이 프로토콜은 추가적인 외인성 보충 또는 hPSC 특이적 합성 하층(hPSC) 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 담긴 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 증식시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
공급자가 없는 배양 조건에서 인간 세포에서 유래한 조건화된 배지에서 인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 증식이 흥미로웠습니다. 그럼에도 불구하고, hPSC에 대한 이상적인 인간화된 ex vivo feeder-free 증식 방법은 개발되지 않았습니다. 현재 모든 배양 배지에는 hPSC 유지 인자인 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함한 추가 외인성 기질이 추가되고 있으며, 모든 무공급 배양에는 마트리겔(Matrigel) 또는 라미닌(laminin)과 같은 합성 기질이 사용됩니다. 최근 우리 그룹은 hPSC에 특이적인 외인성 보충제 또는 합성 기질층 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 hPSC의 증식을 위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이전에 보고된 적이 없으며 연구자들이 인간화된 배양 조건에서 hPSC를 효율적으로 전파할 수 있도록 할 수 있습니다. 또한 이 모델은 바이러스 또는 알려지지 않은 단백질과 같은 동물성 제품에 의한 hPSC 오염 위험을 방지합니다. 또한, 이 시스템은 취급이 간편한 젤라틴 코팅을 사용하여 hPSC의 대량 생산을 용이하게 하여 ex vivo hPSC 유지 보수의 전체 비용을 크게 줄여줍니다.
서론
이 프로토콜의 목표는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포(hPSC)를 추가적인 외인성 보충제 및 합성 기질 없이 완전히 인간화된 ex vivo feeder-free 조건에서 증식하는 것입니다. 현재까지 배양 제품을 임상에 도입할 수 있는 생체 외 hPSC 배양 모델의 개발은 줄기 세포 연구의 주요 관심사였습니다. 특히 두 가지 중요한 문제를 해결해야 합니다. 첫째, 동물 세포 제품에 의한 오염 위험을 제거하는 hPSC의 증식을 위한 인간화된 체외 배양 시스템이 필요합니다. 둘째, hPSC의 쉽고 경제적인 대량 생산을 촉진하기 위해 피더가 없는 배양 모델이 필요합니다. hPSC의 치료 적용을 위해서는 자가 재생과 분화를 조절하는 요인을 규명할 필요가 있습니다.
Xu 등이 처음에 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 유래한 조건화된 배지(CM)를 사용하여 Matrigel1에서 hESC를 성장시키는 것이 가능하다고 보고한 이래로, 많은 연구에서 hPSC2-4에 대한 최적의 체외 증식 방법을 조사했습니다. 그러나 이상적인 인간화 ex vivo feeder-free hPSC 전파 시스템은 개발되지 않았는데, 이는 현재 방법이 배양 배지5-7에서 잘 알려진 hPSC 유지 인자인 bFGF 및 인슐린을 포함한 추가 외인성 기질을 필요로 하기 때문입니다. 또한, Matrigel 또는 laminin과 같은 합성 하위층은 모든 피더가 없는 배양에서 사용됩니다.
이 프로토콜의 개발 및 사용의 근거는 인간 태반 융모막 세포가 bFGF 보충 없이 hPSC의 증식을 훌륭하게 지원한다는 것을 보여주는 이전 연구를 기반으로 합니다8-11. 이 프로토콜은 취급 시 단순성과 비용 효율성 등 여러 가지 장점이 있으며, 외인성 합성 기질 없이 hPSC 증식을 가능하게 하는 거의 완벽에 가까운 인간화 배양입니다. hPSC에 대한 인간 태반 유래 CM(hPCCM)의 적용에는 3단계가 포함됩니다. 먼저, 융모세포를 인간 태반에서 분리하여 배양합니다. 둘째, hPCCM은 배양된 세포에서 생산됩니다. 셋째, hPCCM을 이용하여 hPSC를 배양하고 그 특성을 확인한다.
이 프로토콜은 hPSC의 임상 적용과 hPSC 증식 및 부착 메커니즘에 대한 연구를 촉진합니다. 본 논문에서는 젤라틴으로 코팅된 접시에서 hPCCM에서 hPSC를 성공적으로 증식시키기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
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프로토콜
윤리 문 : 인간의 태반 연구는 고려 대학교 (AN09085-001)의 인간 연구를위한 임상 시험 심사위원회의 승인을 전향 적으로 실시 하였다. 모든 실험은 한국 대학 의료 센터에서 클린 무균 룸 시설에서 수행 하였다. 실험 설계 및 hPSCs를 사용 절차는 고려 대학교 병원의 임상 시험 심사위원회 (AN12277-003)에 의해 승인되었다.
악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비
- 0.1 % 젤라틴과 코트의 모든 문화 요리. 오토 클레이브 인산염 완충 식염수 (PBS)와 집게. 이상 15 분 동안 15파운드의 PSI 하에서 121 ° C에서 수술 가위, 마이크로 원심 튜브, 멸균 거즈.
- 준비된 미리 예열 0.25 % 트립신 에틸렌 아민 테트라 아세트산 (트립신 EDTA) 및 미리 예열 여과 배양 배지 (DMEM) 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린을 함유하는, 100 ㎍ / ㎖ streptomyc절차를 시작하기 전에에서.
인간 태반 2. 세포 격리
- 서면 동의서를 얻은 후 임신 7-32주에서 정상 또는 치료 낙태를 받고 건강한 임신 한 여성에서 제왕 절개 배달 후 태반 조직을 얻습니다.
- 태반에서 산부인과 전문의 수술 별도의 인간 태반 융모 판 (HPC의)가; 20 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 EDTA에이를 배양 한 다음 5 ml의 PBS로 씻는다.
- 가위를 사용하여 HPC의에서 융모막 융모를 분리; 융모를 말하다 및 1 ㎖의 PBS로 세 번 씻는다. 닦지 후, 피펫 팁을 사용하여 미세 원심 분리 튜브에 융모막 융모를 배치; 아래로 pipetting 및 500 μL PBS로 샘플을 씻어, 3 분 동안 120 XG의 튜브를 원심 분리기. 미리 예열 문화 매체의 500 μL로 두 번 조직을 씻으십시오.
- 37 ° C에서 젤라틴 코팅 접시에 배지에서 배양 세포, 5 % CO 2 , 95 % 미만 습도. 사전 코트 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 모든 판. 섬유 아세포와 같은 세포의 콜로니 형성과 약 5-7일 같은 매체에 문화를 개시 한 후 부착 성장합니다.
- 제 3 통로까지 2-3 일마다 매체를 교환하십시오. 배양 동안에, 배지에 떠있는 세포 파편을 제거하는 단계; 성장하는 태반의 섬유 아세포는 판에 연결됩니다. 문화 후 10 일 통로로 HPC부터 유래 섬유 아세포와 같은 세포는 트립신과 마이 토마 이신 -C (10 μg의 / ㎖) 처리 후 hESC의 배양을 위해 그들을 수확.
- 스톡 시료로서 HPC의 동결 전에, HPC의 일반적 (M.의 fermentans, M.의 hyorhinis, M. 아르기닌, M을 미코 플라스마 포함 태반, 감염 병원체에 오염되지 않은 것을 확인 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 . orale, 엠의 salivarium, M. hominis가, M.의 pulmonis, 엠의 arthritidis, 엠의 neurolyticum, M. hyopneumoniae,그리고 M. capricolum) 및 박테리아 종 Ureaplasma urealyticum의, 마이코 플라스마 검출 키트를 사용하여.
- , RT-PCR을 수행하기 위해 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 모든 프라이머 및 이들의 혼합물을 사용합니다. 마이코 플라즈마 검출 36 일 동안 배양 된 세포의 상층 액을 사용합니다. PCR 혼합물에이 샘플의 3 μl를 추가하고 30 초, 2 분 동안 55 ℃, 1 분 동안 72 ℃에서 각 94 ° C로 구성된 35주기 위해 1 차 PCR의 절차를 수행합니다.
- 조심스럽게 PCR 혼합물에 1 차 PCR 산물의 0.5 μL를 추가하고 이전과 동일한 조건을 이용하여 30 사이클 동안 2 차 PCR 절차를 수행한다. 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의한 증폭 산물을 분석; 젤에 1 차 및 2 차 PCR 산물을 각각 10 μL를 적용합니다.
- HPC의 병원체가 오염 된 것으로 발견되면, 이러한 제거제조업체의 지침에 따라 항생제의 조합 (BM-사이클린)를 사용. 3 일 BM-사이클린 (1) 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 새로운 매체를 추가하고 또 다른 4 일 동안 5 μg의 / ㎖ BM-사이클린 2 세포를 취급합니다. 두 번이 사이클을 반복 한 후 다시 마이코 플라스마 오염 확인합니다.
3. 수확 인간 태반 유래 세포 중간 (hPCCM), 금연실
- 오염을 제외한 후, 부착 세포 (85~90% 합류 치료; (1.5 × 107 세포 / 2 시간 30 분 동안 미토 마이신 C (10 μg의 / ㎖)와 함께 플라스크) 및 10 ml의 세포를 3 회 세척 PBS는. 24 시간 동안 마이 토마 이신 C-없이 사전 예열 매체와 세포를 품어.
- 어느 날 치료 후, 10 ml의 배지에서 세포를 배양 (DMEM-F12 20 % 노크 아웃 혈청 교체 [KOSR] 보충, 0.1 MM의 β - 머 캅토 에탄올, 1 % NEAA, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 15 ML 원뿔 관에서 24 시간 배양, 수확 후 CM과0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 필터링 CM.
- 새로운 매체 및 배양의 또 다른 10 ML을 추가합니다. 1 주간 매일 문화에서 모든 상층 액을 수집하고 -80 ° C에서 수확 한 매체를 동결. 반복 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
4. 문화 인간의 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포) 및 다 능성 줄기 세포의 유도 (iPSCs)
- 인간 배아 줄기 세포주를 확보, (각각 이름 WA01 및 WA09에서 NIH hESC의 레지스트리에 나열된) (H1)과 H9 세포와 유도 만능 줄기 세포 IPSC-1 : 만능 줄기 (포피) -1 IPSC-2 (IISH1i- WiCell 연구소 (매디슨, 위스콘신, 미국)에서 BM). 전지는 제조업체의 지침에 따라 해동 배양해야한다.
- 대조군, 37 ° C에서 널리 사용되는 피더없고 정의 된 무 혈청 배지에서 기저막 매트릭스 코팅 접시에 5 % CO 2에서 배양 세포. 처음 hPSCs의 80-100 덩어리 씨앗 나는N 35-MM 요리. 70-80 %의 합류와 정기적 통로 세포까지이 요리에 세포를 성장 서브 배양, 모든 5-6일 한 번 기계적 또는 효소 적 방법 (스파 아제 (Dispase))를 사용하여. 매체로 두 번 세포를 씻으 1의 비율을 판 : 4. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
- 실험 그룹의 경우, 요리에 hPCCM에서 배양 세포를 기계적으로 또는 효소, 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 한 번 5 일마다 계대 루틴을 수행합니다. 6-1 : 10 (1)의 범위의 비율로 플레이트 세포. hPSCs는 전송 후 이일 내 젤라틴에 연결합니다. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
인간 만능 줄기 세포의 특성 (5)
참고 : 알칼리 포스 파타 아제 염색, 면역 세포, 정량 실시간 PCR (QRT-PCR), 서부 블로 팅 등의 여러 가지 방법을 사용 hPSCs을 특성화.
- 면역 형광 염색법
- immunofluorescenc 들어E 염색, 문화 hPSCs 4 % 10 분 동안 (W / V) 파라 포름 알데히드와 8 웰 슬라이드 챔버에서 세포를 수정; 그리고, (v / v)의 트리톤 X100 15 분 동안 0.1 %를 함유하는 PBS에서 3 % (v / v)의 정상 말 혈청과 함께 1 시간 동안 세포를 차단 (v / v)의 0.1 %로 세포 투과성이 Tween- (20). 각 단계 사이에 5 분 동안 두 번 PBS를 씻으십시오.
- 4 ° C에서 이차 항체와 O / N : 차 항체 (1,000 일의 10월-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, 희석)와 세포를 품어.
- 장착 전에, 어두운 곳에서 5 분 동안 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 배양한다. 세척 세포 엄격에게 어둠 속에서 각각의 건전지 완전히 5 분 3 회. 형광 장착 배지에서 세포를 유지하고, 형광 현미경 하에서이를 관찰한다.
- QRT-PCR
- 제조 회사의 사양에 따라 분리하고, RNeasy 미니 키트를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하고 나노 드롭 분광 광도계를 사용하여 추출한 RNA를 정량화.
- 20 ㎕의 반응 혼합물을 함유하는 올리고으로 총 2 μg의 RNA를 첨가하여 cDNA를 합성 (DT) 프라이머 및 슈퍼 스크립트 II 역전사 효소는; 이 과정에서 제조업체의 지침을 따르십시오.
- iQ를 SYBR 그린 qPCR의 매스터 믹스와 기업 S1 표에 기재된 프라이머 서열을 이용하여, 바이오 래드 iCycler IQ 시스템으로 합성 된 cDNA를 증폭. 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)들에 관심 유전자의 사이클 임계 값들을 정규화.
- 알카라인 포스파타제 (AP) 염색
- 제조사의 프로토콜에 따라, ES 세포 특성 분석 키트를 사용하여 AP의 활동을 감지.
- 5 일에서 미디어를 대기음 12 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 hPSCs를 해결. overfix하지 마십시오 이상 2 분 동안 세포를 고정하는 알칼리 포스 파타 아제의 비활성화가 발생합니다. 정착액을 기음과 1X 린스 버퍼 씻어. 하지 마라우물 단계 사이에 건조 할 수 있습니다.
- 각 웰 (35mm 접시 잘 당 1 ㎖)에 충분한 염색 액을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
- 배양 후, 1X 린스 버퍼과 설거지. 1X PBS와 표지 세포의 건조를 방지하고 올림푸스 현미경을 사용하여 염색 된 세포를 조사하고 이미지.
- 서쪽 오점
- 이전에 9에 설명 된대로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 간략하게, 세포 용 해물에서의 단백질 농도를 결정한다. 소듐 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 겔상의 단백질의 동량을 해결하고, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막에 단백질을 옮긴다.
- 오점을 차단하고 4 ° C에서 다른 1 차 항체 / O, N 그것을 조사; 이후 1 시간 동안 HRP - 복합 이차 항체와 얼룩을 품어. 10 분 배양 사이의 때마다 막 세 번 씻으십시오. ECL 시약을 이용하여 신호를 검출.
- 짧은 탠덤 반복 (STR) 분석
- hPSCs는 같은 통로에서 제어 및 실험 그룹에서 수확했다. 게놈 DNA는 제조자의 지시에 따라서, DNA 마이크로 키트를 사용하여 추출 하였다.
- 제조자의 명세 및 모세관 전기 영동에있어서, AmpF / STR PCR 증폭 키트를 사용하여 16 개의 서로 다른 유전자좌에 대한 게놈 DNA를 증폭하는 유전 분석기를 사용하여 수행 하였다.
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결과
이 hPSC 전파 방법의 이점은 인간 세포로부터 분비 된 요소를 사용한다는 것이다. 프로토콜에서 가장 ciritical 단계는 인간 태반 유래 세포의 분리 및 문화입니다. 이 요구 및 HPC 판 융모의 정확한 부분에서 정확한 해부. 한 인간 태반 유래 세포의 분리를위한 절차를 보여줍니다. 이 과정은 간단하고 세포의 분리를위한 편리하고 용이하게 1 시간 내에 수행 될 수있다. 도 2에서 설명한 바와 같이, 조직은 견고 유독 젤라틴 코팅 접시 및 섬유 아세포 - 유사 세포에 부착. 트립신 처리에 의해 통로 중에 파편과 소멸 조직의 제거는 셀의 선택을 허용하고 균질 배양을 보장한다. 이러한 세포 오염의 부족을 확인한 후 hPSC의 증식에 대한 조정 배지를 제조하기 위해 사용될 수있다. 최적의 조건은, 세포 80-85% 합류로 성장시키고 것과 같이 정의 된 일 후E 성장 인위적 (데이터는 도시하지 않음)을 정지시켰다.
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토론
이 모델은, 예컨대의 bFGF 또는 인슐린과 같은 외인성 재조합 성장 인자 첨가없이 인간화 피더가없는 배양 조건에서의 특성을 유지 인간화 미세 환경에서 hPSCs의 조작을 가능하게하면서 성공적 hPSCs를 전파하기 위해 개발되었다. 외인성 bFGF를 보충 일반적입니다 및 마트 리겔 또는 라미닌 등 하층의 응용 프로그램은 hPSCs (14)의 공급이없는 배양을 위해 필수적이다.
이 프로토콜은 간단하고 쉽게 구현할 수있다. 그러나 일부 단계는 성공에 매우 중요합니다. 가장 중요한 단계는 태반으로부터 융모막 세포의 무균 단리이다. 태반에 대한 수집 방법에 의해, 예컨대 미코 플라스마와 같은 병원균에 의한 오염의 위험이 높다. 따라서, 세포의 분리시 병원체 검사 및 관리가 매우 중요하다. 또한, 모든 절차 무균 수행되어야한다. conditione의 컬렉션인간 태반 세포의 배양 배지에서 D는 일반적으로 용이하다. 그들의 처리가 다소 어렵 기 때문에 그러나, hPSC...
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공개 사항
저자는 관심의 충돌을 표시하지 않습니다.
감사의 글
저자는 태반 조직을 제공하기 위해 곧-철이 홍콩 (MD, 박사, 부교수, 산부인과학과, 의과 대학 고려 대학교)에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 한국의 국립 연구 재단 (NRF), 대한민국에서 보조금 (R1211902)에 의해 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 미토 마이신 -C | 시그마 - 알드리치 코퍼레이션 | M4287 | 10 μ g/ml |
| 마이코플라스마 검출 키트 | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| 마트리겔 | BD 생명과학 | #354277 | |
| mTeSR1 | 스템셀 테크놀로지스 | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| 젤라틴 | 시그마-알드리치 코퍼레이션 | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μ g/ml |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74104 | |
| 나노 드롭 분광광도계 | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR 마스터 믹스 | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES 세포 특성화 키트 | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA 합성 키트 | iNtRON 생명공학 | 25011 | |
| QIAamp® DNA 마이크로 키트 | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® 식별자® PCR 증폭 키트 | Applied Biosystems Inc. | ||
| Applied Biosystems® 3130xl 유전자 분석기 | 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems Inc.) |
참고문헌
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- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
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