신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

요약

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

초록

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

서론

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 ^(1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 ^-3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 ^4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 ^7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 ^{(10, 11)과} 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 ^12-14.

preweaning 기간 동안 일정 시간 동안 자신의 댐에서 새끼를 제거하는 것을 포함 신생아 산모의 분리 (NMS)의 설치류 모델은 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 지난 20 년간 사용되어왔다. 일반적으로, NMS 직접 시상 하부 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠뿐만 아니라, 변연 구조 ^15-18 하류 조절을 방해하여, HPA 축의 활성화 및 결과적인 불안 같은 행동을 증가시키는 것으로 나타났다. 적절한 HPA 축 작동 중단 증가 대장 ^19-22에 기여하는 것으로 나타났다 및 질 ⁽¹⁶⁾ 감도는 NMS 설치류 모델이 표시되지만 산후 방광 염증 ^23-25의 장기적인 효과의 광범위한 특성에도 불구하고, 초기 생명 응력의 영향은 크게 비뇨 기관에서 배우지왔다. 따라서, 다음의 연구는 마우스에서 NMS을 수행하고 나중에 CP / CPPS위한 전임상 모델로서 남성 NMS 마우스의 사용을 확인하는 전립선 perigenital 기계적 감도 및 비만 세포 침윤 / 활성화를 평가하는 방법을 설명한다.

진단 만성 골반 통증 질환의 모든 중, CP / CPPS는 요통이나 류마티스의 두 번 아마도 약 14 % ^(26)의 평생 유병률과 4,400달러 (추정 연간 환자 비용에도 불구하고 가장 잘 인식과 특징 증후군이다 관절염 ^27). 회음부, 항문이, 전립선, 음경, 고환, 및 / 또는 복부 ^(28)는, 하이를 경험에 CP / CPPS 보고서 통증 환자gher 대조군 ^(29)보다 심리적 스트레스의 정도, 그리고 나의 증상이 일반적으로 현재는 동반 만성 골반 통증이나 기분 장애 ^{5,29-31으로} 진단된다. 재발 성 감염, 누설 상피, 신경성 염증 및자가 면역 모두 기저 전위 / CPPS ^2,32,33 CP의 요인뿐만 아니라, 비만 세포 활성 및 탈과립 ^(34)로 추측되고있다. 또한 증가하고, 비만 세포 활성화 마커 CP / CPPS 남성로부터 발현 전립선 분비물 비만 세포 트립 타제 및 신경 성장 인자 (NGF) 레벨 ^{(34)이 증가하였고,} 이후 연구 트립 타 아제를 확인하고 (CPA3)를 카르복시 CP / CPPS 환자 ^(35)의 소변. 발병 및 CP / CPPS의 유지 보수에 비만 세포의 잠재적 인 역할은 지금까지이 증후군에 대한 동물 연구의 주요 초점이되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델이 CP를 연구하는 데 사용 / CPPS는 실험자가 면역 전립선 염이다 (EAP) 모델 겐^34,36-39 사용 종과 변형에 따라 전립선 염증의 변화도 초래 완전 프로 인트 보조제, 전립선 항원의 피하 주사에 의해 erated. 비만 세포의 침윤 및 활성화 / 탈과립은 EAP ^34,35,40의 다음 유도를 증가하는 것으로 나타났다. 비만 세포 ⁽³⁴⁾ 또는 트립 타제 수용체 PAR2 ⁽³⁵⁾ 중 하나에 결함이 형질 전환 마우스는 야생형 EAP 마우스와 달리 EAP 다음 전립선 전술 감도를 개발하지 않습니다. 이 전임상 모델은 인간의 CP / CPPS의 많은 특징을 복제하는 동안, 유도 프로토콜 직접적인 염증, 감염, 또는 전립선의 손상을 포함하지 않는 종종 다양한 원인을 가지고 있으며, 인간의 상태를 나타내는 아니다.

인간의 CP / CPPS의 개발에 초기 생활 스트레스의 영향은 크게 uninvestigated 갔다; 그러나, 후진타오, 등. ^(41)에 의해 연구는 나를 시연N 어린 시절 신체적, 감정적 인의 역사를보고, 및 / 또는 성적 학대는 CP / CPPS을 암시하는 증상을 경험 훨씬 더 많은 것으로 나타났다 사람들. 또한, 그들은 고통과 소변 점수가 모두 신체적, 정서적 학대의 역사를 가진 환자에서 증가 된 것으로 나타났다. 우리는 이전에 암컷 C57BL / 6 마우스에서 NMS 같은 패러다임에 질 과민증 비정상적인 유전자 발현을 생산하고 있음을 증명하고있다 양쪽 성기 및 역기능 HPA 축 ^(16)의 출력 암시 방광. 보다 명확 어릴 응력 노출 ^12-14과 연계되는 것으로 도시되었다 IC / PBS 및 기분 장애를 포함하는 다른 동반 질환 ^(42), 제시하는 CP / CPPS 환자의 높은 유병률과 결합이 증거는, 사용에 대한 근거를 제공한다 NMS 모델 생쥐에서 CP / CPPS을 알아보고자 하였다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 신생아 모자 분리 (NMS)

1. 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다.
   참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날.
2. (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다.
3. 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러.
4. 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다.
5. 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다.
6. 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 ^{O C와} 50 %의 습도에서 개최.
7. 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다.
8. , NMS를 받고 각 쓰레기 / 댐 깨끗한 장갑 및 보조 용기를 사용하여 각 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다.
9. 그들은 제거로 180 분간 분리 기간의 끝에서와 같은 순서로 자신의 홈 케이지로 돌려 담가.
10. 이전에 하루에 분리 된 첫 번째 쓰레기의 홈 케이지를 검색합니다. 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다.
11. 인큐베이터에서 첫 번째 비커를 제거하고 새끼를 처리하는 동안 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러.
12. 조심스럽게 집 케이지에 비커에서, 개별적으로, 새끼를 이동합니다.
13. 에 비커에 남아있는 우라늄 농축과 침구를 돌려줍니다홈 케이지.
14. 홈 케이지에 차 컨테이너에서 댐을 돌아 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 돌아갑니다.
15. 물을 비이커를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 분리 절차를 통해 각각의 쓰레기에 대해 동일한 비커를 사용합니다.
16. 그들은 배양기에 넣고, 같은 순서로 NMS를 받고 각각의 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다.
17. 각각의 쓰레기 겪고 NMS (P21)를 통해 매일 매일이 전체 절차를 반복합니다.
18. 음식과 물을 완벽하게 깨끗한 케이지에서 함께 동성의 한배 새끼를 배치하여 P22에 NMS와 순진한 새끼를 유아. 순진한 새끼가 태어나 NMS 마우스와 같은 조건에서 보관하지만 일반 축산 작업 이외의 추가 처리를 받게 될 수 없습니다.

2. Perigenital 기계 감도

1. 프레이 장치 설치
   1. 테스트 룸에 마우스를 가져오고 그들이 30 적응 할 수 있도록분은 자신의 홈 케이지에 남아있다.
   2. 연구자는 마우스, 높이 약 55cm를 깜짝 놀랄없이 아래쪽에서 접근 할 수 있도록 충분한 공간을 제공하는 높은 와이어 메쉬 탑 테이블 (79cm X 28cm) 아래에 흡수 underpad을 배치하여 테스트 영역을 준비합니다.
   3. 분명,이 뚫린 플라스틱 챔버에서, 개별적으로, 12 마우스에 철망 테이블 상단에 (11cm X 5cm X 3.5 cm)를 놓습니다. 탈출 마우스를 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 놓습니다.
   4. 움츠림 역치 평가 이전 화면에 추가로 30 분 동안 마우스를 적응.
2. Perigenital 기계 감도 평가
   1. 경사 본 프레이 모노 필라멘트 ^(43)의 표준 세트를 사용하는 업 - 다운 방법을 수행. 다음과 같은 모노 필라멘트를 사용하여 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g 및 4.74 g의.
      1. 3.22 G 모노 필라멘트의 기초를 잡고 후퇴 모노 노출필라멘트.
         참고 : 일부 모델은 후퇴 모노 필라멘트가 없을 수 있습니다.
      2. 모노 필라멘트가 수직 배향되도록 프로브를 놓다 및 마우스, 경보 움직이며, 그 체중이 뒷발에 고르게 분배 될 때 약간까지, 정중선을 피하고, 음낭 좌우 양측에 적용 벤드는 필라멘트에서 관찰된다.
      3. 10 초 동안이나 동물이 긍정적 인 반응을 보일 때까지 자리에 모노 필라멘트를 잡습니다.
         참고 : 긍정적 인 반응은 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 모노 필라멘트 지향 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 간주됩니다. 이러한 행동을 표시하지 않고, 10 초 모노 필라멘트의인가 마우스 이동, 모노 필라멘트는 최소 1 분 길이의 휴지 기간 다음 재시험되어야한다면. 마우스 이동도도 10 초 모노 필라멘트인가에 나열된 전술 한 동작이 나타나는 경우, 부정 응답 여겨진다.
      4. 실험실 노트북 또는 노트북에, 음 또는 양 중, 응답을 기록하고 3.22 g의 모노 필라멘트를 사용하여 나머지 쥐 모두에서이 절차를 반복합니다.
      5. 다시 다음 적절한 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 모두 테스트합니다. 주 : 마우스 3.22 g 모노 필라멘트로 부정 응답을 나타내 경우 동일한 방법으로 3.61 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. 마우스 3.22 g 모노 필라멘트에 양성 반응을 나타내 경우 2.83 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다.
   2. 제 양성 반응이 관찰 된 후에 추가의 애플리케이션을위한 4, 적절한 다음 크거나 작은 각 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 시험 계속.
   3. 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
   4. Chaplan 등. ^(43)에 기재된 바와 같이 50 % g 움츠림 역치를 계산하는 로그 단위 시험 시리즈인가 최종 본 프레이 모노 필라멘트의 값을 사용한다.

제목 "> 3. 산성화 톨루이딘 블루 비만 세포 염색

1. 조직 처리
   1. intracardially 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 ⁴⁵ 관류 된 마우스로부터 전립선 조직 ⁴⁴ 해부. 후위 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 한 후 4 ° CO / N에 1X PBS의 30 % 자당에 cryoprotect.
   2. 헵탄의 작은 (30 ml)에 목욕을 준비하고 드라이 아이스에 놓습니다.
   3. 1X PBS에서 전립선 조직을 씻어 빛 의무 닦아 사용하여 건조.
   4. 이 동결 될 때까지 차가운 헵탄으로 전립선 조직을 삽입합니다.
   5. 냉동 될 때까지 즉시 드라이 아이스에 장착 매체와 장소를 포함하는 cryomold에 냉동 전립선 조직을 배치합니다.
   6. 스토어는 -20 ° C에서 cryomolds.
   7. 가로 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm의 두께 저온부로 전립선 조직을 잘라.
   8. 긍정적으로 충전 된 현미경 슬라이드에, 조직의 길이에 걸쳐 12 비 직렬 저온부 - 8 놓습니다.
   9. 저장소 추가 처리 할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 마쳤다.
2. 산성화 된 톨루이딘 블루 준비
   1. 1 % 스톡 용액을 제조 할 때까지 용액에 100 ml의 70 % 에탄올과 와류에 톨루이딘 블루 O 1 g을 넣고. 원액은 최대 3 주 동안 실온에서 저장 될 수있다.
   2. 교반 판의 상단에 배치 비커에 100ml의 물에 1g의 NaCl을 추가합니다.
   3. 달성되는 1.0 - 0.5의 pH 범위까지 12 M 염산을 사용하여 NaCl 용액의 pH를 조정한다.
   4. 톨루이딘 블루 스톡 용액 8 ml의 1 % NaCl 용액 32 ㎖에 결합하여 0.25 % 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비한다. 톨루이딘 블루 원액의 전체 통합을 보장하고 소용돌이를 사용하여 혼합 아래로 피펫합니다. 작업 솔루션은 신선한 만든 및 사용 후 폐기해야합니다.
3. 전립선 저온부 염색
   1. 냉동고에서 처리되는 슬라이드를 제거하고 약 30 m에서 RT로 평형을 허용있다.
   2. 개별적으로 슬라이드 마운트 조직 섹션 완전히 잠수되는 것을 보장하기 위해 1X PBS의 충분한 양을 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 약 1 초 동안 침지하여 슬라이드 조직 절편을 씻는다. 슬라이드는 종이 타월에 공기 건조하도록 허용합니다.
   3. 충분히 0.25 % 작업 톨루이딘 블루 솔루션을 포함하는 유리 염색 항아리에 넣어 슬라이드는 슬라이드에 장착 된 조직 절편이 완전히 침수 될 수 있도록 10 동안 배양 - 동안 15 rpm으로 설정 플랫폼 로커에 15 분.
   4. 약 1 초 동안 1X PBS에서 딥 슬라이드 초과 톨루이딘 블루를 씻어.
   5. 슬라이드 배수를 허용하도록 그들의 양쪽되는 방식으로 슬라이드 박스 또는 선반 슬라이드를 놓는다.
   6. 2 시간 또는 RT에서 O / N의 최소 37 ° C의 오븐에서 슬라이드를 건조.
   7. 알코올 노출 사이의 슬라이드는 완전히 건조 있도록 신속 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수. 종이 수건에 배수에 의해 건조 슬라이드차 경량으로 닦아 백업 및 가장자리가 닦습니다.
      1. 약 1 초 동안 95 % EtOH로에서 슬라이드를 담그고 완전히 건조 할 수 있습니다. 조직이 보라색보다 더 푸른 건조 될 때까지 10 회 -이 절차 1을 반복합니다.
      2. 약 1 초 동안 100 %의 EtOH에 슬라이드를 담그고 완전히 말리십시오. 조직이 매체 파란색으로 어두운하지만, 보라색되지 때까지 10 배 -이 절차 1을 반복합니다.
   8. 3 분 동안 100 % 크실렌의 슬라이드를 배양하여 얼룩을 수정합니다. 건조하도록 허용합니다.
   9. 글리세롤, PBS, 또는 자일 렌 계 영구 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. 실온에서 초과 용지 및 저장을 배출합니다.
4. 정량화 비만 세포
   1. 20X 배율 광학 현미경을 사용하여 (그림 2)에서 톨루이딘 블루 스테인드 조직 섹션을 시각화.
   2. 가시 영역 내에 존재하는 비만 세포의 총 수를 계산 및 비 degranulated degranulated 및 비만 세포를 구별. 40X의 MAGNIFICAT이온 일부 비만 세포에서 과립의 상태를 확인하기 위해 필요할 수있다.
      참고 : 비 degranulated 비만 세포가 없거나 희미 핵 개요 및 / 또는 세포 주위에 세분화 된 압출과 밀도 metachromasia을 나타낸다. Degranulated 비만 세포는 덜 심한 metachromasia를 나타내고 세포질 내 및 셀 경계 외부 핵 및 / 또는 자유 과립 명백한 명확한 윤곽을 갖는다.
   3. 현재 조직 절편의 전체 비 degranulated degranulated 및 비만 세포의 총 수를 지속적으로 평가. 길이 각 조직에 걸쳐, 최소 7 추가적인 별도의 섹션에서이 절차를 반복합니다.
   4. 하기 식에 따라 각 조직 / 전체 마우스 비만 세포에 degranulated (DG)의 비율을 계산한다 (DG 비만 세포 / 총 비만 세포) × 100.

결과

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에서, 이것은 상당한 감소 (학생의 t- 테스트 P <0.01)로 입증된다 .

NMS에 노출 된 마우스는 CP / CPPS의 조직 학적 증거를 표시. 전립선 조직의 저온 섹션은 비만 세포 (도 3A-D)에 수납 트립 타 아제 과립을 관찰로 산성화 O 톨루이딘 블루 염색 하였다. 활성화, 예를 들면, 확산 metachroma 증거를 보였다 비만 세포의 백분율SIA,...

토론

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 ^12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습적 유도를 포함하는 신규 한 접근법 더 일반적으로, 화학적으로, 사용 전립선 ^34,36-39의 염증을 면역 학적으로 유도하는 데 반대했다. ,에 의해 전시 된 동반 신체, 기분, 그리고 내장 질환과 유사 (데이터가 표시되지 ¹⁶⁾ 또한, 마우스의 NMS는 과민 반응을 변경된 불안 같은과 anhedonic 행동을 포함하여 동반 symptomology, 증가 배뇨 속도를 생산하고, 뒷발 것으로 나타났다 CP / CPPS의 patie국세청

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
임산부 C57BL/6 암컷 마우스	찰스 리버	027	시간 측정 또는 시간 제한이 없는 임산부는 가정 출산을 위해 매일 모니터링해야 합니다.
2L 유리 비커	Sigma-Aldrich	CLS10002L	각 NMS 깔짚은 21일의 분리 기간 동안 동일한 비커에 보관됩니다.
VWR 강제 공기 인큐베이터, 기본	VWR International	414005-124	인큐베이터는 33°C에서 개최되어야 합니다. C 및 50% 습도.
터치 테스트 감각 평가기, 20개들이 키트 (터치 평가용 Semmes-Weinstein von Frey 감각계)	Stoelting	58011	생식기 주변 민감도 평가를 위해 다음 모노필라멘트를 사용해야 합니다: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, 4.74 g.
동물 우리 (12 마리, 6 마리의 쥐)	IITC	435	쥐가 탈출하는 것을 방지하기 위해 개별 아크릴 동물 울타리 위에 무거운 물체를 올려 놓으십시오.
생쥐와 쥐를 위한 메쉬 스탠드 (12마리, 6마리의 쥐)	IITC	410	편안한 접근을 위해 안정적인 테이블 위에 스탠드를 놓습니다.
인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	P5493	은 10x PBS 스톡을 1x PBS로 희석합니다.
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148	비만 세포 염색을 준비하기 위해 마우스와 후위 조직을 심내 관류하려면 4% 파라포름알데히드 용액이 필요합니다.
자당	: 시그마 - 알드리치	S5016	: 4 °C에서 30 % 자당 용액의 Cryoprotect 고정 조직; 하룻밤 사이에 C.
헵탄	시그마-알드리치(Heptane Sigma-Aldrich	246654	드라이아이스에서 헵탄을 식혀 조직을 얼립니다.
표준 Cryomold	VWR International	4557	냉동 절편 전 전립선 조직 동결을 돕기 위해
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	생물학적 염색 위원회의 인증을 받았습니다. 비만 세포의 변색 염색제로 사용하기에 적합합니다.
에탄올, 앱솔루트(200프루프)	Fisher Scientific	BP2818-4	분자생물학 등급, Fisher 생물시약; 비만 세포 시각화 전에 염색된 동결 절편을 탈수하기 위해 95% 및 100% 용액이 필요합니다.
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S9888	산성화 NaCl 용액은 저온 절편을 염색하기 전에 신선하게 만들어야 합니다.
GeneMate 멸균 50 ml 원심분리기 튜브	BioExpress	C-3394	일회용 튜브는 툴리딘 블루 요소를 혼합하거나 슬라이드를 1xPBS에 담그는 데 사용됩니다.
10 슬라이드용 코플린 염색 접시, 접지 유리 커버 포함	Fisher Scientific	08-815	최대 10개의 표준 3 x 1인치를 담을 수 있습니다. (75 x 25mm)가 연달아 미끄러집니다. 톨루이딘 블루 작업 용액, 95% EtOH, 100% EtOH 및 자일렌에 대해서는 별도의 접시를 사용하십시오.
자일렌(조직학적)	Fisher Scientific	X3P	탈수가 완료되면 조직은 자일렌으로 제거됩니다.
현미경 슬라이드 박스, 100자리	VWR International	82003	박스는 슬라이드의 보관 및 운송에 사용할 수 있습니다.
Fisherbrand 현미경 슬라이드 박스	Fisher Scientific	22-363-400	이 슬라이드 박스는 일반적으로 극저온 상태 내부에 들어갈 수 있을 만큼 작습니다.
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	글리세롤은 전통적인 장착 매체입니다.
마운팅 미디어, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	마운팅 미디어는 커버슬립을 슬라이드에 단단히 접착합니다.
마이크로 커버 안경, 직사각형, No. 1	VWR International	48393-106	샘플을 보호하기 위해 탈수 및 세척된 조직 위에 커버슬립을 놓습니다.
광학 현미경	Nikon		우리 연구실에서 사용하는 고급 자동 연구 현미경 Eclipse 90i는 중단되었으며 Eclipse Ni-E를 대체했습니다.