이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.
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정오 공지
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요약
초록
PDX(Patient derived xenograft) 모델은 암 연구에서 인기를 얻고 있으며 전임상 약물 평가, 바이오마커 식별, 생물학적 연구 및 맞춤형 의학 전략에 사용됩니다. 순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하며 여러 유형의 종양 환자로부터 분리되었습니다. 최근에는 유방암 및 전립선암의 PDX 실험 모델을 생성하기 위해 CTC가 사용되고 있습니다. 이 원고는 우리 그룹에서 개발한 CTC에서 전립선암 PDX 모델을 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 기존 PDX 모델에 비해 이 방법의 장점으로는 수술 샘플 수집으로부터 독립성을 가지며 다양한 질병 단계에서 실험 모델을 생성할 수 있다는 점이 있습니다. 전이성 질환 환자로부터 수집한 말초 혈액 샘플에서 CTC를 농축하기 위해 적혈구 용해 및 CD45 양성 단핵 세포의 유세포 분석 고갈에 이은 밀도 구배 원심분리를 사용합니다. 그런 다음 CTC를 면역이 저하된 마우스에 주입합니다. 이후에 생성된 이종이식편은 기능 연구에 사용하거나 분자 특성화를 위해 수확할 수 있습니다. 이 방법의 주요 한계는 CTC 농축에 사용되는 음성 선택 방법입니다. 이러한 한계에도 불구하고 CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암 연구에 적용할 수 있는 새로운 실험 모델을 제공할 수 있습니다.
서론
환자 유래의 이종 이식은 암 연구에 사용되는 점점 더 인기를 실험 모델입니다. 이들은 생체 생물학적 경로, 전임상 약효 평가, 및 개인화 된 암 치료를위한 1,2- 아바타의 생성 특성에 사용될 수있다. 이전에, 다른 연구 그룹은 주입 또는 면역 저하 된 마우스 (1)에 단일 종양 세포 현탁액 또는 전체 종양 이식편을 주입함으로써 어느 PDX 모델을 개발 하였다. 이 PDX 모델은 신선한 고형 종양의 수술 수집, 악성 복수 또는 비용이 많이 드는 둘과 인성 사망률의 증가 위험에 환자를 노출하는 수술을받은 환자에서 흉막 삼출이 필요합니다.
암 연구 분야에서 최근의 발전은 상당한 종양 세포 순환의 검출, 분리 및 특성화되었다. 이들 종양 세포가 일차 종양 덩어리에서 탈출하고 순환을 입력그들은 전이 및 재발에 중요한 역할을하는 경우, 암의 가장 흔한 원인은 관련 사망률 3. 여러 고형암 유형에서 CTCS의 평가 및 특성 진단, 예후, 잔류 병 (3)를 모니터링하기위한 임상 정보를 제공하고 있습니다. 어느 물성, 바이오 마커의 발현 또는 CTCS의 기능적 특성에 의존하는 현재 사용되는 방법의 다양한 효율적 CTCS <....
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프로토콜
이 프로토콜은 기관 연구 윤리 보드에서 승인을 우리의 기관에서 수행과 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 지침을 준수하고 있습니다.
고급 전립선 암 환자에서 말초 혈액 1. 컬렉션
참고 : 전이성 전립선 암 환자를 선택합니다. 기록 된 환자의 동의를 얻어 격리 연령 이전 화학 요법과 호르몬 치료를 포함하여 환자의 임상 적 특징을 기록한다. 전이성 질환을 가진 환자는 잠재적으로 말초 혈액에서 CTCS의 가장 높은 농도를해야합니다.
- 동의 후 적절한 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인하에 혈액 샘플을 수집합니다. 라텍스 장갑 및 절차 전반에 걸쳐 실험실 코트를 착용 할 것.
- 바늘 홀더에 25 G 나비 바늘과 튜브를 연결합니다. 의 영역을 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용하여이두와 팔뚝 사이의 전주 정맥 후 환자의 상완에 지혈대를 적용합니다.
- 전주 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 수집을 시작하기 위해 바늘 홀더에 혈액 수집 튜브를 밀어 넣습니다. 혈액 응고를 방지하기 위해 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유 수집 튜브에 혈액의 약 10 ㎖를 수집한다.
- 환자에서 나비 바늘을 제거하고 1 분 동안 정맥....
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결과
이 프로토콜은 절연 CD45 네가티브 전립선 암에서 CTCS PDX 모델의 생성을 초래할 것이다. 우리의 프로토콜에서 사용되는 음성 선별 방법에 따라 그 DAPI 염색을 이용하여 사균을 배제 할 필요가있다. 유동 세포 계측법에 의해 검출 CD45 음성 세포의 비율은 가변적이며 환자 (도 1a)의 종양 부담에 따라 달라진다. 흰색 화살표 (도 1b)로 표시된 바와 같이 (세포 핵을 식별) CD45 및 DAPI를 사용하여 정렬되지 않은 세포의 면역 형광 염색, CD45 음성 세포를 보여준다. 도 1C에서, 피하 결절 밀도 마우스의 양쪽 측면에 알 수있다. 각 결절 밀도는 이종 이식의 성장을 나타내며,이 마우스의 등 근육에서 돌출과 질감에서 확고한 같이 건강한 조직에서 별개로 감상 할 수 있습니다. 주입 및 이종 이식 개발 사이의 시간 간격은 patie의 CTC 부담에 따라 크게 달라질 수 있습니다NT 샘플, 이식 된 세포의 수와 CTCS의 .......
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토론
이 원고 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델 생성 방법을 설명한다. PDX의 생성을위한 CTCS의 사용 기존의 방법에 비해 여러 가지 잠재적 모델 중요한 이점을 갖는다. 첫째, 말초 혈액에서 CTCS의 접근 컬렉션 다른 질병 단계에서 동일 환자에서 실험 모델의 생성을 가능하게한다. 둘째, 채혈은 종양 세포의 수집을위한 수술을 필요로 기존 방법에 비해 종양 세포를 분리하기 위해 안전하고 저렴한 방법을 나타낸다.
CTC 농축 여러 방법이 많은 인해 자금과 자원의 한계로 모든 실험실에 액세스 할 수 없습니다 그러나 기술되었다. 우리는 외과, 많은 실험실, 편리 저렴하고 접근 방법의 사용에 활용할 수있는 우리의 실험실에서 분석을 개발하기 위해 노력했다. 이러한 방법의 잠재적 인 제한은높은 종양 환자에게 부담이 프로토콜의 사용을 제한 할 수 희귀 세포의 검출 감도가 불충분. 상피 세포의 물리적 또는 생물학적 특성을 사용하는 기술은 여러 가지 추가 이상.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
유세포 분석에 도움을 주신 Mount Sinai Medical Center의 유세포 분석 공유 리소스의 Jordi Ochando 박사에게 감사드립니다. 이미징 지원을 제공해 주신 마운트 시나이 메디컬 센터(Mount Sinai Medical Center)의 현미경 공유 리소스 시설(Microscopy Shared Resource Facility)의 루마나 후크(Rumana Huq) 박사에게 감사드립니다. 저자는 이 프로젝트를 지원한 TJ Martell 재단에 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 35 µ m 세포 여과기 | BD Falcon | 352340 | |
| 50ml 폴리스티렌 원뿔형 튜브 | Crystalgen | 23-2263 | |
| 적혈구 용해 완충액 | Sigma | R7757 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| 세포 여과기 캡이 있는 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브 | BD Falcon | ||
| BD Vacutainer 라벤더 혈액 수집 튜브, EDTA | |||
| BD 날개 혈액 수집 세트, 푸시 버튼 수축 바늘 23 게이지 | |||
| BD Vacutainer 일회용 바늘 홀더, | |||
| 일회용 라텍스 지혈 | |||
| 또는 비 라텍스 장갑 | |||
| 알코올 면봉 | |||
| 2 × 2 면 거즈 패드 | |||
| 접착 붕대 | |||
| 25g 바늘 | |||
| 1ml 주사기 |
참고문헌
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinica....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/01/2015. Citeable Link.
A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo
