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방법 논문

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

12.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53197

⸱

2015년 10월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

이 논문에서

요약

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

초록

돌기 쪽은 중추 신경계의 흥분성 시냅스의 후 시냅스 구획에 해당하는 작은 돌기입니다. 그들은 수상 돌기를 따라 배포됩니다. 이들의 형태는 신경 세포의 활동에 크게 의존, 그들은 동적입니다. 돌기 쪽은 표면과 시냅스 밀도의 수준에서 글루타메이트 수용체 (AMPA와 NMDA 수용체)을 표현한다. 각각의 척추는 신경 세포가 독립적으로 주 및 지역 활동을 제어 할 수 있습니다. 척추 모폴로지 광범위 생체 내 접근법과 설치류로부터 얻어지는 신경 조직 배양을 모두 사용하여, 뇌 피질의 글루타메이트 피라미드 세포에서 연구되어왔다. 설치류 배양 뉴런과 일차원 정량 분석 1에 도시 된 바와 같이 신경 병리학 적 조건은, 변경된 척추 유도 및 성숙에 관련 될 수있다. 본 연구는 인간의 cortic를 사용하여 척추 형태학의 3D 정량 분석​​을위한 프로토콜을 설명신경줄 기세포 (늦은 피질 전구 세포)로부터 유래 된 알 뉴런. 이러한 세포는 처음에 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 얻었다. 이 프로토콜은 다른 배양 기간에서 척추 모폴로지의 분석이 가능하고, 정신 질환 환자로부터 수득 된 것과 제어 개체로부터 얻은 유도 된 다 능성 줄기 세포 사이와 비교 가능.

서론

대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 돌기 쪽은 설치류, 영장류, 그리고 인간의 뇌에서 이러한 신경 세포 아형의 기저와 혀끝의 수상 돌기를 따라 분포되어 작고 얇은 돌기 있습니다. 그들은 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트이며, 학습과인지 과정의 주요 기능을 표시합니다. 인간 돌기 쪽의 상세한 구조는 기술적으로 전자 현미경 (2)에 의해 연구되었다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요하고 무거운 부하를 나타냅니다. 최근 돌기 쪽의 형태의 3 차원 (3D)는 크게 재구성 척추 수동 분석 (3)에 결합 된 특정 소프트웨어를 사용하여 인간의 뇌 피질에서보고되었다.

면역 결합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기술을 형광 현미경에 의해 식별 및 척추 모양 측정 정확한 도구를 나타낸다. 이 방법은 쉽게 배양 신경에 적용 할 수있다. 하우버전, 데이터는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)에서 파생 된 인간의 신경 세포에 척추 성숙과 형태의 분석보고되지 않았다.

이 연구의 목적은 시험 관내에서 배양 된 신경 세포에서 돌기 척추 촬상을 허용하는 프로토콜을 기술 하였다. Imaris 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈과 GFP 표지, 공 초점 현미경 및 3D 분석은 본 프로토콜에 사용 하였다. II 신경 줄기 세포로부터의 IV (NSC)에 층의 피질 글루타메이트 성 신경 세포를 획득하는 데 필요한 배양 단계는 여기서 설명 간략하다. 인간의 NSC 생산을위한 전체 프로토콜은 이미 다른 곳에서 4 게시되었습니다.

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프로토콜

1. 신경 세포 문화

참고 : 만능 줄기 세포의 섬유 아세포 프로그래밍, 늦게 대뇌 피질의 조상의 지느러미 telencephalon 계통, 유도, 증폭, 및 금융에 대한 헌신 (LCP)는 Boissart 등의 알 4에 설명했다. LCP 유사 세포의 분화 신경 세포는 또한 약간의 수정 Boissart 동부 알 4에 따라 수행 하였다. 또 다른 과정은 뉴런으로 분화 유도 하였다 능성 줄기 세포로의 섬유 모세포의 직접 프로그래밍을 위해 개발되어왔다. 이 피라미드 글루타메이트 성 신경 세포의 선택적 제조 할 수 있으므로,이 프로토콜은 유지되었다.

  1. 폴리 오르니 틴 (DPBS에서 1/6로 희석, 주식 농도 0.01 %) DPBS 세 세척 다음 O / N로 커버 글라스 6 웰 배양 판을 취급합니다. 이어서 유동 후드 적어도 10 시간, 라미닌 (1 mg을 / ㎖, DPBS에서 500 배 희석 스톡 농도)를 추가 .
  2. 플레이트 및 저밀도 NSC를 전달 N2 보충제의 (50,000 세포 / cm 2) 유리 DMEM / F12 이루어진 배지 3 ㎖에 커버 슬립 (500 ㎖), 2- 바이알 6 웰 배양 플레이트 (5 ㎖ 각) B27 보충제의 2 병 (각 10ml), 펜 스트렙토 마이신 10 ㎖ (페니실린 = mL 및 스트렙토 마이신 = 10,000 단위 / ㎖ 10,000 단위 /), 2- 머 캅토 에탄올 1 ㎖ (원액 : 50 밀리미터) 및 라미닌 (1 / 500), 성장 인자없이. 중요한 단계 : 셀 클러스터링을 줄이기 위해 느린 회전 움직임 세포를 첨가하여 조심스럽게이 단계를 수행합니다.
  3. 배지를 제거합니다. 커버 글라스에 부착 된 신경 세포를 유지하고 응집을 방지하기 위해 신선한 라미닌 솔루션의 2 ㎍ / ㎖의를 포함하는 신선한 N2B27 매체를 추가합니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해, 새로운 배지를 첨가하기 전에 남아있는 매체 (200 μL)의 일부를 유지한다. 다르게는, 급속하게 진행하고 전체 부피 (3 ㎖)을 변경.
e_title "> 2. 렌티 바이러스 형질 도입

참고 : GFP 렌티 바이러스 벡터가 친절하게 파스퇴르 연구소에서 박사 우베 Maskos 연구소 (파리)에서 제공하고 게시 된 프로토콜 (5)에 따라 제조 하였다. GFP의 발현은 마우스 포스 포 키나아제 (PGK) 프로모터에 의해 구동된다. 이 연구를 위해 바이러스 역가 400 NG / μL (PBS 1X에서 원액)이었다.

  1. 배양 당 GFP 렌티 바이러스 벡터 웰 (6- 웰 플레이트) 40 ng의 함유 원액 1 μl를 첨가하여 바이러스 입자에 의한 성숙 중 어느 단계에서 인간 IPSC 유래 신경 세포를 형질 도입하고 신선한 배지에서 48 시간 동안 배양한다. 주 :이 프로토콜의 경우, 배양 기간은 척추 구조의 좋은 표시를 허용한다.

3. 면역 형광

주 : 전체 척추 형태의 라벨을 개선하기 위해, 면역 형광 라벨링 투과성이 조건에서 항 GFP 항체를 사용하여 수행 하였다.

  1. RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 커버 슬립에 형질 세포 배양 배지를 제거하고, 수정 후, 1X PBS (10 분마다)을 3 회 반복한다.
  2. PBS에 Immerge coverslips를 0.05 % 트리톤 (100X)와 RT에서 1 시간 동안 10 %의 말 혈청, 1X PBS 후 3 번 세척 하였다.
  3. 1X PBS 100 ㎕를 4 % 말 혈청 및 차 항체 (1 / 1,000) GFP에 대해 발생하고, 각 커버 슬립에 1000 배 희석하여 추가로 보충. 어두운 상자 O에 품어 / N 4 ° C에서, 다음 1X PBS로 3 회 세척한다.
  4. PBS가 트윈 20의 0.5 %로 보충에 알렉사 형석 488 공역 항체 (1/200)을 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 그런 다음 1X PBS에서 3 회 세척하고 형광 현미경을위한 매체를 장착하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다.

4. 수지상 척추 영상

  1. 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 공 촛점 이미징을 수행합니다.
  2. 피라미드 형태의 건강한 뉴런을 선택차 전체 수지상 arborization 및 별도의 실험 조건에 따라 최소 10 뉴런을 정량화. 수상 돌기 당 100 ㎛ - 60 정량화.
  3. 20 μW 주위 샘플 레벨 전형적인 피크 파워와 NA는 대물 1.3 = 40X 오일 및 GFP 여​​기 대 488 nm의 레이저 선을 사용하여 이미지를 획득. 80 nm의 주위에 설정 픽셀 크기가 제대로 돌기 쪽을 샘플링합니다.
    주 : 잡음 덴 드라이트 및 등뼈의 적절한 분할을 손상하지 않는 이미지에 대한 후속 호출을 분석. 상술 한 공간 샘플링 및 전력 설정과 함께, 우리는 3.15 μS의 화소 드웰 시간은 이미지를 구축 할 수있는 충분한 광자를 수집하기에 충분한 것을 관찰했다. 희미한 샘플 화질 2-4 스캔을 평균함으로써 개선 될 수있다. 여러 XY 타일의 인수는 다음 함께 처리하기 전에 스티치해야 관심 영역을 커버하기 위해 필요할 수있다.
  4. 와, Z-스택을 획득, 전체 신경 세포의 볼륨을 샘플링Z는 20 ~ 30 Z 슬라이스를 산출, 150 나노 미터에서 300 나노 미터에 이르기까지 간격.
    참고 :이 설정으로 달성 측면 공간 해상도는 234 나노 미터이며, 축 방향 해상도가 591 ㎚이다. 여기서 선택된 샘플링은 적절하지만 축 해상도가 묘화 될 수있는 쪽의 최소 크기보다 큰 경우로, 분석 돌기로부터 측 방향으로 연장되는 쪽을 선호.

돌기 쪽 5. 3D 정량화

주 : 다음 섹션 구체적 분석 Imaris 소프트웨어의 사용을 설명한다. 다른 구현은 유사한 결과를 제공 할 수 NeuronStudio 15 MetaMorph로부터 8 포함한 존재한다.

다음 키 설정을 사용 :

  1. 전처리 단계로서, 소프트웨어에 의해 제공되는 화상 처리 시설을 통해 가우시안 필터링을 사용한다. 이미지 처리> Smoo 통해 가우시안 필터링을 수행일> 가우시안 필터. XY의 픽셀 크기와 동일하게 필터 폭을 설정한다.
  2. 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈을 이용하여, 덴 드라이트의 반자동 추적을 수행한다.
    1. 우선, 소프트웨어의 슬라이스 탭 거리 도구를 사용하여, 덴 드라이트 직경 견적.
    2. 능가 탭에서 필라멘트 도구를 클릭합니다. 더 나은 안정성,이 프로토콜은 반 자동화 된 추적에 의존; 건너 뛰기 자동 생성을 클릭합니다. 모듈 인터페이스는 이제 그리기 탭을 보이고있다. 여기에있어서, 덴 드라이트 형 등 및 입력 예상 수지상 AutoPath 지름을 선택한다.
    3. 상자에 커서를 회전, 포인터의 선택 모드를 사용합니다. 수상 돌기 시작 지점에 Shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 주 : 소프트웨어가 초기 계산을 수행한다.
    4. 수상 돌기를 따라 포인터를 이동합니다. 시작점에서 (대표파란색 영역으로서 ED), 대부분 수지상 경로를 나타내는 황색 라인이 도시되어있다. 수상 돌기의 엔드 포인트에서 Shift 키를 왼쪽 클릭합니다.
  3. 자동화 된 쪽이 분할을 수행합니다. 주 : 추적 수지상 등뼈가 모듈 인터페이스에 의해 자동으로 발견된다.
    1. 모듈 인터페이스에서 작성 탭을 클릭합니다. 다시 드롭 목록에서 덴 드라이트의 직경을 다시 선택하고 보관할 데이터 상자를 선택합니다. 그런 다음 다시 클릭합니다.
    2. 분할 된 볼륨이 덴 드라이트 실제 용적에 대응되도록 임계 값을 설정한다. 알고리즘으로,. 거리지도에서 최단 거리를 선택하고 다음 버튼을 클릭합니다.
    3. 가장 작은 척추 헤드 직경 및 최대 길이를 결정, 다시 소프트웨어의 슬라이스 탭의 거리 도구를 사용하여, 다시 능가 탭에 와서 매개 변수를 입력합니다. F또는이 프로토콜은 약 200 값 - 최소 직경 300 nm의 최대 길이 4 μm의 좋은 출발점이다. 허용 지점 쪽이 상자를 선택하지 마십시오. 다음 버튼을 클릭합니다.
    4. 등뼈를 나타내는 파란색 점은 실제 척추 머리에 지역화 있도록 종자 포인트 임계 값을 조정합니다. 다음 버튼을 클릭합니다. 참고 : 핵심 계산은 현재 수행되고 길어질 수 있습니다.
  4. 모듈 인터페이스의 도구 탭으로 이동하여 척추를 분류. 분류 등뼈를 클릭합니다. 메시지가 사용자 인터페이스에서 다음과 같이 자신의 형태에 의해 정의 된 네 개의 클래스가 있다는 것을 확인하십시오 스터 : 길이 <1 μm의; 버섯 : 길이 (척추)> 3, 최대 폭 (머리)> 폭 (목) × 2 의미; 긴 얇은 : 평균 폭 (머리) ≥ 평균 폭 (목) Filopodia 같은 : 길이 ≤ 4 μm의 (NO 머리).
    참고 : 미주리dule 인터페이스 분류의 결과를 포함하는 4 개의 필라멘트 새로운 객체를 생성한다.
  5. 수출 통계 데이터 :이 네 객체 인터페이스 중 하나에서, 통계 탭으로 이동합니다.
    버튼을 파일로 내보내기 모든 통계를 클릭합니다.
    참고 : 다른 통계 값이 수상 돌기 위해 내보낼 수 있습니다 (.. 예를 들면, 길이, 면적, 등등 직경, 분기 깊이, 분기 각도, 볼륨을 의미), 그리고 척추 (예 :, 진 직도, 첨부 파일, 길이와 별개의 볼륨의 영역 척추 부품, 척추 직경, 밀도, 등.)

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결과

본 연구는 IPSC에서 파​​생 된 피라미드 신경 세포의 배양 수상 돌기의 척추 정량 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 척추 인간의 신경 세포에 성숙 표준 설치류 신경의 문화 쪽의 성숙뿐만 아니라에서 생체 내 동물 모델과의 가능한 비교 분석을 할 수 있습니다.

도 1a는 피라미드 피질 뉴런의 생산을 허용 문화의 상이한 단계의 구조를 나타낸다. 이러한 개략적 인 도면은 더 등뼈의 다른 범주 부여 피라미드 신경의 생산의 글로벌 타임 스케일링을 이해하기 위해 제공된다. Reprogrammation 단계는, 그러나,이 연구의 범위 밖이며, 다른 4 설명되었다. 건강한 신경 세포는 65까지 문화에서 유지 될 수있다 -. 70 일도 1b는 이미징 및 등뼈의 3D 정량의 흐름을 보여줍니다.

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토론

피라미드 신경 세포의 형태 학적 특성의 정량화 소프트웨어에 의존했다. 필라멘트 트레이서 인터페이스는 뉴런 및 등뼈의 분할을 위해 사용하고, XT 모듈들은 분석을 위해 사용 하였다.

우리의 기술의 정확성을 분석하기 위해, 우리는 먼저 배양 6, 7 및 인간 뇌 조직 3 쥐 성숙한 피라미드 신경 세포를 사용하여 게시 된 것과 측정 형태 학적 파라미터 (길이, 면적, 및 전체 척추 볼륨 적용)을 비교 하였다. 밀도는 모든 경우에 비교했다. 더 볼륨 데이터는 볼륨 재구성 자신의 프로토콜을 사용하여 베 나비 데스 - Piccione (3)의 연구에서, 조금 우리의 데이타와 비교하여 감소 된 전체 척추 볼륨 반면 (2D 분석을 제작자가 사용하는 소프트웨어로보고되었다) 래트 뉴런에서 설명되지 않았다 선택 등뼈에. 이러한 차이는 사용되는 세포의 지역 원점과 형광 염료에 의해 설명 될 수있는 그들의라벨.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 파스퇴르 연구소, 베텐쿠르-슐러 재단, 국립 연구 과학 센터, 파리 디드로 대학, 국립 연구소(ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva 자선 재단, Cognacq Jay 재단, Orange 재단 및 Fondamental 재단. LG는 보건부의 학부 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 이 작업의 초기 단계에서 BitPlane, 특히 Georgia Golfis의 도움을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
D-PBS (1x), 칼슘, 마그네슘 및 페놀 제외 RedGibco/ Life Technologies14190169
폴리-L-오르니틴 용액 생물 시약Sigma AldrichP4957
마우스 라미닌Dutscher Dominique354232
N2 보충제Gibco/ Life Technologies17502048
B-27 보충제 (비타민 A 제외) (50배)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/너트. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-메르토에탄올Gibco/ Life Technologies31350-010
페니실린-스텝토마이신Gibco/ Life Technologies15140-122
GFP 토끼 혈청 다클론 항체Gibco/ Life TechnologiesA-6455
말 세럼Gibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 염소 안티-래빗 Gibco/ Life TechnologiesA11034
Polyclonal Anti-betaIII tubulin 항체MilliporeAB9354
Coverglass 13mmVWR631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent withDAPI Gibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, 점성 액체시그마 Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
인간 섬유아세포Coriell 세포주 생물저장소GM 4603 및 GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경Zeiss (Germany)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zurich6.4.0 versionFilament Tracer 및 Imaris XT 모듈이 필요합니다.
Huygens 소프트웨어Huygens 소프트웨어, SVI, 네덜란드Pro 버전옵션(디콘볼루션 테스트용)

참고문헌

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  11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
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  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).

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