이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.
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방법 논문
디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용
이 논문에서
요약
초록
ddPCR은 물-기름 에멀젼 시스템을 사용하는 고감도 PCR 방법입니다. 액적 발생기를 사용하여 추출된 핵산 샘플을 ~20,000개의 나노 크기의 유류 내 물방울로 분할하고 개별 방울에서 PCR 증폭이 발생합니다. ddPCR 접근법은 염기서열 돌연변이, 복제 수 변화를 식별하고 표적 유전자와 관련된 구조적 재배열을 선택하는 것입니다. 여기에서는 FFPE 참조 표준 세포주에서 희귀 BRAF V600E 돌연변이를 정확하게 정량화하기 위한 강력한 기술로 ddPCR을 사용하는 방법을 보여주며, 이는 암 환자를 식별하는 데 도움이 됩니다. 결론적으로, ddPCR 기술은 다양한 유형의 FFPE 샘플에서 서로 다른 유전자의 특정 희귀 돌연변이를 정확하게 프로파일링할 수 있는 잠재력을 제공합니다.
서론
키 조절 유전자의 유전 적 돌연변이의 축적은 암 1에 이르는, 세포 증식, 분화, 생존 등의 정상 세포의 프로그래밍을 변경합니다. RAS-RAF-MAP 키나아제 경로는 성장 신호를 세포 반응을 매개한다. 종양 BRAF 돌연변이는 2 지나친되기 위해 암 단백 BRAF가 발생할 수 BRAF 유전자의 드라이버 돌연변이에서 발생할 수 있습니다. BRAF 유전자의 돌연변이는 또한 차례로, 성장 인자 - 매개 규제 4-6 독립적 과도한 세포 성장 및 증식에 이르게, MEK 및 ERK 3 시그널링을 통한 과민성 하류 초래한다.
여러 가지 도구는 ddPCR으로 포르말린 고정, 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인에서 정량 실시간 BRAF의 V600E 돌연변이로, DNA 돌연변이 프로파일을 사용할 수 있습니다. ddPCR 절대 정량 PCR 기반의 방법입니다종래의 실시간 정량적 PCR (qPCR의) 7,8- 비해 더 높은 정확성을 제공. ddPCR 또한 더 많은 정보를 암 연구 및 진단 9있게 DNA 템플릿 희귀 돌연변이 검출을위한 전력 및 높은 정확도를 해결 제공한다. 낮은 서식 복사 번호 10-12을 연구 할 때 기존의 qPCR에 이상 ddPCR의 추가 장점은 향상된 감도와 정확도를 포함한다. 여기서, 자동 ddPCR 의해 BRAF V600E 돌연변이의 유무를 판정 하였다 FFPE 참조 표준 세포주로부터 DNA를 추출하기위한 프로토콜이 설명된다. 데이터 분석 및 결과의 그래픽 표현을위한 소프트웨어의 사용이 또한 설명된다. 전체 절차는 상대적으로 간단하고 완전히 프로파일 링 할 샘플의 개수 및 사용 가능한 통상적 인 PCR과 ddPCR 기계의 수에 의존한다.
다음 프로토콜은 BR에 대한 표준 절차를 설명 AF V600E 양성 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))는 티슈 제조 시스템 (TPS) 프로토콜을 사용하여 완전히 자동화 된 장비에서 수행된다. 이어서, 절연 DNA 샘플 ddPCR 시스템을 사용 BRAF V600E 돌연변이의 존재에 대해 분석된다. 모든 샘플들이 파일링 된 후에 표적 돌연변이 분석이 수행되고 데이터가 데이터 분석 소프트웨어로 로딩되었다. 샘플의 수에 따라 / 기 공부, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 요구할 수있다. 방법론의 실험적인 구성 요소는 처리에 정확성을 필요로 DNA를 하고rological 피펫과 피펫, 피펫의 상황에 대해에 대한 자세한 내용을 설명하는 조브 과학 교육 비디오 "> 96 웰 플레이트에 피펫 팅, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다.
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프로토콜
FFPE 참조 표준 셀 라인 1. DNA 추출
주 :이 절차는 DNA 추출은 아래 프로토콜에 기재된 바와 같이 FFPE 조직 DNA 분리 키트를 이용 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))에서 수행 하였다. 자동화 된 DNA 추출은 전체 DNA의 분리를위한 제조업체의 지침에 따라 이루어졌다.
- 마이크로톰 및 원래 FFPE 블록을 사용하여 수동으로 설정된 절차에 따라, 종래 DNA 추출 및 분석 신선한 섹션을 준비한다. 조직 절편 (들)에 대한 입력 샘플이 10 ㎛의 두께의 합계를 초과하지 않는 것을 확인하고 분석 표면적은 단일 섹션 600mm 2를 초과하지 않도록.
1.2 TPS 프로토콜
주 : 표 1에 나타낸 양 (48)은 샘플을 처리하는 데 필요한 최소에 해당하고, 절차도시는 TPS 지침에 따른다. 실험을 시작하기 전에 자동 프로그램 중에 시료의 손실을 피하기 위해 600 XG에서 원심 분리하여 튜브의 전자 FFPE 시료를 진정.
- 자동화 된 DNA 분리 악기와 컴퓨터를 켭니다. 실행 제어 소프트웨어를 열고 TPS 갑판 적재 영역으로 자동로드 트레이를 삽입합니다.
- 도 1에 도시 된 바와 같이 해당 홈통으로 시약을 분주한다.
- 샘플 캐리어 랙에 4 샘플 (BRAF (WT), BRAF V600E 50 %, 5 %, 1 %)을 놓습니다.
- 열 2, 3의 골짜기에서 팁 상자를 놓고 실행을 중단 할 팁 당 하나 이상의 필터의 존재에 대한 도움말을 확인합니다.
- 그들에게 3-5 번 반전 용해 버퍼 및 세척 버퍼의 적절한 혼합을 확인하고 열 4 (그림 1)의 각 골짜기에로드.
- 몇 번이나 가벼운 vort에 대한 반전 후exing, (그림 1, 표 1) 표시된 곳 1 슬롯 빈 떠나, 열 5에있는 작은 골짜기에서 용출 버퍼, 자석 구슬 및 FFPE 버퍼를로드합니다.
- 플레이트 캐리어 (그림 1)에 2 ㎖의 깊은 우물 판 (DWP)을로드합니다.
- 실행을 시작하기 전에 다음 최종 단계를 수행합니다 :
- 모든 튜브와 시약 골짜기를 뚜껑을 벗기다. 충분한 용량이 액체 폐기물 병에 사용할 수 있습니다 확인합니다. 고체 폐기물 병이 비어 및 생물 학적 가방 늘어서 있는지 확인합니다. 팁 꺼내기 판은 폐기물 어셈블리의 중앙에 있는지 확인합니다.
- 전면 커버를 닫습니다.
- 소프트웨어를 시작합니다. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med 파일을 엽니 다.
- "시작."악기 상태는 실행에 유휴 상태로 전환됩니다.
- 이 실행을위한 샘플의 수를 입력합니다. 이 런 (DNA = 0)에 대해 원하는 방법을 선택합니다. 제 1 고 부피의 위치를 입력매화 팁, 모든 용지함이 가득 경우 "1"을 선택. 모든 용지함이 가득 경우 "1"을 선택, 최초의 표준 볼륨 끝의 위치를 입력합니다.
참고 :이 장비는 다음 사용자의 개입없이 자동 단계를 실행합니다. 상세한 흐름은도 2에 도시되어있다. 실험이 끝나면 반응물 폐기물 및 팁 폐기 조립체 내로 주입된다. - 형광 방법에 의해 정제 된 게놈 DNA를 정량.
주 : 3.3 NG / μL의 최소 농도를 포함하는 DNA 샘플 ddPCR 분석 (2 장)을 실시한다.
2. DNA 돌연변이 프로파일 : ddPCR 프로토콜
주 : 1) 물방울 세대, 2) 기존의 PCR 증폭, 3) 물방울 읽기 및 4) DNA 돌연변이 프로파일 : DNA 돌연변이 프로파일에 대한 프로토콜은 3 주요 단계로 구성되어 있습니다.
2.1. 물방울 세대
참고 : ddPCR의 수퍼 믹스가이 혼합 액적 생성에 필요한 시약을 포함로, ddPCR하는 것이 좋습니다.
- , 오염을 방지 같은 깨끗한 PCR 후드, 깨끗한 피펫, 낮은 단백질 결합 튜브를 사용하여, 장갑을 착용 표준 예방 조치를 따르십시오.
- 인간 게놈 DNA 샘플의 최소 농도는 3.3 NG / μL 있는지 확인하십시오. 주 : 정제 DNA 시료 농도의 양은 % 돌연변이 주파수 검출의 분석에 따라 달라질 것이다.
- 96 웰 PCR 플레이트에 반응 혼합물을 조립합니다. 해동과 RT에 반응 성분 평형. (각 정제 된 DNA 샘플 (66ng / 2 μL) 증류수로 20 μL를 구성하여 2 배 ddPCR의 수퍼 믹스 (10 μL) 및 (20) 프라이머 (순방향 및 역방향, 900 ㎚) 및 프로브 (250 nm의)를 결합하여 PCR 반응을 준비 ) 방울 생성기 프로토콜 당
- 분배 전에 튜브의 하단에 컨텐츠를 수집 및 균질성을 간단히 원심 분리되도록 충분히 혼합 소용돌이. 로드 (20) & #181, 방울 형성을위한 카트리지 상 L.
- 제조자의 권장 프로토콜에 따라 액적 발생기의 작동
- 홀더의 상부 좌측에 위치 된 카트리지의 노치와 홀더에 카트리지를 삽입한다. 바닥 우물에 중앙으로 샘플을 포함하는 반응 혼합물의 20 μL, 발전기 오일의 70 μl를 추가합니다.
- 카트리지의 상단에 개스킷을 부착합니다. 가스켓은 홀더의 양쪽 끝에 안전하게 걸려 있는지 확인; 그렇지 않으면, 액적 생성하기에 충분한 압력이 달성되지 않을 것이다.
- 악기의 위에 녹색 버튼을 누름으로써 액적 발생기를 열고 카트리지를 삽입. 홀더 전원 (오른쪽에서 왼쪽)와 홀더 (가운데 오른쪽) 표시등이 녹색으로 둘은 올바른 위치에있을 때.
- 문을 닫고 다시 악기 상단 버튼을 눌러 방울 생성을 시작합니다. 참고 : B를 누르면utton, 물방울이 생성 된 미세 유체 채널을 통해 석유 및 샘플을 그리기 출구 우물을 통해 매니 폴드 위치 자체. 그들이 축적 곳에 물방울이 잘 방울로 흐른다. 10 초는 액적 생성이 진행 중임을 나타냅니다 후 액적 표시 등 (오른쪽) 녹색으로 깜박입니다.
- 액적 생성이 완료되면, 3 표시등이 녹색으로 변경; 버튼을 눌러 문을 열고 장치에서 홀더를 제거합니다. 홀더에서 일회용 가스켓을 제거하고 폐기합니다. 주 : 카트리지의 상단 웰 방울을 포함하고, 중간 및 하부 웰 잔유 소량 거의 비어.
2.2. PCR을위한 준비
- 제조자의 프로토콜 기기에 나타낸 각 시료에 대하여, 권장하는 96 웰 PCR 플레이트의 웰에 단일 상부 웰 카트리지로부터 액적 (40)의 내용을 μL 피펫. 아니TE : 멀티 채널 피펫을 사용하여 액 적을 에멀젼 전송에 적합하다. 방울의 느리고 부드러운 흡입은 전송 중에 방울 전단을 최소화하는 것이 좋습니다.
- 즉시 증발을 방지하기 위해 방울을 전사 후 호일 PCR 플레이트를 밀봉. PCR 플레이트 실러와 방울 리더 바늘과 호환되는 천 공식 박 플레이트 씰을 사용합니다. PCR 플레이트 실러 설명서의 지시 사항을 따르십시오.
- 180 ° C의 플레이트 실러 온도와 5 초에 시간을 설정합니다.
- 트레이 문을 열 수있는 화살표를 누릅니다. 96 웰면이 위를 향하도록 트레이에 지원 블록을 배치합니다. 지원 블록에 96 웰 플레이트를 놓고 모든 판 우물이 지원 블록에 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 천 공식 호일 씰 1 시트 96 웰 플레이트를 커버. 96 웰 플레이트 지원 블록에 고정하고, 천 공식 호일 씰으로 덮여되면, 실 버튼을 터치합니다. 트레이가 닫히고열 밀봉 시작합니다.
- 가열 밀봉이 완료되면, 자동으로 문이 열리고 열 순환 용 히트 블록으로부터 판을 제거하고 열 블록을 제거한다.
- 접시에 모든 우물이 호일에 우울증이 잘 각을 통해 쉽게 알 수 있음을 확인하여 밀봉되어 있는지 확인합니다. 밀봉하면, 플레이트는 열 순환에 대한 준비가되어 있습니다.
- 물방울이 제거되면, 열려면 카트리지 홀더에 래치를 누릅니다. 빈 카트리지를 제거하고 폐기.
- 표 2에 설명 된 매개 변수에 따라 기존의 PCR 증폭을 수행합니다.
2.3 물방울 읽기 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라)
주 : 방울 핵산 표적의 PCR 증폭에 이어, 액적 리더 구 개별적 2 색 검출 시스템 (13)을 이용하여 각각의 방울을 분석한다. 우리는 일반적 FAM의 검출을하도록 설정D VIC 기자 형광.
- 주요 방울 독자에게 "세척 시스템"을 클릭하고 ddPCR 분석이 준비합니다.
- 방울 리더에 판을로드하고 "시작."액적 리더는, 각각의 샘플을 흡인 방울을 singulates 및 2 색 검출기 과거의 단일 파일에 스트림. 검출기는 양극과 음극 샘플을 열거 방울을 읽습니다.
- 액적 판독이 완료되면, 도어를 열고 유닛으로부터 판 홀더를 제거한다. 홀더에서 96 - 웰 PCR 플레이트를 제거하고 폐기합니다.
- 적절한 유지 보수를 위해, 액적 리더 오일을 교체하고 필요에 따라 폐기물 용기를 비우고. 미생물 성장을 방지하기 위해 폐 병에 10 % 표백제 50 ㎖를 추가한다.
2.4 DNA 돌연변이 프로파일 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라)
참고 : PCR 양성 및 PCR 음성 방울은 절대 quantific을 제공하기 위해 계산됩니다데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 디지털 형태로 타겟 DNA BRAF V600E 돌연변이의 ATION.
- 샘플, 분석, 실험에 대한 정보를 입력하는 설정을 클릭합니다.
- 설정 창에서, 플레이트 (filename.qlp)을로드, 데이터를 열고 분석하는 분석을 클릭합니다. 결과 표, 잘 선택기 및 가공 데이터 / 그래픽 디스플레이 : 데이터 분석 인터페이스는 세 개의 창으로 분리된다.
- 처리 된 데이터 창에서 각 대상에 대한 농도 데이터는 판지도의 우물에 나타나는 결과 표에서 표로하고 있습니다. 농도 플롯의 데이터를 시각화하기 위해 농도를 클릭합니다.
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결과
우리 ddPCR 분석을 위해, 우리는 BRAF V600E 돌연변이 FFPE 참조 표준 세포주를 연구했다. 액적 리더는 노트북 컴퓨터 실행 데이터 분석 소프트웨어에 연결합니다. 각 방울은 (+) 또는 인 형광 진폭에 기초하여 정의된다. 제조자에 의해 제공된 소프트웨어는 또한 사용자 정의 컷오프는 양극과 음극 사이에 물방울 임계 값을 정의하기 위해 입력 할 수있다. 샘플의 양 및 음의 방울의 수는 복사 / μL의 관점에서 대상의 농도를 계산하는데 사용된다.
형광 검출과 이차원 산점도 디스플레이로 가공, 맞춤형 소프트웨어 각 액적 종료점 클러스터에 적합한 게이트 묘화에 사용하고, 각 게이트 안에서 방울의 수를 계수 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 모든 SAMPL위한 컷오프 라인 위에 청색 도트 (FAM 형광 신호)로 나타낸 미소 방울ES는 (핑크 라인) 변이 BRAF V600E에 대한 긍정적이었다. BR...
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토론
여기서는 특정 유전자 돌연변이 진단을위한 기준 표준 FFPE 세포주 샘플들로부터 ddPCR의 적용 및 DNA 분리를 강조. 본 연구에서는, TPS 자동화 DNA 분리 방법이 용이하고 자동화 된 적응 될 수있는 사용되며, 더 큰 규모의 실험 및 하부 가변성을 허용 동시에 48 가지 시료를 수용 할 수있다. 본 연구에서 DNA 분리의 한계 중 하나는 모든 FFPE 시료가 고유 한 표면 오염 물질, 미생물, 식물에서 서로 다를 것, 및 / 또는 인간의 유전 적 배경이 있다는 것이다. 일반적으로, 추출 된 DNA의 질과 양 및 전체 게놈 DNA의 증폭에 성공 동안 추출 전후 다양한 파라미터에 의존한다. 이들은 조직의 종류와 양, 조직 보존에 사용되는 고정 제의 종류, 고정 기간, 파라핀 블록 및 저장 조건의 연령뿐만 아니라, 목적하는 DNA 세그먼트의 길이를 분석 할 포함 16. 불용 파라핀 불량 샘플의 품질에 이르게으로 조직으로부터 파라핀을 제거하여 추출에 성공한 가장 중요한 단계이다. 액적 생성 중에,주의가 ...
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공개 사항
명 Ryuri 아,시 은혜 김과 젊은 Deug 김 ABION CRO의 직원입니다.
감사의 글
이 연구는 과학, 정보 통신 기술 및 미래 계획 (부여 번호 2013M3C8A1075908)의 교육부에 의해 투자 연구 재단의 사회를위한 R & D 프로그램 (NRF)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD 기기 | 시멘스 | 10701001 | 자동 DNA 분리 기기 |
| QX200 드롭릿 생성기 | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 드롭릿 리더 | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| 램프 시간 조정 | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR 플레이트 씰러 | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft 소프트웨어 | Bio-Rad | ||
| DNA 분리 키트 | |||
| VERSANT 조직 준비 시약 상자 1 | 지멘스 | 10632398 | |
| VERSANT 조직 준비 시약 상자 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE 팁 | Siemens | ||
| ddPCR 돌연변이 분석 | |||
| ddPCR Supermix | 바이오 라드 | BR186-3010 | 2X 농도 |
| DG8 카트리지 | 바이오 라드 | BR186-4008 | |
| 물방울 발전기 오일 | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| 가스켓 | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| 물방울 리더 오일 | Bio-Rad | BR-186-3004 |
참고문헌
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- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943(2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
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