신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

요약

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

초록

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

서론

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 ^(1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 ^-3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 ^4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 ^7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 ^{(10, 11)과} 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 ^12-14.

preweaning 기....

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 신생아 모자 분리 (NMS)

1. 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다.
   참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날.
2. (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다.
3. 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러.
4. 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다.
5. 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다.
6. 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 ^{O C와} 50 %의 습도에서 개최.
7. 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다.
8. , NMS를 받고 각 ....

결과

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에서, 이것은 상당한 감소 (학생의 t- 테스트 P <0.01)로 입증된다 .

NMS에 노출 된 마우스는 CP / CPPS의 조직 학적 증거를 표시. 전립선 조직의 저온 섹션은 비만 세포 (도 3A-D)에 수납 트립 타 아제 과립을 관찰로 산성화 O 톨루이딘 블루 염색 하였다. 활성화, 예를 들면, 확산 metachroma 증거를 보였다 비만 세포의 백분율SIA,.......

토론

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 ^12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습적 유도를 포함하는 신규 한 접근법 더 일반적으로, 화학적으로, 사용 전립선 ^34,36-39의 염증을 면역 학적으로 유도하는 데 반대했다. ,에 의해 전시 된 동반 신체, 기분, 그리고 내장 질환과 유사 (데이터가 표시되지 ¹⁶⁾ 또한, 마우스의 NMS는 과민 반응을 변경된 불안 같은과 anhedonic 행동을 포함하여 동반 symptomology, 증가 배뇨 속도를 생산하고, 뒷발 것으로 나타났다 CP / CPPS의 patie국세청

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
임산부 C57BL/6 암컷 마우스	찰스 리버	027	시간 측정 또는 시간 제한이 없는 임산부는 가정 출산을 위해 매일 모니터링해야 합니다.
2L 유리 비커	Sigma-Aldrich	CLS10002L	각 NMS 깔짚은 21일의 분리 기간 동안 동일한 비커에 보관됩니다.
VWR 강제 공기 인큐베이터, 기본	VWR International	414005-124	인큐베이터는 33°C에서 개최되어야 합니다. C 및 50% 습도.
터치 테스트 감각 평가기, 20개들이 키트 (터치 평가용 Semmes-Weinstein von Frey 감각계)	Stoelting	58011	생식기 주변 민감도 평가를 위해 다음 모노필라멘트를 사용해야 합니다: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, 4.74 g.
동물 우리 (12 마리, 6 마리의 쥐)	IITC	435	쥐가 탈출하는 것을 방지하기 위해 개별 아크릴 동물 울타리 위에 무거운 물체를 올려 놓으십시오.
생쥐와 쥐를 위한 메쉬 스탠드 (12마리, 6마리의 쥐)	IITC	410	편안한 접근을 위해 안정적인 테이블 위에 스탠드를 놓습니다.
인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	P5493	은 10x PBS 스톡을 1x PBS로 희석합니다.
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148	비만 세포 염색을 준비하기 위해 마우스와 후위 조직을 심내 관류하려면 4% 파라포름알데히드 용액이 필요합니다.
자당	: 시그마 - 알드리치	S5016	: 4 °C에서 30 % 자당 용액의 Cryoprotect 고정 조직; 하룻밤 사이에 C.
헵탄	시그마-알드리치(Heptane Sigma-Aldrich	246654	드라이아이스에서 헵탄을 식혀 조직을 얼립니다.
표준 Cryomold	VWR International	4557	냉동 절편 전 전립선 조직 동결을 돕기 위해
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	생물학적 염색 위원회의 인증을 받았습니다. 비만 세포의 변색 염색제로 사용하기에 적합합니다.
에탄올, 앱솔루트(200프루프)	Fisher Scientific	BP2818-4	분자생물학 등급, Fisher 생물시약; 비만 세포 시각화 전에 염색된 동결 절편을 탈수하기 위해 95% 및 100% 용액이 필요합니다.
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S9888	산성화 NaCl 용액은 저온 절편을 염색하기 전에 신선하게 만들어야 합니다.
GeneMate 멸균 50 ml 원심분리기 튜브	BioExpress	C-3394	일회용 튜브는 툴리딘 블루 요소를 혼합하거나 슬라이드를 1xPBS에 담그는 데 사용됩니다.
10 슬라이드용 코플린 염색 접시, 접지 유리 커버 포함	Fisher Scientific	08-815	최대 10개의 표준 3 x 1인치를 담을 수 있습니다. (75 x 25mm)가 연달아 미끄러집니다. 톨루이딘 블루 작업 용액, 95% EtOH, 100% EtOH 및 자일렌에 대해서는 별도의 접시를 사용하십시오.
자일렌(조직학적)	Fisher Scientific	X3P	탈수가 완료되면 조직은 자일렌으로 제거됩니다.
현미경 슬라이드 박스, 100자리	VWR International	82003	박스는 슬라이드의 보관 및 운송에 사용할 수 있습니다.
Fisherbrand 현미경 슬라이드 박스	Fisher Scientific	22-363-400	이 슬라이드 박스는 일반적으로 극저온 상태 내부에 들어갈 수 있을 만큼 작습니다.
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	글리세롤은 전통적인 장착 매체입니다.
마운팅 미디어, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	마운팅 미디어는 커버슬립을 슬라이드에 단단히 접착합니다.
마이크로 커버 안경, 직사각형, No. 1	VWR International	48393-106	샘플을 보호하기 위해 탈수 및 세척된 조직 위에 커버슬립을 놓습니다.
광학 현미경	Nikon		우리 연구실에서 사용하는 고급 자동 연구 현미경 Eclipse 90i는 중단되었으며 Eclipse Ni-E를 대체했습니다.

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