Method Article

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

Abstract

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돌기 쪽은 중추 신경계의 흥분성 시냅스의 후 시냅스 구획에 해당하는 작은 돌기입니다. 그들은 수상 돌기를 따라 배포됩니다. 이들의 형태는 신경 세포의 활동에 크게 의존, 그들은 동적입니다. 돌기 쪽은 표면과 시냅스 밀도의 수준에서 글루타메이트 수용체 (AMPA와 NMDA 수용체)을 표현한다. 각각의 척추는 신경 세포가 독립적으로 주 및 지역 활동을 제어 할 수 있습니다. 척추 모폴로지 광범위 생체 내 접근법과 설치류로부터 얻어지는 신경 조직 배양을 모두 사용하여, 뇌 피질의 글루타메이트 피라미드 세포에서 연구되어왔다. 설치류 배양 뉴런과 일차원 정량 분석 1에 도시 된 바와 같이 신경 병리학 적 조건은, 변경된 척추 유도 및 성숙에 관련 될 수있다. 본 연구는 인간의 cortic를 사용하여 척추 형태학의 3D 정량 분석​​을위한 프로토콜을 설명신경줄 기세포 (늦은 피질 전구 세포)로부터 유래 된 알 뉴런. 이러한 세포는 처음에 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 얻었다. 이 프로토콜은 다른 배양 기간에서 척추 모폴로지의 분석이 가능하고, 정신 질환 환자로부터 수득 된 것과 제어 개체로부터 얻은 유도 된 다 능성 줄기 세포 사이와 비교 가능.

Introduction

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대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 돌기 쪽은 설치류, 영장류, 그리고 인간의 뇌에서 이러한 신경 세포 아형의 기저와 혀끝의 수상 돌기를 따라 분포되어 작고 얇은 돌기 있습니다. 그들은 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트이며, 학습과인지 과정의 주요 기능을 표시합니다. 인간 돌기 쪽의 상세한 구조는 기술적으로 전자 현미경 (2)에 의해 연구되었다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요하고 무거운 부하를 나타냅니다. 최근 돌기 쪽의 형태의 3 차원 (3D)는 크게 재구성 척추 수동 분석 (3)에 결합 된 특정 소프트웨어를 사용하여 인간의 뇌 피질에서보고되었다.

면역 결합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기술을 형광 현미경에 의해 식별 및 척추 모양 측정 정확한 도구를 나타낸다. 이 방법은 쉽게 배양 신경에 적용 할 수있다. 하우버전, 데이터는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)에서 파생 된 인간의 신경 세포에 척추 성숙과 형태의 분석보고되지 않았다.

이 연구의 목적은 시험 관내에서 배양 된 신경 세포에서 돌기 척추 촬상을 허용하는 프로토콜을 기술 하였다. Imaris 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈과 GFP 표지, 공 초점 현미경 및 3D 분석은 ....

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Protocol

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1. 신경 세포 문화

참고 : 만능 줄기 세포의 섬유 아세포 프로그래밍, 늦게 대뇌 피질의 조상의 지느러미 telencephalon 계통, 유도, 증폭, 및 금융에 대한 헌신 (LCP)는 Boissart 등의 알 4에 설명했다. LCP 유사 세포의 분화 신경 세포는 또한 약간의 수정 Boissart 동부 알 4에 따라 수행 하였다. 또 다른 과정은 뉴런으로 분화 유도 하였다 능성 줄기 세포로의 섬유 모세포의 직접 프로그래밍을 위해 개발되어왔다. 이 피라미드 글루타메이트 성 신경 세포의 선택적 제조 할 수 있으므로,이 프로토콜은 유지되었다.

  1. 폴리 오르니 틴 (DPBS에서 1/6로 희석, 주식 농도 0.01 %) DPBS 세 세척 다음 O / N로 커버 글라스 6 웰 배양 판을 취급합니다. 이어서 유동 후드 적어도 10 시간, 라미닌 (1 mg을 / ㎖, DPBS에서 500 배 희석 스톡 농도)를 추가 .
  2. 플레이트 및 저밀도 NSC를 전달 N2 보충제의 (50,000 세포 / cm 2) 유리 DMEM / F12 이루어진 배지 3 ㎖에 커버 슬립 (500 ㎖), 2- 바이알 6 웰 배양 플레이트 (5 ㎖ 각....

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Results

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본 연구는 IPSC에서 파​​생 된 피라미드 신경 세포의 배양 수상 돌기의 척추 정량 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 척추 인간의 신경 세포에 성숙 표준 설치류 신경의 문화 쪽의 성숙뿐만 아니라에서 생체 내 동물 모델과의 가능한 비교 분석을 할 수 있습니다.

도 1a는 피라미드 피질 뉴런의 생산을 허용 문화의 상이한 단계의 구조를 나타낸다. 이러한 개략적 인 도면은 더 등뼈의 다른 범주 부여 피라미드 신경의 생산의 글로벌 타임 스케일링을 이해하기 위해 제공된다. Reprogrammation 단계는, 그러나,이 연구의 범위 밖이며, 다른 4 설명되었다. 건강한 신경 세포는 65까지 문화에서 유지 될 수있다 -. 70 일도 1b는 이미징 및 등뼈의 3D 정량의 흐름을 보여줍니다.

"ove_content> 그림 2A는 안티 - .......

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Discussion

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피라미드 신경 세포의 형태 학적 특성의 정량화 소프트웨어에 의존했다. 필라멘트 트레이서 인터페이스는 뉴런 및 등뼈의 분할을 위해 사용하고, XT 모듈들은 분석을 위해 사용 하였다.

우리의 기술의 정확성을 분석하기 위해, 우리는 먼저 배양 6, 7 및 인간 뇌 조직 3 쥐 성숙한 피라미드 신경 세포를 사용하여 게시 된 것과 측정 형태 학적 파라미터 (길이, 면적, 및 전체 척추 볼륨 적용)을 비교 하였다. 밀도는 모든 경우에 비교했다. 더 볼륨 데이터는 볼륨 재구성 자신의 프로토콜을 사용하여 베 나비 데스 - Piccione (3)의 연구에서, 조금 우리의 데이타와 비교하여 감소 된 전체 척추 볼륨 반면 (2D 분석을 제작자가 사용하는 소프트웨어로보고되었다) 래트 뉴런에서 설명되지 않았다 선택 등뼈에. 이러한 차이는 사용되는 세포의 지역 원점과 형광 염료에 의해 설명 될 수있는 그들의라벨.

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 파스퇴르 연구소, 베텐쿠르-슐러 재단, 국립 연구 과학 센터, 파리 디드로 대학, 국립 연구소(ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva 자선 재단, Cognacq Jay 재단, Orange 재단 및 Fondamental 재단. LG는 보건부의 학부 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 이 작업의 초기 단계에서 BitPlane, 특히 Georgia Golfis의 도움을 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x), 칼슘, 마그네슘 및 페놀 제외 RedGibco/ Life Technologies14190169
폴리-L-오르니틴 용액 생물 시약Sigma AldrichP4957
마우스 라미닌Dutscher Dominique354232
N2 보충제Gibco/ Life Technologies17502048
B-27 보충제 (비타민 A 제외) (50배)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/너트. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-메르토에탄올Gibco/ Life Technologies31350-010
페니실린-스텝토마이신Gibco/ Life Technologies15140-122
GFP 토끼 혈청 다클론 항체Gibco/ Life TechnologiesA-6455
말 세럼Gibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 염소 안티-래빗 Gibco/ Life TechnologiesA11034
Polyclonal Anti-betaIII tubulin 항체MilliporeAB9354
Coverglass 13mmVWR631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent withDAPI Gibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, 점성 액체시그마 Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
인간 섬유아세포Coriell 세포주 생물저장소GM 4603 및 GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경Zeiss (Germany)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zurich6.4.0 versionFilament Tracer 및 Imaris XT 모듈이 필요합니다.
Huygens 소프트웨어Huygens 소프트웨어, SVI, 네덜란드Pro 버전옵션(디콘볼루션 테스트용)

References

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  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

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