사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

요약

소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다. 분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.

초록

소포체 (ER)의 농도가 약 세포질 수준보다 5,000 배와, 세포 내 칼슘의 높은 수준을 포함​​하고 있습니다. ER 칼슘 통해 엄격한 제어는 단백질 접힘, 수정 및 인신 매매에 대한 필수적입니다. ER 칼슘에 섭동이 펼쳐진 단백질 응답, 3 구 ER 스트레스 반응기구의 활성화를 초래하고, 다양한 질병의 병인에 기여할 수있다. 질병의 발병과 진행하는 동안 응급실 칼슘 변경을 모니터링하는 기능은 실제로는 원칙적으로 중요한, 아직 도전이다. 칼슘 의존 형광 염료와 단백질과 같은 모니터링 응급실 칼슘 현재 가능한 방법은, 그러나 이러한 도구는 생체 내 연구에 적합하지 않은 세포에서 ER 칼슘 역학에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 우리 연구소는 Gaussia 루시 페라 제의 카르복시 말단에 수정에 대한 응답으로 기자의 분비를 부여하는 것을 보여 주었다ER 칼슘 고갈. 시험 관내 및 생체 내 적용에서 루시페라아제 기초 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMP)를 사용하는 방법이 설명된다. 이 동영상은 응급실 칼슘의 종 모니터링 간 주사, GLuc-SERCaMP, 혈액 수집 및 처리의 약리 조작, 분석 매개 변수를 강조한다.

서론

소포체 (ER) ^{1 시그널링} 단백질 접힘, 분비 단백질, 지질 항상성, 세포 내 및 세포를 포함한 많은 용량으로 기능한다. 일반 응급실 ​​기능의 핵심은 ~ 5,000 시간에 내강 칼슘 농도 세포질 ^2-4에서 발견을 유지하고있다. 이 에너지 집약적 인 공정은 사코 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA), ER에 칼슘 이온을 이동시키는 펌프에 의해 조절된다. 응급실에서 칼슘의 유출은 주로 ryanodine (RyR)과 이노시톨 인산염 (IP3R) 수용체에 의해 매개된다. 많은 ER 프로세스 칼슘에 따라 달라 지므로, 저장을 방해하는 것은 ER 스트레스 결국 세포 사멸을 초래할 수있다.

ER 칼슘 조절 장애는, 심근 병증, 당뇨 알츠하이머 질환에서 관찰되었으며, 파킨슨 ^5. 이들 질환의 점진적 특성으로 인해, 그것은 인과 재 묘사하는 도전되었습니다ER 칼슘 저장소의 병인과 변화 사이 lationship. 기술의 숫자는 염료 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)를 포함하여 ER 칼슘 역학, 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. ^칼슘 이온에 결합 될 때 형광 증가 선호도가 낮은 칼슘 염료, 칼슘 ⁶ 고농도 세포 내 구획을 조사하는 세포에로드 될 수있다. 이러한 D1ER 포수로 GECIs는, 세포 내 현지화 ^7-9의보다 정확한 제어와 칼슘 변동 모니터링 할 수 있습니다. 최근 GECIs의 다른 클래스라는 칼슘 측정 소기관 - 포획 단백질 지표 (CEPIA)가 ^10을 설명 하였다. 유전학과 결합 세 번째 방법 작은 분자의 화학입니다 대상 - 에스 테라 염료 로딩 에스테르 계 칼슘 염료 ¹¹ (ER을 대상으로) 유전자 인코딩 된 카르 복실를 활용 (TED)는.

afor 동안ementioned 방법은 형광의 급성 측정을 통해 ER 칼슘 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 고유의 강점과 약점을 가지고 있습니다. 그러나 이들은 종종 질병 진행을 조사하는 데 필요한 길이의 연구에 최적이 아니다. 장시간에 걸쳐 칼슘 역학을 모니터링하는 방법을 고안하기위한 목적으로, 우리는 식별되고 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMPs) ^(12)을 만드는 단백질 변형을 개발 하였다.

SERCaMP 반복해서 ER 칼슘 저장소를 심문하는 최소 침습적 방법을 제공함으로써, 다른 방법론과 관련된 몇 가지 제한을 우회. 우리는 이전에 카복시 말단 펩티드 ASARTDL (알라닌 - 알라닌 - 세린 - 트레오닌 아르기닌 아스파라긴산 류신)는 ER 보존을 촉진하기에 충분한 것으로 증명; 그러나, ER 칼슘의 감소를 일으킬 조건 하에서, 단백질 서열은 더이상의 ER localizatio을 유지할 수 없다n 및 단백질 ¹³ 분비된다. SERCaMP 기술의 기초는 분비 된 단백질의 카르복시 말단 분비 따라서 ER 칼슘 조절 곤란 ^(12)의 견고한 리포터를 생성 ER 칼슘 고갈에 의해 트리거되도록 (예 Gaussia 루시페라아제 또는 GLuc)에 ASARTDL의 부속물이다. 형질 전환 방법을 통해 GLuc-SERCaMP의 발현은 ER 칼슘 항상성의 지표로 GLuc 활성의 변화를 분석 할 수있는 세포 배양 배지 및 혈장을 포함한 생물학적 유체를 가능하게한다. 이 방법은 시험 관내 및 생체 내 ER 칼슘 저장소의 누진 변화의 길이 연구 응용을 갖는다. 다음 프로토콜 ER 칼슘 항상성 공부 GLuc 기반 SERCaMP을 사용한 일반적인 윤곽으로 기록되지만, 프로토콜은 다른 리포터 SERCaMPs 대한 지침을 제공 할 수있다.

프로토콜

시험 관내 분석에서 1 : 안정 SH-SY5Y 세포주에서 감지 SERCaMP 출시

1. 플레이트 SH-SY5Y-GLuc - ASARTDL (SERCaMP) 조직 문화는 표면적 cm ² 당 150,000 세포에서 판을 처리 하였다. 96 웰 플레이트, 예를 들면, 세포를 웰 당 50,000 (도 1a)을 시드. DMEM (높은 포도당, 루타, 피루브산) + 10 % 소 성장 혈청 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 SH-SY5Y 세포를 성장.
   1. 15 배 (그림 1B)까지의 통로 세포. 높은 통로 수는 테스트되지 않았습니다.
   2. 5.5 % CO _2, 37 ℃에서 가습 배양기에 세포를 반환하고 밤새 품어.
2. 실험적 치료 (들) 전에 잘 불투명 배양 상등액 5 μl를 전송하여 각 기준 샘플 수집은 96 웰 플레이트 성벽. 수집하기 전에 부드럽게 모든면에 접시를 누르고 그라데이션 효과를 방지하기 위해 소용돌이 친다. 접착제의와 불투명 플레이트를 밀봉효소 분석의 시간까지 4 ° C에서 일링 시트 및 저장.
   주 : 분비 GLuc-SERCaMP은 세포 배양 배지에서 매우 안정적이다. 우리는 이전에 GLuc 활동의 약 5-10 %가 (SH-SY5Y 세포에 배양) 37 ° C ^(12)에서 72 시간 배양 한 후 손실 된 보도했다.
3. 응급실 칼슘 고갈을 검토 할 필요에 따라 (예를 들면, 환경, 약물, 유전자 조작) 세포를 치료. 빠르게 대기 CO _2에서 발생 pH 변화로 (제어 인큐베이터의 외부) 주위 환경에 오래 노출을 피하십시오. 장기간 조작이 요구되는 경우에는, pH를 안정화시키기 위해 ^14, 20 밀리미터로 배양 배지에 HEPES를 추가한다. 배지 ¹⁵ HEPES를 사용하는 경우 빛에 노출을 피하십시오.
   1. 긍정적 인 제어 : SH-SY5Y 세포에서 실험 4-6 시간 동안 100 나노 쌥시 가르 긴 (Tg)가 50 μm의 cyclopiazonic 산 (CPA)와 세포 치료. 다른 세포주에서 최대 반응은 이상 배양 또는 다른 concen 필요할 수 있습니다화합물의 trations.
   2. 음성 대조군 : 부모 SH-SY5Y 세포에서 배양 배지를 수집. 우리의 경험에 의하면,이 분석의 배경 발광이 안정적 SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP 기저 세포로부터 분비의 0.05 % 미만이다.
4. 단계 1.2에 설명 된대로, 원하는 시점들에서 수집하고 에어컨 매체의 저장 5 μL 샘플.
5. 제 5 절에 설명 된대로 매체에 효소 활성을 평가합니다.
6. 면역 또는 발광 분석에 의한 세포 내 GLuc을 검사합니다.
   1. 50 mM 트리스 (PH 7.4), 150 mM의 염화나트륨, 0.25 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 mM의 EDTA, 1 % NP40을 함유하는 개질 된 RIPA 버퍼를 Lyse 세포, 및 프로테아제 억제제 : 면역 용. 0.20 μm의 PVDF 막에 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 및 전송에 별도. (: 2,000 희석 1) 하룻밤 4 ℃에서 GLuc 항체로 막을 품어. 선택의 검출 시약에 대한 사용자 정의 된 프로토콜에 따라 차 항체 배양 및 막 세척을 수행합니다.
   2. 용발광 분석 (그림 2) : 얼음에서 다음 단계를 수행하십시오
      1. 조직 문화 판의 우물에서 모든 미디어를 제거하고 차가운 PBS 200 μL 씻어.
      2. 각 웰에 50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을, 1 % NP40를 포함하는 용해 버퍼 및 단백질 분해 효소 억제제의 75 μl를 추가합니다.
      3. 20 분 동안 4 ℃에서 진탕 기 (120 RPM)에 판을 돌립니다.
      4. 부드럽게하고, 멀티 채널 피펫을 사용하여 기포를 피 파쇄물의 아래 피펫. 불투명 한 판에 해물의 5 μl를 전송하고 5 절에 설명 된대로 발광을 평가합니다.

시험 관내 분석 2. : SERCaMP와 불멸화 된 세포의 과도 형질

참고 : 우리는 일시적인 형질 전환 절차 세포 스트레스를 유도하고 이후 GLuc-SERCaMP 응답을 무디게 할 수 있음을 발견했다. 다음의 방법은 형질 전환 EFF을 최소화하기 위해 개발 된 SH-SY5Y 세포에서 ECTS. 다른 세포주 (트랜 스펙 션 시약의 선택을 포함)이 절차의 최적화가 요구 될 수있다. 가능하면, 그것은 각각 섹션 1과 3에 설명 된 안정적인 세포주 또는 바이러스 성 전달 방법을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 4 × 10 ⁶ 세포에서 100mm 접시에 플레이트 SH-SY5Y 세포. 이 요리는 형질 전환 절차에 따라 약 300 우물 (96 웰 플레이트 형식) 씨에게 다시하기에 충분합니다.
2. Xfect 플라스미드 DNA 20 μg의 (인코딩 GLuc-SERCaMP)를 사용하여 시약 및 시약 Xfect 6 μL와 형질 세포. 크거나 작은 문화 선박 따라 스케일 DNA와 Xfect 시약.
3. 48 시간 동안 인큐베이터 세포를 돌려줍니다.
4. 세포를 Trypsinize 잘 60,000 세포에서 96 웰 플레이트에 시드. 제 1 절에 설명 된 다음 단계를 수행합니다.

시험 관내 분석 3. :의 바이러스 성 벡터 중재 식 GLuc-SERCaMP

십t "> 참고 : 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 포장 ⁽¹⁶⁾ 정제 ^(12)와 렌티 바이러스 생산 ^(13)는 이전에보고 된 바있다.

1. 역가 GLuc-SERCaMP AAV 다음 프라이머 및 프로브를 사용하여 : 정방향 프라이머, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; 역방향 프라이머, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; 프로브 (5'-6-FAM / 3'- 라벨링 BHQ-1)에 대한 정량적 PCR, 5'- TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 '.
   1. GLuc을 함유하는 플라스미드를 선형화하고 스핀 컬럼 (예 Machery-Nagel의 뉴 클레오 젤 및 정리 PCR)을 사용하여 DNA를 정제하여 표준 곡선을 준비한다. 질량 사다리와 함께 아가 로스 젤에서 분리하여 DNA를 정량. PBS에서 10 FG / ㎖에 ml의 100 페이지 /에서 DNA 1:10 희석을 준비합니다. 플라스미드의 분자량에 기초하여 각각의 농도에서 GLuc 플라스미드 DNA의 카피 / ㎖을 계산한다.
   2. PBS에 AAV 주식 희석 (적절한 희석에 의존한다바이러스 제제의 매개 변수와) 경험적으로 결정.
   3. 94 ° C 20 초 × 95 ° C × 5 분, 41 싸이클 60 ℃ × 1 분 : 다음과 같은 조건을 이용하여 실시간 PCR 시스템에서의 PCR 반응을 실행. mL의 표준 곡선을 사용하여 / 사본을 계산합니다.
2. P24 렌티-X 빠른 역가 키트 역가의 렌티 바이러스. 얼음 렌티 바이러스 분취 량을 해동 및 SH-SY5Y 매체 P24 조절 단백질을 희석.
   1. 이 표준 곡선 (20,000 또는 1 : 100,000 예 1)에 떨어질 것 같은 것을 렌티 바이러스를 희석. 필요한 희석 배수는 렌티 바이러스 제제 파라미터들에 따라 달라질 것이고, 경험적으로 결정되어야한다. 이후의 모든 단계에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
3. 96 웰 플레이트에 플레이트 세포. SH-SY5Y 세포의 경우, 제 1 항에 명시된 도금 절차를 따라야 할 수 있습니다. 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런은 세포를 분리하고 적절하게 코팅 된 플레이트를에 접종해야S는 이전 ^{16 설명했다.} 1X B27 500 μM의 L- 글루타민 보충로 Neurobasal 매체에 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런을 유지한다. 매일 절반 매체 교환을 수행합니다.
4. 바이러스와 세포를 형질 도입. 루시퍼 Gaussia 강력한 신호를 제공로 바이러스 전달의 목표는, 낮은 수준의 발현을 달성하는 것이다.
   1. AAV 전달 SH-SY5Y 세포 : 도금 다음날 형질 도입. AAV 희석 버퍼 (PBS + 후 0.5mM의 MgCl ₂₎ 6.0 × 10 ⁷ VG / μL에 AAV를 희석. (대략 6,000의 MOI 3.0 × 10 ⁸ VG) 96 웰 플레이트 (그림 3A)의 웰 당 희석 AAV의 5 μl를 추가합니다. 바이러스 성 벡터 폐기물을 불 활성화 10 % 표백제를 사용합니다.
   2. 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런의 AAV 전달은 : 도금 후 6-8일 형질 도입. AAV 희석 버퍼에 4.0 × 10 ⁶ VG / μL에 AAV를 희석. 희석 AAV의 5 μl를 추가 (2.0 × 10 ⁷ VG, 관성 모멘트를 약 350)의 잘 당96 웰 플레이트 (그림 3B). 최적 MOI가 다른 세포 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 바이러스 성 벡터 폐기물을 불 활성화 10 % 표백제를 사용합니다.
   3. SH-SY5Y 세포의 렌티 바이러스 형질 도입은 : 도금 다음날 형질 도입. 행크의 균형 잡힌 염 용액 (농도 titering 키트를 사용하여 측정) 20 PG / μL의 P24에 렌티 바이러스를 희석. 100 μL 볼륨을 포함하는 96 웰 플레이트 (1,250,000 렌티 바이러스 입자에 해당하는 P24의 100 페이지, 또는 ~ 1,250 IFUs)도 당 희석 바이러스의 5μL를 추가합니다. 큰 포맷 따라 확장 할 수 있습니다. 바이러스 성 폐기물을 비활성화하는 10 % 표백제를 사용합니다.
5. 매체의 전처리 샘플을 수집하고 실험적인 치료 48 시간 (SH-SY5Y) 또는 전달 후 5-7일 (쥐 주 대뇌 피질의 신경 세포)를 시작합니다.

생체 SERCaMP 분석 4.

주 : 동물의 절차는 교육 기관을 통해 적절한 승인을 받아야하십시오 수행하기 전에. 모든생존 수술은 적절한 마취와 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 아래에 설명 된 모든 절차 승인 및 NIH ACUC 지침을 준수하고 있습니다.

1. 오토 클레이브 수술 도구 수술의 시작에 앞서 (121 ° C, 30 분 살균, 20 분 건조 시간). 즉시 모든 절차 전에 고압 증기 멸균에 다음 초음파의 모든 악기를 청소합니다. 생존 수술시 무균 조건을 유지한다. 여러 동물을 필요로하는 수술의 경우, 70 % 알코올, 초음파 처리 및 비드 쥐 사이에 소독과 수술 도구를 닦으십시오. 필요한 악기에 대한 자료 목록을 참조하십시오.
2. 수술을 위해 쥐를 준비합니다. 여기에서 우리는 남성의 Sprague-Dawley 계 (180-200g)를 사용합니다.
   1. 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (/ kg 80 mg)을 복강 내 주사 한 다음 3 분 (4-5 %의 아이소 플루 란 1000 CC / 분으로 전달)을 위해 가스를 사용하여 이소 플루 란 마취 래트. 건조로부터 각막을 보호하기 위해 안과 연고를 적용합니다. (B)꼬리 또는 발 핀치 다음 철수 반사의 부족에 의해 입증 된 바와 같이 쥐 한 번 egin 수술은​​ 깊이 마취입니다.
   2. 약간 중반 복부에 갈비뼈 (낮은 흉부 지역) 아래 복부의 영역을 면도. 외과 영역 70 % 알코올과 Betadine 스크럽 교대 세 번, 스크럽. 무균 수술 드레이프와 무균 수술 영역에 앙와위에서 쥐를 놓습니다.
3. 7.6 × 10 ⁹ VG / ㎖ (최종 농도)에 AAV-GLuc-SERCaMP 희석. 튜브를 반전하여 잘 섞는다.
   참고 : 바이러스 농도 범위 (그림 4) 다를 수 있습니다.
   1. 피펫 멸균 접시에 희석 AAV의 105 μL. 주사기로 바이러스를 수집하기 위해 30 게이지 바늘을 사용합니다.
4. AAV-GLuc-SERCaMP을 간을 노출하고 주입하는 수술을 수행합니다.
   1. 이전 복부에 절개를 만들기 위해, 절개 영역에 0.25 % bupivacaine을 적용 할 수 있습니다. 메스를 사용하면, 갈비뼈 아래에 수평 절개 (AP합니다근접하여 2 ~ 3 센티미터). 하피에서 결합 조직을 분리 해부 무딘.
   2. 간의 오른쪽 중간 엽을 노출, 복부 근육을 잘라.
      주 : 추가 로브는 최종 애플리케이션을 기반으로 주입 될 수있다.
   3. 수술 현미경으로 동물을 놓고 시야에서 간 오른쪽 중간 엽을 얻기 위해 조정합니다. 중간 엽의 실질에 바이러스를 주입; 3 별도의 사이트, 사이트 당 약 33 μL.
      참고 : 전체 주입량의 배달을 보장하기 위해 주입에 따라 5 ~ 10 초 동안 조직에 바늘을 둡니다.
   4. 개별적으로 복부 근육과 피부를 봉합하고면 팁 어플리케이터를 사용하여 Neosporin를 추가합니다. 의식을 회복하고 쥐가 수직 위치를 유지 할 수 있습니다 때까지 복구 실에서 쥐를 놓습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 쥐 (들) 무인 두지 마십시오. 하우스는 단독으로 절개가 치유 될 때까지 봉합 (7-14 일간) 제거되었습니다.
      참고 : NIH 수술 후 지침에 따라로서, 수술 기록을 유지한다. 절차, 날짜, 실험 식별자, 체중, 및 수술의 일와 케이지 카드 주석. 통증 / 조난, 대변 생산 활동, 음식 및 물 소비를 모니터링 3 일 후 - 수술 기록하여야한다. 우리가 일반적으로 수술 후 통증이나 고통의 징후를 관찰하지는 않지만 수술 후 통증은 식수 (450 밀리그램 / 100 CC)에 아세트 아미노펜을 추가하여 제공됩니다.
5. 4~7일 주사 후 꼬리 혈액 수집을 시작합니다. 라벨 및 사전 무게에 의해 혈액 수집 튜브를 준비합니다. 각각의 튜브에 50 μL 헤파린 (1,000 U / ㎖)를 추가합니다.
6. (1,000 CC / min으로 전달 4~5% 아이소 플루 란) 3 분 이소 플루 란 마취 실에 넣어 쥐. (500 CC / min으로 전달 2~3% 아이소 플루 란) 코 콘에서 챔버와 장소에서 쥐를 제거합니다. 꼬리 파이를 다음과 철수 반사의 부족에 의해 입증 된 바와 같이 혈액 수집은 쥐가 깊이 마취되면 시작할 수 있습니다NCH​​.
   1. 멸균 가위 꼬리 (1~2mm)의 절단 팁을 사용하고 프리 필드 헤파린 튜브에 드롭 현명한 피를 수집합니다. 헤파린 비 (> 100 ㎕의 혈액 / 50 μL 헤파린)을 혈액 1 : 볼륨 (2)보다 클 때까지 혈액을 수집한다. 채혈 볼륨은 실험 설계에 기초하여 조절 될 수있다. 출혈을 멈추게하기 위해 꼬리에 지혈제 가루를 적용 할 젖은면 주걱을 사용합니다.
   2. 4 ℃에서 보관 혈액 튜브는 이후의 샘플을 수집합니다. 컬렉션 사이에 소독 에탄올 패드​​와 구슬과 가위를 닦습니다.
   3. 수집 튜브의 무게를 측정하고 2 얻기 위해 헤파린 조정 : 1의 비율 (혈액 : 헤파린). 이 단계는 각각의 샘플 (표 1)에 헤파린의 양을 표준화한다.
   4. 원심 분리기 튜브 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에. 루시 페라 제 분석 (섹션 5)의 시간이 될 때까지 -80 ° C에서 신선한 튜브 및 저장소에 뜨는 (플라즈마)를 전송합니다.
      참고 : 72 시간까지 이전 효소 분석에 4 ° C에서 샘플의 보관 M이발광 (그림 5A)에 inimal 효과. 플라즈마 샘플의 3까지 동결 해동 사이클은 발광에 영향 (그림 5B)가 없습니다.
7. 쌥시 가르 긴 관리 (양성 대조군) :
   1. 2.5 mg / ml의 최종 농도로 희석 한 에탄올 쌥시 가르 긴 준비한다. 하복부에 1 ㎎ / ㎏ IP에서 쌥시 가르 긴 주입한다.
      참고 : 쌥시 가르 긴이 트롬빈에 의한 혈소판 응집 ^(17)을 증가시키고 더 어려운 꼬리에서 채혈을 할 수 있습니다.
8. Gaussia 루시 페라 제 분석 :
   1. 얼음에 혈장 샘플을 해동.
      종 방향 연구, 해동 및 (기판의 하나의 준비를 사용하여) 같은 날에 모든 평가시기 샘플에 대한 발광 분석을 수행합니다.
   2. 불투명 한 벽 플레이트로 전송 플라즈마의 10 μl를하고 섹션의 각 혈장 샘플 5. 실행 3-4 기술 복제를 설명한 바와 같이 효소 활성을 측정합니다.
9. Euthanasi
   주 : SERCaMP 기술의 장점은 모니터 ER 칼슘 종 할 수있는 능력이다. 실험 매개 변수와 엔드 포인트 분석에 따라, 동물 엔드 포인트 분석에 적절한 기관 ACUC 지침에 따라 조치에 의해 안락사되어야한다.

5. 발광 분석

1. 20 mM의 메탄올 (3 ㎖, 10 N HCl을 30 μL)을 산성화 메탄올 화합물을 희석하여 코 엘렌 테라 진 (CTZ) 스톡 용액을 준비한다. -80 ° C에서 단일 사용 씩 저장을 준비합니다.
2. 분석의 날에 작업 기판을 준비합니다.
   1. 체외 분석의 경우, 예를 들어, PBS에 8 μm의에 코 엘렌 테라 희석 PBS의 25 ml의 20 mM의 CTZ 주식의 10 μl를 추가합니다 (그림 6A, B).
   2. 생체 내 분석을 위해, PBS 100 μM, 500 mM의 아스코르브 산, 5 mM의 NaCl을 엘렌 테라로 희석.
3. 적어도 30 분 동안 준비 CTZ을 품어분석을 시작하기 전에 실온에서 첨가 하였다.
   참고 : 준비 후 처음 30 분 동안 빠른 기판 붕괴의보고 있기 때문에이 단계는 종종 Gaussia 루시 페라 제 분석에 포함되어 있습니다. 우리는 우리의 시스템 (그림 6C)에서이 효과를 관찰하지 않은; 우리가 분석에 부정적인 영향을 발견했다 그러나, 우리는 종종 배양 단계를 포함한다.
4. 모니터링 생물 발광 할 수있는 및 기판 인젝터가 장착되어 플레이트 리더를 사용합니다. 기판과 프라임 라인.
   참고 : 라인을 통해 초기 기판이 저하하는 경향이 될 수 있습니다. 초기 샘플 인위적으로 낮게 측정을 방지하기 위해 실험 샘플을 측정하기 전에 (독자에 빈 접시를로드) 20 ~ 30 빈 우물을 주입.
5. 잘으로 기판의 100 μl를 주입 5 초 동안 중간 속도를 흔들어 발광을 측정한다. Biotek 시너지 II 플레이트 리더를 들면, (0.5 초 이상 (체외 샘플)과 5 초 발광 통합판독 단계의 생체 시료). 이상적인 분석 성능 플레이트 리더 매개 변수를 최적화 할 수 있습니다.
   참고 : (다른 루시페라아제 관찰 반응 속도를 빛에 비해) 빠른 신호 감쇠와 Gaussia 루시 페라 전시 플래시 속도론. GLuc의 플래시 동력학은 샘플에 걸쳐 배지 조성물에 대한 제어의 중요성을 강조하는, 세포 배양 배지 (도 7A)에 혈청에 의해 영향을 받는다. 때문에 기판 (플래시 역학)를 추가 한 후 발광의 급속한 붕괴, 주입 한 모든 샘플에 대한 균일해야합니다 단계를 읽어 사이의 시간에. 플레이트 리더는 (우리가 5 초 흔들림 단계를 사용 예), 그리고 잘 읽어 고정 대기 시간을 잘으로 기판을 주입하는 설정해야합니다. 기판은 동시에 모든 웰에 첨가 할 수없는 읽기 전에 전체 판에 기판을 추가하는 것은 상당한 도전을 포즈. 주사기를 사용할 수없는 경우, 문제가 부분적으로 기판 사이 ADDI 10 분 동안 플레이트를 항온 처리에 의해 회피 될 수있다기 및 측정 (도 7b) (따라서 감쇠 곡선의 가파른 부분을 피하고).
6. , 주사를 반복 대기 시간, 잘 접시에 각 단계를 참조하십시오.

결과

GLuc-SERCaMP 방법은 세포 외 체액을 샘플링하여 응급실 칼슘 항상성의 평가를 할 수 있습니다. 복수의 컨트롤이 결과 해석을 향상 실험 설계에 포함될 수있다. 우선, (C 말단 ASARTDL 또는 "GLuc 아니 태그"없이 예 GLuc) 구성 적 분비 리포터의 사용은 분비 경로 (글로벌 셀룰러 분비) 및 유전자 발현에 실험적 치료의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, GLuc-SERCaMP 및 GLuc 아니 태그 양의 세포 외 농도 증가는 모호한 결과로 간주된다. 또한, GLuc 아니 태그 응답의 대응 부족으로 GLuc - SERCaMP 분비의 증가는 응급실 칼슘 의존 이벤트 (그림 8)를 지원합니다. 용해가 필요로 이것은 하나의 평가시기에 한정되어 있지만 응급실 칼슘 고갈에 응답 GLuc - SERCaMP의 분비 또한, 세포 내 GLuc를 측정하여 평가 될 수있다. 지능 (각각의 웰에 대해 계산) 세포의 비율 (도 ...

토론

이 프로토콜은 시험관을 하이라이트 GLuc-SERCaMP 생체 유틸리티 ER 칼슘 고갈를 모니터링. SERCaMP를 생성하는 단백질 수정 다른 기자 단백질 ^(12)에 일반화 보이지만, 우리는 다른 루시페라아제 ^(18)에 비해 견고한 (200 ~ 배 이상) 생물 발광에 대한 Gaussia 루시 페라 제를 선택했다. 우리는 일차 래트 피질 뉴런, SH-SY5Y 세포 및 쥐의 간으로 전달 GLuc-SERCaMP 바이러스의 100 배의 용량 범위에 걸쳐 검출 쌥시 가르 긴 유도 GLuc-SERCaMP 릴리스 보여 (도 3 및도 4). 우리는 이전에 GLuc-ASARTDL를 안정적으로 발현하는 형질 전환 된 세포주의 생성을 설명하고 5 × ¹⁰⁴ 표지 된 세포 집단에서와 같이 소수의 20 ¹² 세포 ^반응을 유도 쌥시 가르 긴를보고 할 수 있음을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 ml 튜브	Fisher	02-682-550
10% NP-40 용액	세포 내 GLuc 분석을 위한	Pierce	28324
1 ml luer-lok 주사기	Fisher	14-823-30
200 마이크로리터 필터 팁	Rainin	RT-L200F
3-0 수술용 봉합	Fisher	NC9598192
30 G 바늘	Fisher Scientific	14-821-13A
접착 마이크로 플레이트 밀봉 시트	Thermo	AB-0558
알코올 준비 패드	Fisher	22-246-073
마취 자동 흐름 시스템	EZ 마취	EZ-AF9000
동물 회복 챔버	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 보충제	Life Technologies	17504-044
베타딘 솔루션	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
소 성장 세럼	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
코튼 팁 애플리케이터	Puritan	806-WC
절단 바늘 3/8 서클 봉합	WPI	501803
디지털 울트라스코닉 클리너	Fisher Scientific	FS60D
DMEM 고포도당, GlutaMAX, 피루브산	Life Technologies	10569-010
DNA 질량 사다리	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase(재조합 단백질)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase 항체(WB, ICC 또는 IHC용)	New England Biolabs	E8023S	1:2,000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
케타민	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic Powder	Butler Schein	5867
L-글루타민	시그마	G8540
메탄올	피셔	a452-4
마이크로퓨지 22R 원심분리기	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal 매체	Life Technologies	21103049
Nikon 입체경	Nikon	SMZ745T
뉴클레오스핀 젤 및 PCR 클린업	Machery-Nagel	740609
P200 피펫	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR 필름 씰	Fisher	AB0558
페니실린/스트렙토마이신	Life Technologies	15140-122
프로테아제 억제제 칵테일	Sigma	P8340
ReFresh 숯 필터 캐니스터	E-Z 마취	EZ-258
메스 블레이드, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD 쥐 150-200g	Charles River	쥐는	150-200 g으로 주문했습니다.  수술 도착 후 5일
동물 귀 태그	National Band and Tag co	1005-1
멸균 수술용 드레이프	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 플레이트 리더	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	해 인간 건강
Virapower 렌티바이러스 포장 믹스	Life Technologies	K4975-00
Xfect 트랜스펙션 시약	클론텍	631318
자일라진	밸리 수의사	468RX