소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다. 분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
소포체 (ER)의 농도가 약 세포질 수준보다 5,000 배와, 세포 내 칼슘의 높은 수준을 포함하고 있습니다. ER 칼슘 통해 엄격한 제어는 단백질 접힘, 수정 및 인신 매매에 대한 필수적입니다. ER 칼슘에 섭동이 펼쳐진 단백질 응답, 3 구 ER 스트레스 반응기구의 활성화를 초래하고, 다양한 질병의 병인에 기여할 수있다. 질병의 발병과 진행하는 동안 응급실 칼슘 변경을 모니터링하는 기능은 실제로는 원칙적으로 중요한, 아직 도전이다. 칼슘 의존 형광 염료와 단백질과 같은 모니터링 응급실 칼슘 현재 가능한 방법은, 그러나 이러한 도구는 생체 내 연구에 적합하지 않은 세포에서 ER 칼슘 역학에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 우리 연구소는 Gaussia 루시 페라 제의 카르복시 말단에 수정에 대한 응답으로 기자의 분비를 부여하는 것을 보여 주었다ER 칼슘 고갈. 시험 관내 및 생체 내 적용에서 루시페라아제 기초 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMP)를 사용하는 방법이 설명된다. 이 동영상은 응급실 칼슘의 종 모니터링 간 주사, GLuc-SERCaMP, 혈액 수집 및 처리의 약리 조작, 분석 매개 변수를 강조한다.
서론
소포체 (ER) 1 시그널링 단백질 접힘, 분비 단백질, 지질 항상성, 세포 내 및 세포를 포함한 많은 용량으로 기능한다. 일반 응급실 기능의 핵심은 ~ 5,000 시간에 내강 칼슘 농도 세포질 2-4에서 발견을 유지하고있다. 이 에너지 집약적 인 공정은 사코 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA), ER에 칼슘 이온을 이동시키는 펌프에 의해 조절된다. 응급실에서 칼슘의 유출은 주로 ryanodine (RyR)과 이노시톨 인산염 (IP3R) 수용체에 의해 매개된다. 많은 ER 프로세스 칼슘에 따라 달라 지므로, 저장을 방해하는 것은 ER 스트레스 결국 세포 사멸을 초래할 수있다.
ER 칼슘 조절 장애는, 심근 병증, 당뇨 알츠하이머 질환에서 관찰되었으며, 파킨슨 5. 이들 질환의 점진적 특성으로 인해, 그것은 인과 재 묘사하는 도전되었습니다ER 칼슘 저장소의 병인과 변화 사이 lationship. 기술의 숫자는 염료 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)를 포함하여 ER 칼슘 역학, 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 칼슘 이온에 결합 될 때 형광 증가 선호도가 낮은 칼슘 염료, 칼슘 6 고농도 세포 내 구획을 조사하는 세포에로....
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프로토콜
시험 관내 분석에서 1 : 안정 SH-SY5Y 세포주에서 감지 SERCaMP 출시
- 플레이트 SH-SY5Y-GLuc - ASARTDL (SERCaMP) 조직 문화는 표면적 cm 2 당 150,000 세포에서 판을 처리 하였다. 96 웰 플레이트, 예를 들면, 세포를 웰 당 50,000 (도 1a)을 시드. DMEM (높은 포도당, 루타, 피루브산) + 10 % 소 성장 혈청 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 SH-SY5Y 세포를 성장.
- 15 배 (그림 1B)까지의 통로 세포. 높은 통로 수는 테스트되지 않았습니다.
- 5.5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에 세포를 반환하고 밤새 품어.
- 실험적 치료 (들) 전에 잘 불투명 배양 상등액 5 μl를 전송하여 각 기준 샘플 수집은 96 웰 플레이트 성벽. 수집하기 전에 부드럽게 모든면에 접시를 누르고 그라데이션 효과를 방지하기 위해 소용돌이 친다. 접착제의와 불투명 플레이트를 밀봉효소 분석의 시간까지 4 ° C에서 일링 시트 및 저장.
주 : 분비 GLuc-SERCaMP은 세포 배양 배지에서 매우 안정적이다. 우리는 이전에 ....
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결과
GLuc-SERCaMP 방법은 세포 외 체액을 샘플링하여 응급실 칼슘 항상성의 평가를 할 수 있습니다. 복수의 컨트롤이 결과 해석을 향상 실험 설계에 포함될 수있다. 우선, (C 말단 ASARTDL 또는 "GLuc 아니 태그"없이 예 GLuc) 구성 적 분비 리포터의 사용은 분비 경로 (글로벌 셀룰러 분비) 및 유전자 발현에 실험적 치료의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, GLuc-SERCaMP 및 GLuc 아니 태그 양의 세포 외 농도 증가는 모호한 결과로 간주된다. 또한, GLuc 아니 태그 응답의 대응 부족으로 GLuc - SERCaMP 분비의 증가는 응급실 칼슘 의존 이벤트 (그림 8)를 지원합니다. 용해가 필요로 이것은 하나의 평가시기에 한정되어 있지만 응급실 칼슘 고갈에 응답 GLuc - SERCaMP의 분비 또한, 세포 내 GLuc를 측정하여 평가 될 수있다. 지능 (각각의 웰에 대해 계산) 세포의 비율 (도 .......
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토론
이 프로토콜은 시험관을 하이라이트 GLuc-SERCaMP 생체 유틸리티 ER 칼슘 고갈를 모니터링. SERCaMP를 생성하는 단백질 수정 다른 기자 단백질 (12)에 일반화 보이지만, 우리는 다른 루시페라아제 (18)에 비해 견고한 (200 ~ 배 이상) 생물 발광에 대한 Gaussia 루시 페라 제를 선택했다. 우리는 일차 래트 피질 뉴런, SH-SY5Y 세포 및 쥐의 간으로 전달 GLuc-SERCaMP 바이러스의 100 배의 용량 범위에 걸쳐 검출 쌥시 가르 긴 유도 GLuc-SERCaMP 릴리스 보여 (도 3 및도 4). 우리는 이전에 GLuc-ASARTDL를 안정적으로 발현하는 형질 전환 된 세포주의 생성을 설명하고 5 × 104 표지 된 세포 집단에서와 같이 소수의 20 12 세포 반응을 유도 쌥시 가르 긴를보고 할 수 있음을 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 약물 남용 연구소(National Institute on Drug Abuse)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 이 방법을 개발하는 데 기여한 Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno 및 Josh Hinkle에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 튜브 | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 용액 | 세포 내 GLuc 분석을 위한 | Pierce | 28324 |
| 1 ml luer-lok 주사기 | Fisher | 14-823-30 | |
| 200 마이크로리터 필터 팁 | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 수술용 봉합 | Fisher | NC9598192 | |
| 30 G 바늘 | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| 접착 마이크로 플레이트 밀봉 시트 | Thermo | AB-0558 | |
| 알코올 준비 패드 | Fisher | 22-246-073 | |
| 마취 자동 흐름 시스템 | EZ 마취 | EZ-AF9000 | |
| 동물 회복 챔버 | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 보충제 | Life Technologies | 17504-044 | |
| 베타딘 솔루션 | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| 소 성장 세럼 | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| 코튼 팁 애플리케이터 | Puritan | 806-WC | |
| 절단 바늘 3/8 서클 봉합 | WPI | 501803 | |
| 디지털 울트라스코닉 클리너 | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM 고포도당, GlutaMAX, 피루브산 | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA 질량 사다리 | Life Technologies | 10496-016 | |
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| Gaussia luciferase 항체(WB, ICC 또는 IHC용) | New England Biolabs | E8023S | 1:2,000 (WB) |
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| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
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| 케타민 | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic Powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-글루타민 | 시그마 | G8540 | |
| 메탄올 | 피셔 | a452-4 | |
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| 자일라진 | 밸리 수의사 | 468RX |
참고문헌
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38<....
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