방법 논문

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

DOI:

10.3791/53174

⸱

2015년 8월 20일

 ,  , 
1Centre for Eye Research Australia & Department of Ophthalmology, University of Melbourne

이 논문에서

요약

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이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

초록

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최근 재프로그래밍의 발전으로 체세포를 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)로 바꿀 수 있게 되었습니다. 환자 특이적 hiPSC를 사용한 질병 모델링을 통해 발병의 기저 메커니즘을 연구할 수 있으며, 치료 옵션을 개선하기 위한 체외 약물 스크리닝 및 유전자 요법 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 재생 의학을 위한 hiPSC의 유망한 잠재력은 최근 몇 년 동안 iPSC에 대한 출판물 수(>7000건)가 증가하고 있는 것에서도 분명합니다. 피부 섬유아세포, 조혈 세포 및 표피 각질세포를 포함하여 서로 다른 계통의 다양한 세포 유형이 hiPSC 생성에 성공적으로 사용되었습니다. 피부 생검 및 혈액 채취는 hiPSC 생성을 위한 체세포 공급원으로 많은 실험실에서 일상적으로 수행되지만, 모발 각질 세포의 수집 및 후속 유도는 덜 일반적으로 사용됩니다. 모발 유래 각질세포는 환자로부터 세포 샘플을 얻기 위한 비침습적 접근 방식을 나타냅니다. 여기에서는 뽑은 모발에서 각질 세포를 유도하기 위한 간단한 비침습적 방법을 간략하게 설명합니다. 또한 episomal 벡터를 사용하여 통합 없는 hiPSC를 생성하기 위한 각질 세포의 유지 관리 및 후속 재프로그래밍에 대한 지침을 제공합니다.

서론

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유도 된 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)의 발견은 환자 맞춤형 줄기 세포의 생성을위한 1-3 가능한 방법을 제공하는 재생 의료 분야 혁명을 일으켰다. hiPSCs 성공적 4,5- 섬유 아세포, 조혈 세포 6,7, 소변 8에서 신장 상피 세포와 각화 9,10 포함하는 다양한 종류의 체세포에서 생성되었다. 현재까지, 피부 섬유 아세포 및 조혈 세포는 환자 별 iPSCs를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 셀의 소스를 나타낸다. 틀림없이, 이것은 피부 생검과 채혈 일상 의료 절차 및 여러 나라에서 확립 된 환자의 혈액 샘플의 피부 또는 대형 바이오 뱅크 있다는 사실에 기인한다.

혈액 세포 및 침윤성 추출 방법을 필요로 피부 섬유 아세포는 달리, 케 라티노 사이트는 hiPSC 생성에 쉽게 접근 세포 유형을 나타낸다. KeratinocytES는 피부의 외관 상피 장벽을 형성하고 또한 손톱 및 모발 (11)에서 발견되는 케라틴 풍부한 상피 세포이다. 특히 각질 세포가 모낭 내부 근초 (IRS) 셀 (12,도 1)와 함께 모발 덮여 셀룰러 외부 층의 외측 근초 (ORS)에서....

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프로토콜

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개인의 인간의 머리카락 샘플의 수집은 호스트 기관에서 인간의 연구 윤리위원회 윤리의 승인을 필요로하며, 제도적 지침에 따라 수행해야합니다.

뽑아 머리에서 각질 1. 분리

  1. 얼음 O / N에 (즉, 마트 리겔) 해동 세포 외 기질 (ECM) 솔루션입니다.
  2. 사전 냉장 피펫 팁을 사용하여, 냉장 DMEM / F12 배지 12 ml를 200 μL ECM 솔루션을 추가합니다. 코트의 각 웰에 희석 된 ECM 용액 1 ㎖와 함께 12 웰 플레이트. 37 ° C에서 코팅 된 플레이트 O / N을 품어. 사용하기 전에 미리 예열 DMEM / F12 배지로 코팅 된 판을 씻으십시오.
  3. 머리카락의 뿌리 부근에 손가락을 배치 한 빠르고 부드러운 동작으로 머리를 따 버릴에 의해 개인의 머리에서 차 인간의 머리카락을 수집합니다. 각 수집 머리를 그대로 모낭이 포함되어 있는지 확인하고 헤어 유엔의 성장 단계를 결정하기 위해 확인해부 현미경 (그림 1) 데르.
    1. 각질 세포를 추출하는 각 개인으로부터 5 ~ 10 성장기의 머리카락을 수집합니다. 프로세스는 각질 세포의 성공적인 유도를 보장하기 위해 가능한 한 빨리 털을 뽑아.
      참고....

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결과

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성장기 (성장 단계), 퇴행기 (회귀 상) 및 휴지기 (나머지 상) (20, 21) : 머리는 3 가지 성장주기의 단계를 통해 간다. 성장기 모낭은 상피 세포의 여러 계층을 포함, 이들 층은 ORS, IRS 및 모간 (도 1)를 포함한다. 성장기의 머리는 결국 ORS 헤어 샤프트 차별화 종료의 사멸로 표시됩니다 퇴행기 단계로 전환 겪는다. 마지막으로, 세포 사멸의 멈추고 휴지기 모낭이 휴지기 특성과 정지가되는 휴지기 단계에 퇴행기 모발 전환 (20, 21)를 팽창.

그림 1은 휴지기 머리와 성장기 모발의 형태를 보여줍니다. 우리는 일반적으로 각질 세포의 유도를위한 성장기 머리를 사용합니다. 이 프로토콜에 따라, 각질 세포의 outgrowths은 빠르면 3 일 정도 머리 부착 (그림 2A) 후에 관찰 할 수 있으며 페이지에 계속roliferate <.......

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토론

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환자 별 hiPSCs의 생성은 시험관 내에서 질환 세포 유형의 발병 기전 연구를위한 독특한 방법을 제공하고, 또한 질환의 표현형을 구출 할 신규 한 분자를 식별하는 약물 스크리닝에 대한 플랫폼을 제공한다. hiPSCs를 이용하여 질병이 모델링 접근법은 긴 QT 증후군, 헌팅 톤병, 파킨슨 질환 및 근 위축성 측삭 경화증 (22)을 포함하여 다양한 질환에 대한 유망한 결과를 수득했다. 여러 이니셔티브는 이미 미국, 유럽, 호주, 중국, 한국, 일본 (23, 24)에 컨소시엄을 포함하여 환자 별 hiPSCs의 대규모 라이브러리를 구축 할 진행되고있다.

여기서 헤어 유래 케 라티노 사이트에서 hiPSCs을 확립 프로토콜 촉진하고 질병 특정한 hiPSCs의 대규모 라이브러리의 구축을 빠르게 추적 할 수있는 잠재력을 가지고있는 기재되어있다. 우선, 에피 솜 :이 프로토콜은 두 개의 이점을 제공한다이 프로토콜에 사용되는 시스템은 여.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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저자는 기술 지원을 해준 Harene Ranjithakumaran과 Stacey Jackson에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council, R.C.B. Wong, A. Pébay), 멜버른 대학교(R.C.B. Wong), 호주 망막(Retina Australia, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) 및 호주 안과 연구소(Ophthalmic Research Institute of Australia, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 호주 연구 위원회 미래 펠로우십(A. Pébay, FT140100047), 크랜본 재단 펠로우십(RCB Wong); 미국 국립보건원(National Institutes for Health, R.C.B. Wong, S.S.C. Hung)의 교내 자금 지원 및 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항생제 혼합물: 
250ng/ml 항진균 암포테리신 BSigmaA2942-20ml항생제 혼합물은 PBS로 구성됩니다.
1X 페니실린/스트렙토마이신인비트로젠15140-122
PBS (-)인비트로젠14190-144
녹아웃 세럼 대체품 (KSR) 매체: KSR 배지는 사용 전에 Stericup(Millipore, #SCGPU05RE)을 사용하여 여과합니다. bFGF는 사용 전에 배지에 새로 첨가합니다.
20% 녹아웃 세럼 대체품 (KSR)Invitrogen10828-028
DMEM/F12를 glutamaxInvitrogen10565-042
1회; MEM 비필수 아미노산Invitrogen11140-050
  0.5&배; 페니실린/스트렙토마이신인비트로겐15140-122
  0.1 mM β-메르캅토에탄올Invitrogen21985
  bFGF (10 ng/ml, 신선 추가)MilliporeGF003
각질 세포 배지: 
  60 의 EpiLife; &마이크로; M 칼슘InvitrogenM-EPI-500-CA
1× 인간 각질 세포 성장 보충제 (HKGS)InvitrogenS-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) 매체 :  FBS 배지는 사용 전에 Stericup(Millipore, #SCGPU05RE)을 사용하여 여과합니다.
10% 소 태아 혈청 (FBS)Invitrogen26140079
DMEM Invitrogen11995-073
0.5x 페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15140-122
2 mM L-글루타민Invitrogen25030
0.25% 트립신-EDTAInvitrogen25200-056
세포외 기질 (ECM):
MatrigelCorning 354234Aliquot Matrigel 재고 및 보관 -80°C; C 다음 제조업체' s 지침. Matrigel의 재고 농도는 배치마다 약간씩 다릅니다(~9mg/ml). 200µ를 사용하는 것이 좋습니다. L 12웰 플레이트(~150µ g/well). 
코팅 매트릭스 키트 InvitrogenR-011-K
플라스미드: pCXLE-eGFP는 transfection 효율을 모니터링하는 데만 사용되며 재프로그래밍에는 필요하지 않습니다.
-                  pCXLE-eGFP애드진27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F애드진27077
-                  pCXLE-hSK애드진27078
-                  pCXLE-hULAddgene27080
트랜스펙션 시약 Fugene HDPromegaE231B
젤라틴(돼지 껍질에서 추출)SigmaG1890증류수에 0.1% 젤라틴을 구성합니다. 사용하기 전에 오토클레이브. 
환원된 혈청 배지: OPTI-MEMInvitrogen31985062
AccutaseSigmaA6964-100ml
마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급MEF는 앞서 설명한 바와 같이 미토마이신 C 처리 또는 방사선 조사에 의해 비활성화될 수 있습니다 16.
26G 니들TerumoNN2613R
6-well plate (조직 배양 처리)BD Biosciences353046
12-well plate (조직 배양 처리)BD Biosciences353043
10 cm dish (조직 배양 처리)BD Biosciences353003
DispaseInvitrogen17105-04110 mg/ml
에서 사용Collagenase IVInvitrogen17104-0191 mg/ml
TRA-160 항체MilliporeMAB43605 µ 사용; g/ml
OCT4 항체Santa CruzSC-52795 µ에서 사용; g/ml
NANOG 항체R& D SystemsAF199710 & micro에서 사용; g/ml
MycoAlert 감지 키트LonzaLT07-418
기

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human....

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