단백질 응집체 또는 단백질 요법 씨앗의 세포 간 이동은 신경 퇴행성 질환에서 병리학의 진행의 기초가 될 수 있습니다. 여기에서는 재조합 또는 생물학적 샘플에서 시딩 활성을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있는 새로운 FRET 유세포 분석 분석에 대해 설명합니다.
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방법 논문
FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
알츠하이머병 및 관련 타우병증을 포함한 여러 신경퇴행성 질환에서 병리학의 시작 및 진행을 위한 메커니즘으로 독성 단백질 응집체 또는 단백질요법 씨앗의 세포 간 증식을 지지하는 증거가 증가하고 있습니다. 질병 진행에서 타우 종자(tau seed)가 잠재적으로 중요한 역할을 할 수 있다는 점은 생물학적 시료에서 파종 활성을 쉽게 검출할 수 있는 민감한 분석법의 필요성을 강력하게 뒷받침합니다.
형광 공명 에너지 전달(FRET)의 특이성, 유세포 분석의 민감도 및 단클론 세포주의 안정성을 결합하여 초고감도 시딩 어세이가 설계되었으며 인간 및 마우스 뇌 균질체를 포함한 재조합 또는 생물학적 샘플의 시드 검출과 호환됩니다. 이 분석은 단백질 응집 시 FRET 신호를 생성하는 CFP 또는 YFP에 융합된 질병 관련 P301S 돌연변이를 품고 있는 tau의 응집이 잦은 반복 도메인(RD)을 안정적으로 발현하는 단클론 HEK 293T 세포를 사용합니다. 단백질요법 타우 씨앗(다른 단백질은 제외)을 바이오센서 세포로 흡수하면 RD-CFP 및 RD-YFP의 응집이 촉진되며, 유세포 분석은 이 응집 유도 FRET를 민감하고 정량적으로 모니터링합니다. 이 분석은 재조합 타우 종자의 펨토몰라 농도(단량체 등가물)를 검출하고, 3배에 걸친 동적 범위를 가지며, 타우오병증 형질전환 마우스 및 인간 타우오병증 피험자의 뇌 균질체와 호환됩니다. 약간의 변형으로, 분석실험은 또한 α-synuclein과 같은 다른 proteopathic seed의 파종 활성을 검출할 수 있으며, 또한 1차 신경 세포 배양과 호환됩니다. FRET 유세포 분석의 용이성, 민감도 및 광범위한 적용 가능성으로 인해 광범위한 단백질 응집 장애를 연구하는 데 유용합니다.
서론
세포 내 타우 아밀로이드의 축적은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경을 정의한다. 초기 질병 단계에서, 병리학은 일반적으로 뇌의 이산 지역 언어로 번역되어 있지만, 질병의 진행과 함께, 병리는 변함없이 별개의 신경망 1-5을 따라 확산. 축적 증거가 독성 단백질 응집체의 세포 횡단 전파가 (6-10에서 검토)이 병리의 기초가 제안합니다. 이 모델에서, proteopathic 종자 (예 타우) 공여 세포로부터 방출되고, 주형 형태 변화 11-15 비아 미스 폴딩 형태로 네이티브 타우 단백질을 변형, 인접 셀 입력. 여기에 설명 된 분석은 이러한 민감 시딩 활성을 검출하기 위해 개발되었다. 그것은 재조합 단백질 및 생체 시료와 호환되며 proteopathic 시드 활동 16 분 수준의 정량화 할 수 있습니다.
안정적 타우 반복 D를 표현하는 HEK 293T 세포CFP 또는 YFP 하나에 융합 된 질병 - 관련 돌연변이 P301S 함유 omain (RD)는 시딩 활성의 안정적 바이오 센서로서 기능 (이하 타우 RD-CFP / YFP 셀이라 함). proteopathic 씨의 부재 하에서, 세포는 수용성 단량체로서 타우을 유지하고 뚜렷한 배경 FRET ....
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프로토콜
주 :이 프로토콜은 FRET의 사용은 마우스 생물학적 시료에서 시딩 활성을 검출하기위한 유세포 강조한다. 또한, 피 브릴과 재조합 인간 생물학적 시료와 호환된다. 마우스를 안락사 뇌 수확은 IACUC 승인 절차에 따라 수행 하였다.
1. 뇌 추출
- 이소 플루 란 (2 %)와 깊은 마취를 따르는 것은, 얼음처럼 차가운 PBS는 0.03 %의 헤파린을 포함와 마우스를 관류하고, 게이지 등에 기술 된 사항은 다음 뇌의 압축을 풉니 다. (18)
- 극저온 유리 병에서 추출한 조직을 배치하고 액체 질소에 배치하여 동결 웁니다. 또한, 드라이 아이스에 조직을 동결. 일단 필요한 경우, 장시간 동안 -80 ° C에 저장 조직을 전송 냉동.
참고 :이 프로토콜은 전체 뇌 균질 또는 마이크로 해부 뇌 영역과 호환됩니다. Hagihara 등의 알을 참조하십시오. 자세한 마이크로 해부 프로토콜 19.
생물 종자 소재 2. 준비
- 1X의 TBS (10 ㎖ 당 1 정제)에 단백질 분해 효소 억제제를 (무료 EDTA)을 용해하여 균질화 버퍼를 준비합니다. 얼음에 적극적으로 소용돌이 및 저....
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결과
FRET 유동 세포 계측법에 민감한, 양적, 재조합 또는 생물학적 시료에서 파종 작업을 신속하게 검출 할 수 있습니다. 분석 설치가 용이 한 것입니다 : 타우-RD-CFP / YFP을 표현하는 단일 클론 유래 안정적인 세포주는 24 ~ 48 시간 동안 배양, 종자 물질로 형질 도입 및 분석 (그림 1A) 유동 세포 계측법의 대상이된다. 씨의 부재에서, 바이오 센서 셀 가용성, 단량체 형태 (도 1b) 타우를 유지한다. 종자의 존재하에 그러나, 바이오 센서는 유동 세포 계측법으로 셀당 기초 FRET 검출 응답을 생성하는, 응집 된 상태 (도 1C) 타우로 변환한다. 정량적 인 평가는 바이오 센서 셀 시드 물질의 펨토 몰 농도에 반응하고 시딩 활성을 효과적으로 세 오더의 크기 (도 1D)에 걸쳐 측정 될 수 있다는 것을 보여준다.
게이팅 파라미터 (TR)의 검.......
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토론
여기에 설명 된 FRET 유동 세포 계측법 시스템은 신속하고 정량적 타우 파종 활동을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 단지 적당한 세포 배양 경험과 FRET에 대한 실무 지식과 유동 세포 계측법을 필요로한다. 베타 시트 구조에 결합하면 형광을 강화 전시 - - 등 Thioflavin T와 같은 다른 시드 분석은, 수고하고 순수한, 재조합 단백질 기판을 필요로한다. 또한, 타우에 대한 시험 관내 시드 분석은 반 정량과 종자 재료 (23, 24)의 subnanomolar 수준으로 일반적으로 문자를 구분하지 않는다. 유동 세포 계측법 프렛 그러나, 재조합 또는 생물학적 중 샘플에서 시드 활동의 양적, 정교하게 민감한 측정을 제공합니다. 또한, 적응 절차는 단백질 응집 질환의 다양한 연구에 유용 할 수있다.
본원에 기술 된 프로토콜은 타우 시드에 집중되지만, 단순 수정은 t 필요O proteopathic 씨의 다른 유형에서 파종 활동을 감시.......
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공개 사항
이 분석은 Janssen Pharmaceuticals에 라이선스가 부여되었습니다.
감사의 글
이 작업은 Tau 컨소시엄(M.I.D)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 1R01NS071835(M.I.D.), 국방부 보조금 PT110816(M.I.D.), 1F32NS087805(J.L.F.), 1F31NS079039(B.B.H.).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| TBS | Sigma | T5912 | |
| cOmplete 프로테아제 억제제(EDTA 무함유) | Roche | 4693159001 | |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | XSE 105DU | |
| 계량 보트 | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| 15ml 원뿔형 튜브 | USA Scientific | 1475-0501 | |
| Omni Sonic Ruptor 초음파 균질화 기 | Omni International | 18-000-115 | |
| 초음파 균질화 기 용 마이크로 팁 | Omni International | OR-T-156 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 | |
| 노이즈 캔슬링 귀마개 | Fisher Scientific | 19-145-412 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| 1.5 ml 튜브 | USA Scientific | 1615-5510 | |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5424 000.215 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| 소 태아 혈청 | HyClone | SH30071.03 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | Phoenix Research | SS-PH15 | |
| 25ml 시약 리소스 | VWR | 41428-954 | |
| 다중 채널 피펫 | Fisher Scientific | TI13-690-049 | |
| 96 웰 플랫 바닥 플레이트 | Corning | 3603 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| 리포펙타민 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| 96 웰 라운드 바닥 플레이트 | Corning | 3788 | |
| 16% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | RT 15710 | |
| PBS | 시그마-알드리치 | P5493 | |
| EDTA | 시그마-알드리치 | ED2SS | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| Sorvall ST 40 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004509 | |
| BIOLiner 스윙 버킷 로터 | Thermo Scientific | 75003796 | |
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| 200 μ l 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-1800 | |
| 5 ml 혈청학 피펫 | Phoenix Research | SPG-606180 | |
| 10 ml 혈청학 피펫 | Phoenix Research | SPG-607180 | |
| 25 ml 혈청학 피펫 | Phoenix Research | SPG-760180 |
참고문헌
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neu....
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