이러한 이미지 및 상단 이미지의 투명도를 조정합니다. 이미지의 텍스트가 정확히 겹쳐한다. 완벽하게 정렬되지 않은 경우 두 이미지가 정렬 될 때까지, 다이크로 익 미러 또는 각 카메라의 위치의 각도를 조정한다.

토끼 심장의 2. 수확, 관류, 그리고 염료 로딩

  1. 승인 된 토끼 제한 수단의 토끼를 고정합니다. 깊이 펜 토바 비탈 나트륨 (50 mg / kg) 및 헤파린 (1000 IU)의 정맥 내 주사 (귀 가장자리 정맥)을 통해 마취.
    1. 토끼가 표시 침해 반사 신경이 부족하면, 중간 선 피부 절개는 흉골과 갈비뼈를 노출 할 수 있습니다. 흉골에 xyphoid에서 무딘 팁 수술 가위로 흉골을 통해 잘라. 흉골을 여는 동안 심장이 손상되지 않도록주의하십시오. 마음을 노출 갈비뼈를 확산.
    2. 빠르게 빠르게 모든 선박과 결합 조직을 절단하여 전체 심장 - 폐 블록은 절제. 최단 당일tely 얼음처럼 차가운 타이로드의 용액에 심장 - 폐 블록을 배치합니다.
  2. 역 행성 관류의 대동맥을 찾습니다. 대동맥 궁의 세 가지에 바로 인접 상행 대동맥을 잘라. 관류 시스템에 연결 8 G 캐 뉼러에 대동맥 Cannulate. 캐 뉼러에 대동맥을 확보하기 위해 USP 0 실크 봉합사의 조각을 사용합니다.
  3. 조심스럽게 마음에서 기관, 폐 및 심 외막 지방을 해부하다. 날카로운 집게 및 해부 가위, 승모판의 위치를​​주의 깊게 손상 또는 좌심실에서 솔루션 혼잡을 방지하기 위해 하나의 전단지를 제거합니다.
  4. 이미징이 위를 향하도록 마음의 전방 표면과 수평으로 유리 외피 관류 실에 마음을 담근다. 매핑 (그림 1D) 동안 마음의 움직임을 방지하기 위해 접시의 실리콘 바닥에 U 자형 핀 실 가드의 조각에 캐 뉼러를 고정합니다. 원하는 경우, STA에 대한 심장의 정점에 작은 곤충 핀을 삽입bilization.
  5. 위치 심전도 (ECG) 심장의 오른쪽과 왼쪽에 목욕 전극. 완전히 욕 전극 잠수함 그들이 리드 I 구성으로 부피가 유사한 실시 ECG 제공 심장 표면과 접촉하지 않는 보장. 보통의 리드 나는 심전도 형태를 확인합니다. 70 mmHg로 - 대동맥 압력이 60으로 유지 될 수 있도록 - (35 ml / 분 25) 흐름을 조정합니다.
  6. 실내 조명을 끄고 0.3 추가 - 관류 (- 20 μm의 최종 농도 10)에 blebbistatin 주식 솔루션 (단계 1.2)의 0.6 ml에.
    1. blebbistatin의 photoinactivati​​on을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. 필요한 경우, 소형 스포트 또는 전조등은 작업 조명을 제공하기 위해 사용될 수있다.
      주 :이 Blebbistatin 미오신 ATP 아제 억제제 및 여진 수축 uncoupler이다. 심장 에너지 생산이 손상 될 수있다 - FLUO-5N 로딩 확장 (60 분), RT (저체온증) 조건을 요구하기 때문에 (2.10 단계 2.8 참조). 목erefore, 관류 종래에 blebbistatin 첨가 에너지 수요 (16)을 감소시키고 후속 광학 레코딩 17 동안 모션 아티팩트를 제거 할 수있다 로딩 염료.
  7. 심장의 수축이 중단되면 (10 - 대동맥 압력 기록에 대한 확인 15 분), 작은 볼륨 순환 관류 시스템 (단계 1.4.1 참조)로 전환합니다.
  8. 준비하고 FLUO-5N 오전 로딩 솔루션을로드 : 0.25 ml의 따뜻한 20 % 플루로 닉 F127에 FLUO-5N 오전 원액 (1.3 단계)의 0.25 ML을 추가합니다. 0.5 ml의 혼합물에 따뜻한 타이로드의 솔루션을 추가 잘 혼합하고, 소량 순환 관류 시스템에 추가 할 수 있습니다.
  9. 연속적으로 관류 압력 및 ECG를 모니터하고 필요하다면 흐름을 조절한다. 염료 로딩은 실온에서 약 1 시간 소요됩니다. 로딩 후 45 분, 37 ℃로 관류 시스템 및 관류를 따뜻하게 시작 순환 물 목욕을 켜 시작했다.
  10. FLUO-5N 오전 로딩, SWI의 60 분 후큰 부피 재순환 관류 시스템에 관류 TCH (단계 1.4 참조).
  11. 따뜻한의 타이로드 액 1ml에 전압 감응 염료 RH237 원액 (단계 1.3) 50 μL를 희석하고 캐뉼라에 주입구 근위로 (~ 5 분에 걸쳐)을 천천히 부가.

3. 광학 매핑

  1. 염료로드의 마지막 순간 동안, 마음을 놓고 실험에 대한보기의 해당 필드를 보장하기 위해 광학 매핑 카메라 초점을 맞 춥니 다.
  2. 원하는 경우, 페이싱에 대한 마음의 심​​ 외막 표면에 양극 페이싱 전극을 배치합니다.
  3. 인해 관류의 재순환에 존재할 수있는 액체의 표면에 동 잡음을 줄이기 위해 관류 챔버의 표면에 플라스틱이나 유리 커버 슬립을 배치했다.
    주 : 커버 슬립에 대한 대안이 깨끗한 플라스틱 50mm 페트리 접시 덮개를 사용할 때.
  4. 균일 전자와 마음의 표면을 조명 빛 가이드를 초점xcitation 빛. 495 nm의 대역 통과 필터 (도 1a) - 청색 발광 다이오드 (LED) 광원을 사용하여 상기 (475)로 광을 필터링.
  5. macroscope 두 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS) 광학 매핑 카메라와 방출되는 형광을 수집합니다. 545 nm에서 이색 거울 방출 된 빛을 분할합니다.
    1. 롱 패스는 700 nm에서, V의 m 신호를 포함하는, 긴 파장 부분을 필터링. 534 나노 미터 (도 1A) - 밴드 패스 (502)에서, SR 칼슘 신호를 포함하는, 단파장 잔기 필터. 1 kHz에서 - 0.5 광 데이터 수집의 빈도를 설정합니다.
  6. 각각의 광 기록, 처음으로, 원하는 페이싱 프로토콜을 시작 여기 광을 켜고 1 수집 - 데이터의 4 초. 필요한 경우, 페이징 프로토콜 및 데이터 획득을 동기화.
    주 : 것은 불가능 FLUO-5N AM, 따라서 신호 대 잡음비 (SNR)를 재 로딩한다 decrea자체 SR에서 누출 염료에 의한 실험을하는 동안. 높은 SNR 값을 보장하기 위해 2 시간 - 1 실험 프로토콜을 제한합니다.
  7. 실험 후, 탈 이온수로 다시 DI 물, 70 % 알코올 시약의 순차적 관류 시스템을 씻어.
  8. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지를 이용하여 공간 가우시안 필터 (반경 3 픽셀)를 각 데이터 세트를 필터링.
  9. 필요한 경우, 공간적으로 V의 m 및 SR 칼슘 2 + 데이터 세트를 맞 춥니 다. 단계 1.6에서와 같이, 각각의 카메라에서 이미지를 중첩되는지 확인보기 (즉, 정맥, 페이싱 전극)의 분야에서 심장의 해부학 적 구조 (즉., 관상 동맥 혈관, 심방의 가장자리 또는 심실) 또는 기타 항목을 정확하게 중복. 그렇지 않은 경우, 데이터 세트의 공간 배치가 필요하다.
  10. 화소 번호를 기록하게 정확한 오버랩까지 X 축 및 Y 방향이 달성에 상부 투명 이미지를 이동이미지는 각 방향으로 이동해야합니다. 상부 이미지 (V m 또는 SR 칼슘 하나)에 대응하는 전체 데이터 세트는 V의 m 및 SR 칼슘 2 데이터 세트 사이의 정확한 정렬을 보장하기 위해, 각 방향의 화소 수만큼 시프트 결정되어야한다.

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결과

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도 1a는 이중 V의 m 및 SR 칼슘 매핑 광학 구성의 개략도를 나타낸다. 이 설정으로, V의 m 및 SR 칼슘 신호 (그림 1B)의 전체 스펙트럼 분리가있다. FLUO-5N 염료 로딩에 사용되는 이중 루프 관류 시스템의 도면은도 1c에 도시된다.도 1d는 관류 접시 심장의 가로 방향을 나타낸다. 대표적인 V의 M과 심장의 심 외막 표면에 다른 위치에서 지속적으로 조율 중에 SR 칼슘 2 + 광학 추적은 그림 2A에 표시됩니다. 이 설정으로 뷰의 광 필드는 X 31mm 및 시야 내의 중심부의 방향이도 2b에 도시되어 31mm이다. 활성화 맵은 또한도 2b에 도시되어 있으며, 각 픽셀 (P)의 활성화 시간을 선택함으로써 구성된다등시...

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토론

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성공적인 FLUO-5N 염료 로딩 키 염료 대량의 로딩 시간 (1 시간)의 길이에 대한 필요없이 높은 FLUO-5N 농도 허용 소량 재순환 관류 셋업하고, 로딩을 수행 실온에서. 로딩 빠르게 생리 온도, 셀룰러 절단 효소 활성 염료 세포질에서 염료 분자를 포착하고이를 SR 세포막을 통과 할 수없는, 세포막을 통과 -AM 태그에서 수행되는 경우. RT에서, 그러나, 효소 활성은 둔화되고 -AM 태그 전에 세포막과 SR 막 모두를 교차 할 수 염료 충분량 SR에 염료를 포착, 절단된다.

심지어 최적의 하중 조건으로, 그러나, 신호 진폭이 접근 분수 형광 변화 (ΔF / F)는 높은 친 화성 염료와 V (m)의 전통적인 광학 매핑 및 세포 내 칼슘보다 낮은 것. 예를 들어, LED를 여기 광, 거시적 목적, 큰 필터와 다이크로 익 미러 (5 cm × 5 cm)에, 그리고 CMOS 카메라, 분수 형광 변화 이루어져 여기서 사용되는 광 설정으로 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01 HL 111600)과 미국 심장 협회(American Heart Association, 12SDG9010015)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NaClFisher ScientificS271-1Tyrode 솔루션 구성 요소
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500Tyrode 솔루션 구성 요소
KClFisher ScientificS217-500Tyrode 솔루션 구성 요소
MgCl2(6H2O)Fisher ScientificM33-500Tyrode 솔루션의 구성 요소
NaH2PO4 (H2O)Fisher ScientificS369-500Tyrode 솔루션의 구성 요소
NaHCO3Fisher ScientificS233-3Tyrode 솔루션의 구성 요소
D-GlucoseFisher ScientificD16-1Tyrode 용액의 구성 요소
95% O2 5% CO2Air가스탄화물Tyrode 용액의 산소화 및 pH용
BlebbistatinTocris Bioscience1760Excitation-contraction uncoupler
RH237Biotium61018전압에 민감한 염료
Fluo-5N AMInvitrogenF-26915낮은 친화도 Ca2+ 지시자; 대안: Invitrogen F-14204; 로딩은 실온에서 수행해야 합니다
Pluronic F127Biotium59004Ca2+ 표시기 로딩용; 용액이 깨끗해질 때까지 사용 전에 따뜻하게 하십시오
디메틸 설폭사이드 (DMSO)Sigma-AldrichD2650블레비스타틴과 염료를 용해시키기 위해
필터EMD MilliporeNY110470011 μ m 인라인 필터
압력 트랜스듀서WPIBLPR2관류 압력 측정용
트랜스브리지 트랜스듀서 증폭기WPISYS-TBM4M압력 신호 전달/증폭용; PowerLab은 적절한 BioAmp
PowerLab 26TAD와압력 및 ECG 신호의 연속 기록,
THT, Macroscope, SciMedia, Macroscopic 광학 설정. 세부 정보: 0.63X 대물렌즈(NA = 0.31), 2X 응축 대물렌즈, 결과 시야 = 3.1cm x 3.1cm, 초점 심도 = ~ 1.5mm
MiCam Ultima-L CMOSSciMedia광학 매핑 카메라
정밀 LED 스포트 라이트MightexPLS-0470-030-15-SLED 광원
. : 함께 사용할 수도 있습니다.

참고문헌

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