여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
역기능 골격근의 미토콘드리아 노화, 비만과 형 당뇨병으로 관찰 변경된 대사의 역할을한다. 절연 미토콘드리아 제제로부터 미토콘드리아 호흡계 분석법은 약물 대사를 조절하는 단백질의 작용기구 (S)의 미토콘드리아 기능의 평가뿐만 아니라, 판정이 가능. 현재 분리 절차는 종종 호흡계 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아를 수득 조직 대량을 요구한다. 본원에 제시된 방법 (~ 450 μg의)는 높은 처리량 호흡 측정에 사용하기 위해 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 분리 할 수있는 방법을 고품질로 정제 미토콘드리아 설명한다. 우리는 우리의 분리 방법은 분광 시트르산 합성 효소 활성을 측정하여 92.5 ± 2.0 %의 미토콘드리아 손상을 산출 것으로 판정. 또한, 고립 된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석은 cytoso의 희미한 식의 결과LIC 단백질, GAPDH 및 미토콘드리아 단백질, COXIV의 강력한 표현. 단리 된 미토콘드리아에 띄는 GAPDH 밴드의 부재는 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염을 나타낸다. 가장 중요한 것은, O (2) 소비 마이크로 플레이트 기반 기술과 속도와 고도의 결합을 보여줍니다 결합 호흡계 분석을위한 호흡 조절 비율 (RCR) 결정의 측정 (RCR을, 모든 분석을위한> 6) 및 기능 미토콘드리아. 결론적으로, 별도의 닦지 단계 첨가 및 상당히 이전에보고 된 방법의 모터 구동 균질화 속도를 감소시키는 것은 높은 기능 호흡 고도로 결합 미토콘드리아 결과 마우스 골격근의 소량으로부터 고품질 정제 미토콘드리아의 분리를 허용했다 마이크로 기반 respirometirc 분석 중.
서론
미토콘드리아의 주요 기능은 산화적 인산화로부터 ATP를 생성하는 것입니다. 그러나 미토콘드리아는 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 칼슘 조절, 세포 기관 이동, 이온 항상성 및 세포사멸 관여를 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 많은 중요한 세포 기능을 가지고 있습니다1,2. 따라서 기능 장애 미토콘드리아가 노화, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 암, 비만 및 당뇨병과 같은 많은 질병 병리학에서 역할을 한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다3,4. 중요한 것은 골격근 미토콘드리아가 특히 이러한 많은 병리에 관여한다는 것입니다3-5.
분리된 미토콘드리아를 사용하는미토콘드리아 호흡 분석은 전자 전달 사슬 및 산화적 인산화 기능을 평가하고 신진대사를 조절하는 약물 및 단백질의 작용 메커니즘을 결정할 수 있도록 합니다. 미토콘드리아 분리 절차는 다양한 종의 여러 조직 및 세포 유형에 대해 존재합니다6,7. 그러나 이러한 절차는 고전적인 호흡 측정 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아 수율을 위해 많은 양의 조직/세포를 필요로 하는 경우가 많습니다.
마이크로플레이트 기반 호흡기 분석기 분석은 최소한의 분리된 미....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물 실험 기관 동물 관리에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서위원회를 사용했다.
1. 설정 (시간 : ~ 45 분)
- 37 ° C의 물을 욕조에 미토콘드리아 (IBM) 1 IBM2 0.25 % 트립신, 절연 버퍼의 해동 냉동 저장합니다.
- 유리 및 고순도 물 다음 70 % 에탄올에 해부 악기를 씻어.
- 4 부 IBM1 1 부 트립신을 희석하여 0.25 % 트립신 재고에서 0.05 % 트립신 솔루션을 준비합니다.
- 스크류 캡과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 : (100 비율 1) 세포 용해 버퍼와 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제 칵테일을 섞는다.
- 분취 량 5 ml를 15 ml의 플라스틱 튜브에 0.05 % 트립신 (5 ㎖ / 마우스).
- 설정된 모터 80 RPM으로 조직 균질기를 구동.
골격근 미토콘드리아 2. 분리 (시간 : ~ 90 분)
- CO 2로 마우스를 안락사 흡입,.
- 다음 단계에 설명 된대로 가자미근 (~....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
시트 레이트 신타 제 활성은 시트 레이트 신타이 양막 미토콘드리아 현탁액으로 존재해서는 안 따라서 미토콘드리아 내막에 위치되고, 이후 막 무결성을위한 수단으로서 기능한다. (1)이 초음파에 비해 비 초음파 미토콘드리아 시료에 시트 레이트 신타 제 활성을 나타내는 도표 같은 격리에서 샘플. 시트 레이트 신타 제 활성의 유의 한 증가 미토콘드리아 결과 (P <0.01)를 초음파 처리. 중요한 것은, 미토콘드리아의 92.5 ± 2.0 %는 격리 다음 그대로 있었다.
도 2는 고립 된 미토콘드리아 및 전체 골격근 조직 파쇄물에서 GAPDH 및 COXIV 발현을 나타낸다. GAPDH는 세포질에있는 단백질이지만 COXIV는 미토콘드리아 내막에있는 단백질 동안 또한 후에 핵 전좌에서 찾을 수있다. GAPDH와 COXIV의 발현은 전체 담배 마는에서 분명 있습니다UE 해물. GAPDH의 희미한 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본원에 제시된 방법은 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 미토콘드리아로부터 분리 절차의 상세한 설명을 제공한다. 이 분리 절차는 O 2 소비율, RCR 값, 최대 시트 레이트 신타 제 활성 및 면역에서 단백질 발현에 의해 입증되는 바와 같이 높은 작동, 순수한 미토콘드리아 (~ 450 μg의)을 수득 할 수있다. 중요한 것은,이 과정에서 분리 된 미토콘드리아는 높은 처리량을 가능 마이크로 기반 O 2 소비 기술 respirometirc 여러 분석에 사용될 수있다.
골격근의 미토콘드리아의 분리는 종종 결합 조직과 구조 단백질 7,16 주변에서 미토콘드리아를 해방 가혹한 방법을 필요로한다. 결과적으로, 미토콘드리아 막에 따라서 후속 respirome 미토콘드리아 동안 O 2 소비 활동 (및 정확도) 손상, 파괴 될 수있는⚻에 정해진 분석. 전술 한 프로토콜을 (7)에 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
George Rogers는 이 프로토콜이 수정된 기기를 생산하는 Seahorse Bioscience의 직원입니다.
감사의 글
버지니아 공대의 프랄린 생명과학 연구소(Fralin Life Science Research Institute)와 대사 표현형 코어(Metabolic Phenotyping Core)가 이 작업을 지원했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | 시그마 Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA 시그마 Aldrich | E6511 | N/A | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| 자당 | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-만니톨 | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| 트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드 | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| 염화나트륨 백색 결정 또는 결정성 분말 ≥ 99.0 % | Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| 도데실황산나트륨 | 시그마 Aldrich | L3771 | 해당 사항 없음 |
| 나트륨 데옥시콜레이트 | 시그마 알드리치 | D6750 | 해당 사항 없음 |
| 폴리옥시에틸렌 (12) 노닐페닐 에테르, 분지형 | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| 단일 모서리 면도날 | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM 나일론 세포 여과기 | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| 정지 프로테아제 & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브(스크류 캡 포함 | ) Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| 산화지르코늄 비드 | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH 항체 (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV 항체 | 세포 신호 | 4844s | 모든 미토콘드리아 내막 단백질은 |
| Peroxidase conjugated affinipure 당나귀, 안티 토끼 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| 피루브산, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | 4°C에 보관; 호흡량 측정 분석에서 사용하기 전에 C, pH 7.4, KOH |
| 신산 | 시그마 알드리치 | S9512 | 사용하기 전에 실온에서 보관, KOH와 함께 pH 7.4로 저장 |
| ; 95% | Sigma Aldrich | M6413 | 실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지 L |
| -글루탐산 | Sigma Aldrich | G1251 | 실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지, 호흡량 분석 |
| Palmitoyl L-카르니틴 클로라이드 Sigma | Aldrich | P1645 | -20°C에서 보관 |
| 올리고마이신 A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | -20 °에 저장; C |
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) | 시그마 알드리치 | C2920 | 2-8 °에 저장; C |
| 페닐히드라존 | |||
| ≥ 98% (TLC), 분말 [FCCP] | |||
| 스트렙토마이세스 sp.에서 추출한 안티마이신 A. | 시그마 알드리치 | A8674 | -20 °에 저장; C |
| 아데노신 5&프라임;-디포스페이트 모노칼륨 염 탈수 [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | -20 °에 저장; C, 호흡량 분석 |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | 실온에서 보관 |
참고문헌
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
