폐 종양 세포 모집 분석 결과

요약

이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.

초록

종양 전이 경 세 하는 분자 메커니즘을 조사, 다양 한 분석 실험 모델 동물로 마우스를 사용 하 여 제안 되었습니다. 여기, 종양 세포 넘쳐 흐름 또는 micrometastasis를 평가 하기 위해 간단한 분석 결과 보여 줍니다. 이 분석 결과에서 종양 세포 꼬리 정 맥을 통해 주입 했다 고 짧은 기간 후 폐 해 부 되었고 누적된 레이블이 지정 된 종양 세포를 소화. 이 분석 결과 혈관으로 기본 종양의 초기 단계를 건너뛰고 먼 기관 종양 전이 발생 하는 위치에 있는 이벤트의 연구를 촉진 한다. 제한 된 수의 전이 관찰 하는 혈관에 주입 하는 셀의 수를 최적화할 수 있습니다. 그것은 알려졌다 stromal 셀 먼 장기에 전이에 기여. 따라서,이 분석 결과 잠재적인 치료 약물 이나 종양 전이의 방지를 위한 장치를 탐구 하는 유용한 도구 일 수 있었다.

서론

종양 전이 암 관련 질병에 높은 사망률을 차지 한다. 분자 수준에서 조사 관점에서 전이 여러 단계로 분할 될 수 있다: 기본 종양 사이트, 기본 종양 성장 및 주변 조직, intravasation, 혈관을 통해 순환으로 침공에 종양 개시 먼 장기에 종양이 다시 성장을 넘쳐 흐름. 각 단계는 분자/신호¹의 다른 세트를 포함 한다.

종양 세포는 또한로 알려져 미리 전이성 단계^{2,3,,45, 혈액에서 회람 시작 전에 먼 장기에 발생 하는 이벤트와 우려는 최신 연구 6}. 우리의 마우스 모델 연구 밝혔다 미리 전이성 단계 폐에 지속적인 저수준 염증 반응을 만들어 폐 전이 촉진 한다. 미리 전이성 단계 themicrovasculature의 hyperpermeability, 파생 하는 골 수 세포 (BMDC)의 신규 모집 그리고 S100A8 및 SAA3^3,

프로토콜

마우스를 사용 하 여 수행 하는 모든 절차는 동물 연구 위원회의 도쿄 여자의과 대학에 의해 승인 되었다.

1. 루이스 폐 암 (LLC) 세포의 꼬리 정 맥 주사

1. 습도 5%에서 10 %fcs 보충 DMEM LLC 셀 유지 37 ° c.에 CO₂ 배양 기 세포 형광 단백질 식 시스템 (예를 들어, GFP)를 포함 해야 합니다.
2. 비 효소 세포 분리 시 약을 사용 하 여 문화 접시에서 셀을 제거 합니다. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
3. 3 분 셀 5 mL의 PBS에 pipetting, 여 Resuspend 그리고 원심 관 (400 x g, 3 분) 15 mL 튜브, 400 x g에서 원심 분리기는 세포를 수집 합니다. 그런 다음에 상쾌한을 제거 합니다.
   1. 이 세척 단계를 한 번 더 반복 합니다.
4. 두 번째 세척 후 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기), 세포를 통과 하 고 1 x 10⁶ 셀/mL의 최종 셀 밀도 제공 하는 PBS에 resuspend.
5. 꼬리 정 맥을 통해 각 C57BL/6 마우스 (8-10 주 오래 된 남성)에 세포 현 탁 액 (1 x 10^5....

결과

폐 주사 (그림 1A) 후 많은 GFP LLC 셀 2 시간을 제공합니다. 그것은 또한 빨간 필터에 검출 형광 명소 셀 번호 개수에서 제외 되어야 주목 한다. LLC는 세포의 대부분 주사 (그림 1C) 후 폐 24 h에서에서 사라집니다.

폐에 GFP LLC의 번호를 확인 하는 돌출부의 흐름 cytometric 분석 (그림 2)에 대 한 사용할 수 있습니다.

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토론

항 체, 약물, 높은 지방 다이어트 또는 종양 세포 주입 전에 종양 조절 중간 마우스의 전처리 가능 하다. 이 분석 결과 가장 어려운 단계가입니다 꼬리 정 맥 주입. 불완전 주입 결정적 데이터에서 발생합니다. C57BL/6에서 꼬리 정 맥은 실패 한 주사에 따른 식별, 특히 어렵습니다. 생리대 (37 ° C)에 쥐를 배치 도움이 되도록 주입 쉽게 꼬리 정 맥 팽창.

이 분석 결과 환자의 혈액에서 관찰 된 것 보다 훨씬 더 큰 큰 숫자 (1 x 10⁴ -1 x 10⁵) 종양 세포를 사용 합니다. 셀 등 다 수의 1 회 주사를 호스트 동물에서 원치 않는 응답에 대 한 가져올 수 있습니다. 형광 스테레오 현미경 검사 법, 종양 세포 깊은 안쪽에서 조직을 탐지 하기 어려운 있습니다. 교류 cytometry 분석, 폐는 폐에 있는 종양 세포를 완전히 소화 된다. 이 프로세스는 종양 세포 위치 (내부 또는 혈관 외부)에 대 한 귀중 한 정보를 발생합니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 분해 효소	Sigma	C6885
Dispase	Gibco	17105-041
소 혈청 알부민	Sigma	A7030
DPBS	Gibco	14190-144	칼슘 없음, 마그네슘
없음 Deoxyribonuclease I	Sigma	DN-25	미량
RBC 용해 완충액	Sigma	R7757
셀 여과기	BD	352340	40 마이크로미터 메시
형광 라벨링 키트	Sigma	MIN26-KIT
DMEM	Gibco	11965-092
0.22 μ m 주사기 필터	sartorius	17597K
O.C.T. 화합물	Sakura Finetek	4583
4% 파라포름알데히드 인산염 완충액	Wako	163-20145