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방법 논문

마우스 뇌 혈관의 정화

24.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53208

⸱

2015년 11월 10일

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

이 논문에서

요약

우리는 쥐의 뇌의 혈관 구획을 정화할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 고립된 뇌 혈관에는 긴밀한 연접으로 연결되어 있고 연속적인 기저 층막, 주위 세포, 혈관 평활근 세포 및 혈관 주위 성상교세포로 둘러싸인 내피 세포가 포함됩니다.

초록

뇌, 혈관 시스템의 대부분은 선택적 장벽 이루어져, 뇌 및 혈액 사이의 분자 및 면역 세포의 교환을 조절 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​. 더욱이, 거대한 신경 대사 요구 혈류 매 순간 규제를 필요로한다. 특히,이 규정의 이상은 대부분 뇌 병변의 병인 특징이다; 뇌 종양,뿐만 아니라 다발성 경화증, 수막염 및 패혈증 - 유도 된 뇌 기능 장애와 같은 염증성 질환 : 아교 모세포종, 뇌졸중, 부종, 간질, 퇴행성 질환 (파킨슨 병, 알츠하이머 병 EX)를 포함. 따라서, 뇌 혈관 생리학 변조 시그널링 이벤트 이해 주요 과제이다. 뇌 혈관 시스템을 구성하는 다양한 세포 유형의 세포 및 분자 특성에 많은 통찰력 갓 해리 뇌 조직에서 정렬 차 또는 배양 세포로부터 얻어 질 수있다. 그러나,휴대 극성, 형태 및 세포 간 관계와 같은 속성은 준비에서 유지되지 않습니다. 우리는 여기에서 설명하는 프로토콜은 구조적 일체 성을 유지하면서, 뇌 혈관 단편을 정제하기 위해 설계된다. 우리는 고립 된 선박이 연속 기저 얇은 판에 둘러싸여 꽉 접합에 의해 밀봉 내피 세포로 구성되어 있음을 보여준다. 주위 세포는 평활근 세포뿐만 아니라 혈관 주위 성상 endfeet 막은 내피 층에 부착 된 상태로 유지. 마지막으로, 우리는 정제 뇌 혈관에 면역 염색 실험을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

서론

중추 신경계 (CNS)의 적절한 기능이 고도로 조절 세포 외 환경을 요구하고, 그 요구는 다른 대사 기관 (1)에 비해 높아지고있다. CNS는 일반적으로 말초 기관에 무해하지만,에, 신경 독성 화학 물질의 넓은 범위에 매우 민감하다. 정확한 기능을 보장하기 위해, CNS '혈관의 대부분의 내피 장벽을 형성하고; 분자 및 이온의 흐름뿐만 아니라 혈액 및 뇌 사이의 면역 세포의 통과를 제어하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)은, 이렇게 저해 치료함으로써 적절한 항상성 (2)를 유지하지만, 또한 치료제의 침입을 제한 의 신경 학적 장애 3. 세포 수준에서, BBB는 주로 혈관 내피 세포, 유출 수송의 편광 표현과 매우 낮은 트랜스 사이토 속도 4 사이의 광범위한 꽉 접합에 의해 유지된다. 속성 및 BBB의 기능은 대부분 NE에 의해 유도되는ighboring 세포 4. 특히, 혈관 주위 세포는 BBB 5,6- 유도 및 유지에 중요한 역할을한다. 대형 선박을 둘러싼 평활근을 수축으로 세포이기 때문에, 혈관 주위 세포는 혈액의 흐름을 조절 7. 마지막으로, 성상 세포, 뇌의 주요 아교 세포, endfeet 주변라는 이름의 큰 프로세스를 보내 뇌 혈관 (8)의 대부분 BBB 무결성 및 면역 정지 (9), 신경 (10)에 대사 산물의 이동을 조절하고 신경 세포의 활동 사이의 밀접한 결합을 유도하고 혈류 11,12.

뇌 혈관 시스템의 분자 및 세포 특성을 연구 할 수있는 능력은 뇌 생리학과 physiopathology에 기여를 더 나은 특성을하는 것이 중요하다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 혈관 뇌의 시스템을 분리 전략은 그대로 뇌 혈관 단편의 제조를 허용하는 개발되었다. 뇌 혈관 Purification 처음 특히 설치류 (14)에, 다른 종에 소 뇌 (13)를 사용하여 설명하고 개선 적응했다. 마지막 연구에서, 가변 크기의 필터의 사용은 다른 직경의 혈관이 풍부한 분획으로 뇌 혈관을 구분하기 위해 도입되었다. 흥미롭게도, 이러한 준비에, 내피 세포는 신진 대사 특성 (15), 수송 기능 (16)과 편광 (17)를 유지했다. 여기서는 자세하게 설명 프로토콜을 추가로 절연 혈관 시츄 그들의 구조의 대부분을 보유 함을 입증. 내피 세포가 단단히 접합으로 연결하고 연속 기저판에 의해 둘러싸여 유지. 주연 세포와 평활근 세포는 내피 층뿐만 아니라 혈관 주위 성상 세포 막에 부착 된 상태로 유지. 그러나, 성상 세포, 미세 아교 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 제거된다. 마지막으로, 우리는 고립 된 뇌 혈관에 면역 염색 수행하는 절차를 설명합니다.

지금까지 뇌 혈관 시스템에 관한 분자 세포 연구의 대부분은 해리에 의해 정제하여 뇌 혈관 세포에서 수행 된 세포 - 세포 분류 특정 리포터 마우스 균주 또는 면역 - 기반 방법을 사용하여 18, 19. 이러한 기술은 거의 순수한 뇌 세포 인구의 격리를 위해 수 있지만, 분리 된 세포는 완전히 다시 크게 분자 및 세포 특성에 영향을 미치는 그들의 현장에서 형태와 상호 작용을 잃게됩니다. 이 프로토콜은 특정 항체 또는 유전자 변형 마우스 얼룩의 필요없이 전체 뇌 조각의 분리를 허용, 여기에 설명 된 분자 특성에 영향을 줄이는 따라서, 보존되어 고립 된 뇌 혈관의 전체 구조와 같은 좋은 대안을 제공합니다. 최근에 기술 된 바와 같이 (20, 21)를 절연 용기는 BBB에서 유전자 활성, 단백질 합성 및 조절을 연구에 사용될 수있는 . 마지막으로, 레이저 캡처 미세 절제 22, 23에 비해 본 프로토콜은 저렴 수행하기 쉽고 모든 실험실에 빠르게 적응할 수있다.

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프로토콜

1. 솔루션 및 재료

  1. 분리 용기 용액을 제조 : B1, 150 ㎖의 HBSS에 1M HEPES 1.5를 가하여; B2는 20 B1의 ml의 덱스 트란의 3.6 g을 추가; B3는, B1의 100 ml의 BSA의 1g을 추가합니다.
  2. 상단 나사 조임 부분 떨어져 바닥을 절단하여 필터 홀더를 수정합니다.
  3. 면역 용액 제조 : 고정액, PBS pH 7.4의 4 % 파라 포름 알데히드를; 투과성으로는 / 차단 솔루션, 5 % 염소 혈청을 희석 PBS pH 7.4의 0.25 %에 트리톤 X100.
    참고 : 고정 사용 일차 항체의 종류에 따라 다릅니다.

2. 해부

주 : 혈관 세포 배양 용으로 사용하지 않는 멸균 조건이 요구되지 않는다.

  1. B1 20 ㎖와 150 mL의 비커를 준비합니다. 얼음에 보관하고 공기 오염을 방지하기 위해 파라 필름 커버.
  2. 깊이 INT를 추가 순수한 아이소 플루 란의 1 ㎖에 적신 작은 종이 타월로 후드 아래에 마우스를 마취케이지를 오. 마취는 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 확인됩니다. 자궁 전위에 의해 마우스를 죽여.
    참고 :이 단계는 국가 및 기관의 규정에 따라 수행됩니다.
  3. 옵션 : 혈액 콘텐츠 (24)을 제거하기 위해 PBS 1X의 20 ml의 심장 내 관류를 수행합니다.
  4. 제 코에 목 메스 피부 멀리 당깁니다. PBS 1X 모든 오염 머리카락을 제거합니다.
  5. 두개골을 열려면, 먼저 후각 망울에 전방 가위를 삽입하고 두 부분으로 두개골 파열 가위를 엽니 다.
  6. 조심스럽게 뇌 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 이들이 혈관 제조 예 38을 오염 하듯 측뇌실에서 맥락총를 해부.
    참고 : 선택 사항 : 최종 준비 실질과 뇌막 혈관을 포함 할 것이다. 소망하지 않는 경우, 수막 (38)에 의해 기술 된 절차에 따라, 박리 될 수있다.
  7. TR얼음 B1 용액 함유 비이커에 뇌 ansfer. 최대 8 뇌를 함께 처리 할 수​​있다.

3. 뇌 조직의 균질화

  1. 두 메스를 사용하여 수동으로하고 적극적이어서 약 2mm의 작은 조각을 획득 B1 용액에 뇌를 이길.
  2. 400 rpm에서 20 스트로크를 수행이 자동화 다운스 균질 제제 균질화. 유리관 얼음과 공기 주머니의 형성을 방지하도록, 상하로 이동시 douncer의 상부 용액되어 유지되는 것을 보장한다. 여러 샘플을 준비하는 경우, 각각의 균질화 사이의 이온화 된 물 douncer을 씻는다.

4. 선박 정화

  1. 4 ℃에서 10 분간 2,000 g에서 원심 분리하고 50 ml의 플라스틱 튜브로 옮기고 균질 진행. 더 관류가 수행되지 않은 경우 큰 흰색 인터페이스 (주로 미엘린)는 용기 펠릿 (적색의 상부에 형성 할 것이다).
  2. 상층 액을 버린다. 선박 펠릿과 흰색 인터페이스가 함께 부착 상태로 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 B2 용액 20 ㎖를 추가하고 1 분 동안 수동으로하고 적극적으로 튜브를 흔들.
  3. 4 ℃에서 15 분간 4,400g에서 두 번째 원심 분리를 진행합니다. 미엘린 해주기 상등액의 표면에 조밀 한 백색 층을 형성 할 것이다.
  4. 조심스럽게 튜브를 들고 천천히가 뜨는는 벽을 따라 통과 할 수 있도록 회전에 의해 튜브 벽의 수초 층을 분리합니다. 뜨는와 수초를 폐기하십시오. 혈관을 함유하는 펠릿을 상기 튜브의 하단에 부착 된 상태로 유지.
  5. 5 ml의 플라스틱 피펫을 감싸 흡수 종이 튜브의 내부 벽을 가릴 모든 잔여 액을 제거, 혈관​​ 펠렛을 만지지 마십시오. 남아있는 액체를 배출 흡수 종이에 튜브 거꾸로하십시오.
  6. 낮은 바인딩 팁, keepi 최대 피펫 팅에 의해 아래로 얼음처럼 차가운 B3 용액 1 ㎖에 펠렛을 일시 중단얼음에 튜브를 겨, 다음 (B3) 솔루션의 또 다른 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 선박은 가능한 한 분산 및 집계를 형성하지 않도록해야합니다.

5. 여과

  1. 얼음처럼 차가운 B3 용액 30 ml의 얼음에 비커를 준비합니다. 공기 오염을 방지 할 파라 필름으로 커버.
  2. 베커 플라스크의 상단에 변성 필터 홀더에 20 ㎛의 메쉬 필터를 배치하고 빙냉 B3 용액 10 ㎖를 가하여 평형화.
  3. 필터상의 용기 준비 붓고 빙냉 B3 용액 40 ㎖로 혈관을 헹군다.
  4. 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 복구하고 즉시 B3 용액 함유 비이커에 젖어. 가볍게 흔들어 필터에서 혈관을 분리합니다.
  5. 4 ℃에서 5 분간 2,000 g에서 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 비이커 콘텐츠를 붓는다.
  6. 주 : 또는, 단계 4.6에서 뇌 혈관 '현탁액 100 ㎛ 메쉬의 필터로 여과 할 수있다.관류 후 상기와 같이 20 ㎛의 메쉬 필터로 여과되고 미세 혈관 (주로 모세관)를 포함하는 동안,이 경우에는, 큰 혈관 우선적 필터상에서 유지된다.
  7. 빙냉 B3 용액 1 ㎖에 미세 혈관의 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브로 피펫 팅하여 옮긴다. 4 ℃에서 5 분간 2,000g에서 원심 분리기.

6. 고정, 투과성으로하고 차단

  1. 1.0 ml의 낮은 바인딩 팁을 사용하여 PBS를 포함하는 0.2 ml의 PCR 튜브에 피펫으로 전송 선박. 그들이 팁의 바깥 부분에 부착 될 수 있으므로 혈관을 건드리지 않도록주의하십시오. 쌍안 현미경으로 다음의 모든 단계를 수행합니다.
  2. 다음 매체 변화의 각각에 대해, 선박 바닥에 도달 할 때까지 얼음에 튜브를두고 긴 것은 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 액체의 대부분을 피펫.
  3. PBS의 대부분을 제거하고 정착액 솔루션 200 μl를 추가합니다.부드럽게 흔들어 혈관을 일시 중단하고 실온에서 20 분 동안 품어.
  4. 정착액 솔루션을 피펫 및 1X PBS (제 1 세척) 200 μL로 교체, 실온에서 5 분간 배양하고이 단계를 3 회 반복한다. 때마다, 혈관이 제대로 혈관을 터치하지 않는 보장, 1X PBS 밖으로 튜브와 피펫의 바닥에 침몰했는지 확인합니다.
  5. 마지막 세척 후, 수시로 부드럽게 흔들어 혈관을 재현 탁, 투과성으로 / 차단 솔루션에 의해 1X PBS를 교체하고 실온에서 1 시간을 품어.

7. 면역 염색

  1. 투과성으로 / 차단 솔루션에 희석 일차 항체 (재료 템플릿 테이블에 여기 희석에 사용되는 항체의 참고 문헌 참조)의 혼합과 투과성으로 / 차단 솔루션을 교체하고 4 ° CO / N에 품어.
  2. 실온에서 PBS에서 3 회 세척 한 후, 2 시간 동안 PBS에 희석 이차 항체의 혼합과 용기를 품어실온에서.
  3. 참고 : 현미경으로 머리카락이나 먼지 오염 수에서 혈관을 구별하기 위해 (2,000 1) 또는 DAPI : 저희는 훽스트 (2,000 1)과 핵 염색을 수행하는 것이 좋습니다.
  4. PBS에서 3 회 세척 한 후, PBS 50 μL에 재현 탁 선박.

8. 설치 및 관측

  1. 실리콘이 유리 모세관과 팁을 준비 : 메스를 사용하여 P200 피펫 팁을 절감하고 내부의 모세관을 조정합니다. 모세관의 부피는 대략 40 μL이다.
  2. 실리콘이 유리 모세관을 사용하여 유리 슬라이드에 혈관을 전송하고주의 깊게 흡수 종이로 액체를 제거합니다.
  3. 선박에 장착 매체의 한 방울을 적용하고 드롭 슬립의 가장자리를 따라 확산 할 수 있도록 45도에서 커버 슬립을 개최합니다. 커버 슬립을 가자와 매체가 서서히 확산 할 수 있습니다. 그것은 건조 O / N 실온에서 빛으로부터 보호하자. 선박은 fluoresc으로 관찰 할 수있다엔트 공 초점 현미경.

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결과

여기서는. 뇌 혈관 (14)의 기계적 분리를 허용하는 프로토콜을 기술 한이 기술의 주요 단계를 요약 한 도표. 뇌 혈관의 구조는 복잡하고 여러 유형의 세포를 포함한다 즉, 내피 세포 단단히 접합하여 밀봉하고, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 세포 및 발 공정 (9)에 의해 둘러싸여. 따라서, 뇌 혈관의 단리는 다음, 우리는 프로토콜의 두번째 부분에 기재된 바와 같이 면역 염색에 의해 정제하여 혈관의 구조를 특성화하기 위해 목표. 아 그린, 내피 기초 얇은 판의 구성 요소는 지속적으로 균일 내피 표면 (그림 2A)로 분류 하였다. 조나가 occludens-1 (ZO-1), 내피 꽉 접합 구성 요소 중 하나는 접합부가 꽉 내피 (도 2B)를 보존되었음을 시사 명백한 불연속로 면역 염색 하였다. 혈관 주위 세포 내피 범위, 라벨이전에 25

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토론

혈액 - 뇌 장벽의 CNS 내 및 생체 물질의 흐름을 조절 및 혈액에 존재하는 유해 물질에 대해 자신을 보호. 그것은 신경 퇴행성 질환 2, 뇌종양 (28)를 포함하여 여러 중추 신경계 병변에 참여하고있다. BBB의 매우 낮은 투과율 역시 신경 세포 및 뇌 연구 (3)의 매우 활성 인 필드에 대해 유해한 영향을 가역적으로 BBB를 열하려는 방법의 개발을 목표로 치료제의 통과를 방해한다. 많은 노력이 설치류의 뇌에서 용기를 단리위한 유용한 모델 및 BBB의 세포 및 분자 약리학 적 조사를 허용하는 기술, 특히, 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 첫 번째 시도는 단순히 뇌 실질 세포 (13) 오염 폐기 변수 기공 크기의 메쉬를 사용하여 기계적으로 해리 뇌 조직에서 미세 혈관을 수집, 29, 30, 31. 밀도 구배 원심 분리에 대해서는 열 32, 33, 15 나일론 메쉬 또는 유리 구슬 뇌 혈관 여과 ...

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공개 사항

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감사의 글

이 작품은 LABEX MemoLife에 의해 ARSEP에 의해 지원되었다 (Fondation 라 공들인 쉬르 라 sclérose EN 플라크 라모 보좌관을 부어)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
티슈 그라인더 사이즈 C토마스 사이언티픽3431E25
원심분리기 5415  REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
고성능, 모듈식 실체현미경LeicaMZ6
컴팩트 시스템으로 고품질 Leica LED1000LeicaLED1000
저결합 팁 제공(P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm 필터 홀더 PP 8/PkMilliporeSX0004700
나일론 네트 필터 디스크 친수성 20 &마이크로; m 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
나일론 네트 필터 디스크 친수성 100 &마이크로; m 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
표준 벽 붕규산 튜빙셔터 기기B150-86-7.5
현미경 슬라이드Thermo Scientific1014356290F
커버 슬립, 두께 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml 얇은 벽 튜브와 돔형 캡Thermo ScientificAB-0266
  PARAFILM M (롤 크기 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음Life technology14175-129
hepes (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
소 혈청 알부민시그마A2153
10x PBSEuromedexET330
16% 포름알데히드 (w/v), 메탄올 프리 Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
장착 매체 Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Griffonia simplicifolia의 Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 conjugate; 희석 1/100Life technologyI21411
Agrin (토끼) ; 희석 1/400Dr Markus A Ruegg
제공 Anti ZO-1 (마우스, 클론 1A12)Life technology33-9100희석 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (마우스, 클론 1A4)SigmaA2547  희석 1:500
Anti GFAP (마우스, 클론 GA5)SigmaG3893  희석 1:500
Anti AQP4 (토끼)SigmaA5971  희석 1:500
Anti Cx43 (마우스, 클론  2)BD Biosciences610061  희석 1:500
Anti Olig2 (토끼)MilliporeAB9610  희석 1:200
Anti NF-M(마우스)스위스 로잔 대학교의 Beat M. Riederer 박사 제공.  희석 1:10
안티 이바1 (토끼)와코019-19741  희석 1:400
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG (H+L) 항체생명 기술A11029  희석 1:2,000
염소 항-토끼 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034  희석 1:2,000
Alexa Fluor 555 염소 안티-마우스 IgG (H+L) 항체생명 기술A21424  희석 1:2,000
염소 항-토끼 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 555 접합체Life technologyA21429  희석 1:2,000

참고문헌

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