방법 논문

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

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DOI:

10.3791/53217

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2015년 11월 13일

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

이 논문에서

요약

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

초록

역기능 골격근의 미토콘드리아 노화, 비만과 형 당뇨병으로 관찰 변경된 대사의 역할을한다. 절연 미토콘드리아 제제로부터 미토콘드리아 호흡계 분석법은 약물 대사를 조절하는 단백질의 작용기구 (S)의 미토콘드리아 기능의 평가뿐만 아니라, 판정이 가능. 현재 분리 절차는 종종 호흡계 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아를 수득 조직 대량을 요구한다. 본원에 제시된 방법 (~ 450 μg의)는 높은 처리량 호흡 측정에 사용하기 위해 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 분리 할 수​​있는 방법을 고품질로 정제 미토콘드리아 설명한다. 우리는 우리의 분리 방법은 분광 시트르산 합성 효소 활성을 측정하여 92.5 ± 2.0 %의 미토콘드리아 손상을 산출 것으로 판정. 또한, 고립 된 미토콘드리아의 웨스턴 블롯 분석은 cytoso의 희미한 식의 결과LIC 단백질, GAPDH 및 미토콘드리아 단백질, COXIV의 강력한 표현. 단리 된 미토콘드리아에 띄는 GAPDH 밴드의 부재는 분리 과정 동안 비 미토콘드리아 소스로부터 조금 오염을 나타낸다. 가장 중요한 것은, O (2) 소비 마이크로 플레이트 기반 기술과 속도와 고도의 결합을 보여줍니다 결합 호흡계 분석을위한 호흡 조절 비율 (RCR) 결정의 측정 (RCR을, 모든 분석을위한> 6) 및 기능 미토콘드리아. 결론적으로, 별도의 닦지 단계 첨가 및 상당히 이전에보고 된 방법의 모터 구동 균질화 속도를 감소시키는 것은 높은 기능 호흡 고도로 결합 미토콘드리아 결과 마우스 골격근의 소량으로부터 고품질 정제 미토콘드리아의 분리를 허용했다 마이크로 기반 respirometirc 분석 중.

서론

미토콘드리아의 주요 기능은 산화적 인산화로부터 ATP를 생성하는 것입니다. 그러나 미토콘드리아는 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 칼슘 조절, 세포 기관 이동, 이온 항상성 및 세포사멸 관여를 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 많은 중요한 세포 기능을 가지고 있습니다1,2. 따라서 기능 장애 미토콘드리아가 노화, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 암, 비만 및 당뇨병과 같은 많은 질병 병리학에서 역할을 한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다3,4. 중요한 것은 골격근 미토콘드리아가 특히 이러한 많은 병리에 관여한다는 것입니다3-5.

분리된 미토콘드리아를 사용하는

미토콘드리아 호흡 분석은 전자 전달 사슬 및 산화적 인산화 기능을 평가하고 신진대사를 조절하는 약물 및 단백질의 작용 메커니즘을 결정할 수 있도록 합니다. 미토콘드리아 분리 절차는 다양한 종의 여러 조직 및 세포 유형에 대해 존재합니다6,7. 그러나 이러한 절차는 고전적인 호흡 측정 분석에 필요한 고품질 미토콘드리아 수율을 위해 많은 양의 조직/세포를 필요로 하는 경우가 많습니다.

마이크로플레이트 기반 호흡기 분석기 분석은 최소한의 분리된 미토콘드리아를 사용하여 고처리량 측정을 가능하게 하며, 종종 웰당 몇 μg에 불과합니다8. 따라서, 우리는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석에 사용하기 위해 더 적은 양의 마우스 골격근에서 고품질 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 발표된 방법7의 변형을 제시합니다. 또한, 미토콘드리아 분리 제제의 품질과 미토콘드리아 막의 무결성을 확립하기 위한 방법이 제공됩니다. 골격근 미토콘드리아가 많은 병리학적 상태에 관여한다는 점을 감안할 때, 기계론적 기반 연구에서O2 소비량 측정은 생물 의학 연구에서 더욱 보편화되고 있습니다9,10.

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프로토콜

동물 실험 기관 동물 관리에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서위원회를 사용했다.

1. 설정 (시간 : ~ 45 분)

  1. 37 ° C의 물을 욕조에 미토콘드리아 (IBM) 1 IBM2 0.25 % 트립신, 절연 버퍼의 해동 냉동 저장합니다.
  2. 유리 및 고순도 물 다음 70 % 에탄올에 해부 악기를 씻어.
  3. 4 부 IBM1 1 부 트립신을 희석하여 0.25 % 트립신 재고에서 0.05 % 트립신 솔루션을 준비합니다.
  4. 스크류 캡과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 : (100 비율 1) 세포 용해 버퍼와 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제 칵테일을 섞는다.
  5. 분취 량 5 ml를 15 ml의 플라스틱 튜브에 0.05 % 트립신 (5 ㎖ / 마우스).
  6. 설정된 모터 80 RPM으로 조직 균질기를 구동.

골격근 미토콘드리아 2. 분리 (시간 : ~ 90 분)

  1. CO 2로 마우스를 안락사 흡입,.
  2. 다음 단계에 설명 된대로 가자미근 (~ 75-100 mg의 총)을 포함하는 대퇴사 두근과 비복근 근육, 붉은 근육을 제거합니다 :
    1. 마우스쪽으로 피부 껍질.
    2. 대퇴사 두근 원점을 통해 지방 패드를 제거합니다. 뾰족한 가위로 슬개골에 부착 된 대퇴사 두근 건을 잘라.
      참고 : 대퇴사 두근은 근위 대퇴골의 앞쪽 부분에 자사의 해부학 적 위치로 식별됩니다.
    3. 뼈에서 대퇴사 두근을 해방, 대퇴 동맥을 피하면서 천천히, 뼈와 대퇴사 두근의 건막을 싹둑. 대퇴사 두근 근육을 해방하고 냉장 PBS의 대퇴사 두근 근육을 배치 대퇴골에 원점에서 뾰족한 가위로 힘줄을 잘라.
    4. 가위로 대퇴사 두근을 통해 눈에 보이는 지방 조직을 제거합니다. 그래서 대퇴골 위에 놓인 된 근육의 부분이 U를 향하도록 통해 대퇴사 두근 플립피. 패닝의 움직임에 집게로 대퇴사 두근 근육을 엽니 다. 냉각 IBM1 5 mL를 넣은 비커에 뾰족한 가위와 장소 각 로브에서 두 개의 눈에 보이는 붉은 근육 부분을 제거합니다.
      참고 : 대퇴사 근육 각 엽의 측면 가장자리 근처에있는 붉은 근육의 스트립 두 엽으로 나타납니다.
    5. 뾰족한 가위로 아킬레스 건을 덮는 피부를 잘라 마우스 향해 피부를 벗겨. 노출 아킬레스 건을 잘라 마우스의 몸으로 근육 껍질.
    6. 비복근을 해방하고 냉장 PBS에 그 힘줄에 부착 된 비복근을 배치 할 뾰족한 가위로 대퇴골의 외측과 내측 과두의 힘줄을 잘라.
    7. 이상 비복근 플립과 가자미 근육을 벗겨 차게 IBM1 5 mL를 포함하는 비커에 넣습니다. 팬 비복근을 엽니 다. 뾰족한 가위로 3 종류의 시각적 붉은 근육 부분 (두 측면과 하나의 내측 표면 빨간색 스트립)를 제거S 및 냉장 IBM1 5 ㎖을 함유하는 비이커에 옮긴다.
  3. (단계 2.2에 기재된 바와 같이) 마우스의 다른 레그에서 적색 근육의 또 다른 ~ 75 내지 100 mg의 분리하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 및 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 1 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 배치 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 소듐 도데 실 설페이트, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % 폴리 옥시 에틸렌 (9) 노닐 페닐이. 즉시 블 롯팅 웨스턴에서 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서이 제 2 샘플을 플래시 동결 분지 (단계 6.1 참조).
  4. 큰 양동이에 얼음에 미리 냉장, 평면 플라스틱 표면을 놓습니다. 플라스틱 표면에 IBM1 한 방울을 붓고 IBM1 방울의 단면 붉은 근육 (단계 2.2.4과 2.2.7)을 모두 배치 핀셋을 사용합니다. 변경 면도기 3 단일 에지 면도날마다 40 초를 사용하여 2 분 동안 근육 조직을 말하다.
  5. 제 위에 플라스틱 표면을 유지함으로써 새로운 IBM1 5 ㎖와 새로운 비이커 다진 조직을 이동시켜전자 비커와 면도날로 비커에 근육을 긁어. 이 솔루션을 가지고 50 ML 원뿔 튜브에 배치 된 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 배출.
  6. 섬세한 작업 와이퍼와 조직을 가릴 후 0.05 % 트립신 용액 5 ㎖로 옮긴다. 작업 와이퍼에서 조직을 제거하는 핀셋을 사용합니다.
  7. 0.05 % 트립신 용액에서 30 분 동안 얼음에 근육 조직을 배양한다.
  8. 4 ℃에서 3 분 동안 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브 포함 트립신 / 근육 혼합물을 스핀.
  9. 폐기물 용기에 트립신 뜨는을 붓고 얼음 3 ㎖ 차가운 IBM1와 펠렛을 재현 탁. 45 ㎖의 유리 균질 튜브에 조직을 전송합니다. 나머지 샘플을 수집하고 유리 균질 관이를 추가하는 또 다른 1.5 ml의 IBM1에 15 ml의에게 원뿔 튜브를 씻어.
  10. 유리 균질이 비커 내에서 최소한의 이동 때문에 얼음 비커 또는 플라스틱 용기 충전 중간에 유리 균질 튜브를 놓습니다.
  11. 80 rpm으로 10 패스와 모터 구동 조직 균질에 부착 된 PTFE와 유 봉, 조직 / IMB1 혼합물을 균질화. ~ 2 초 동안 각 패스의 바닥을 잡으십시오.
  12. 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 조직 파쇄 옮기고 IBM1 6.5 ml의 균질화 유리 튜브를 헹군다. 조직 균질 물을 포함하는 15ml의 원뿔형 튜브에 IBM1 붓는다.
  13. 4 ° C에서 10 분 동안 700g로 15 ml의 원추형 튜브 스핀. 부드럽게 유리 고강도 원심 분리기 튜브에 뜨는을 부어 펠렛을 폐기합니다.
  14. 4 ℃에서 10 분 동안 8,000 XG에서 위의 단계에서 뜨는 스핀.
  15. IBM1 상층 액을 제거하고 천천히 IBM2 500 μl를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 피펫 팁의 끝을 잘라 부드럽게 혼합 운동을 교반 IBM2에 펠릿을 균질화. 펠렛가 완전히 정지 한 후 혼합물에 IBM2의 또 다른 4.5 ML을 추가합니다.
    T와 같은 더 큰 펠릿 조각을 파괴하면서 과도한 분쇄를 피하십시오 : 주자신은 미토콘드리아의 세포막에 손상을 줄 수 있습니다.
  16. 4 ° C에서 10 분 동안 8,000 XG에 IBM2 / 조직 파쇄 스핀.
    주의 :이 단계는 총 단백질 함량에 기여할 수있다 잔류 BSA 4 단계 이후에 격리 미토콘드리아 단백질보다 정확한 정량 깨끗한 고강도 원심 분리 튜브에서 반복 될 수있다.
  17. 부드럽게 뜨는 및 제거,하지만 완전히 차단의 포인트 피펫 팁과 IBM2의 두 25 μL 단위를 추가하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 부드럽게 저어 IBM2 25 μL를 각각 첨가 한 후 펠렛을 섞는다. 얼음이 미토콘드리아 주식을 놓습니다.

전체 조직 해물 3. 균질화 (시간 : ~ 45 분; 단계에서 수행 할 수 있습니다 7)

  1. 즉, 단계 230에서 액체 질소에 넣고에서 근육을 제거하고 완전 해동 될 때까지 실온에서 배양한다.
  2. 뾰족한 가위로 얼음 ~ 30 초 동안 조직을 말하다.
  3. Zirco의 두 100 μL 개만 추가다진 조직을 포함 단계 3.2에서 스크류 캡으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 천년 산화물 비즈. 4-6 (매체 설정)의 속도 설정에서 3 개의 5 분주기를 이용하여 비드 밀 조직 균질 기에서 균질화 조직.
  4. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 단계 3.3에서 혼합물을 스핀. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스핀 및 전송 후 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 취소하고 얼음에 뜨는을 배치합니다.

4. 단백질 결정 (시간 : ~ 30 분)

  1. 제조업체의 사양에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 전체 조직 용 해물 (단계 3.4) 및 미토콘드리아 스톡 (단계 2.17)의 단백질 농도를 결정한다.

5. 미토콘드리아 막 무결성; 구연산 합성 효소 (CS) 활동 (시간 : ~ 15 분)

  1. 고순도 물에 미토콘드리아 주식의 20 희석 : 두 개의 1을 확인합니다. 더하다하나의 샘플에 트리톤 100-X의 0.1 % 및 낮은 설정 (765 와트, 2의 진폭)에 그것을 초음파 처리. 얼음에 다른 희석 둡니다. 초음파 후 얼음에 샘플을 돌려줍니다.
  2. 시트 레이트 신타 제와 분석을 수행 모두 비 초음파 처리하고, 이전에 기술 된 바와 같이 (11, 12)을 분광 분석을 이용하여 미토콘드리아 희석액 초음파.
  3. 다음 식을 사용하여 그대로 미토콘드리아 막의 비율을 결정 :
    (비 초음파 CS 활성 ÷ 초음파 CS 활성) * 100


N은 100- (퍼센트 위에서 달성)

6. 미토콘드리아 격리 품질; 웨스턴 블로 팅 (시간 : 실험실 프로토콜에 따라)

  1. 이전 12 설명 된대로 전체 조직 해물과 격리 된 미토콘드리아에 웨스턴 블로 팅을 수행합니다.
    참고 : GAPDH에 대한 사용 차 항체 (1 : 1000 희석 5 %의 BSA / TBS-T) 및 COXIV (1 : 1,000 희석 5 % 무 지방우유 / TBS-T 각각 반 염소, 토끼 이차 항체 (1 다음에) : 10,000).

7. 호흡계 분석 실행 (시간 : ~ 90 분)

  1. 전술 한 바와 같이 마이크로 기반 O 2 소비량 측정 기술을 이용하여 원하는 분석을 수행 호흡계 (컴패니언 문서 및 로저스 외 8 참조).
  2. 주 4O (RCR)에 의해 상태 3 분할 또는 주 4O 의해 주 3U 나누어 호흡 조절 비율 (RCR)를 결정한다. RCR을 결정할 때 포인트 - 투 - 포인트 흔적에서 중간 (평균) 점, 또는 가장 높은 (주 3), 저렴한 가격 (주 섭씨 40도)를 사용합니다.

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결과

시트 레이트 신타 제 활성은 시트 레이트 신타이 양막 미토콘드리아 현탁액으로 존재해서는 안 따라서 미토콘드리아 내막에 위치되고, 이후 막 무결성을위한 수단으로서 기능한다. (1)이 초음파에 비해 비 초음파 미토콘드리아 시료에 시트 레이트 신타 제 활성을 나타내는 도표 같은 격리에서 샘플. 시트 레이트 신타 제 활성의 유의 한 증가 미토콘드리아 결과 (P <0.01)를 초음파 처리. 중요한 것은, 미토콘드리아의 92.5 ± 2.0 %는 격리 다음 그대로 있었다.

도 2는 고립 된 미토콘드리아 및 전체 골격근 조직 파쇄물에서 GAPDH 및 COXIV 발현을 나타낸다. GAPDH는 세포질에있는 단백질이지만 COXIV는 미토콘드리아 내막에있는 단백질 동안 또한 후에 핵 전좌에서 찾을 수있다. GAPDH와 COXIV의 발현은 전체 담배 마는에서 분명 있습니다UE 해물. GAPDH의 희미한 ...

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토론

본원에 제시된 방법은 마우스 골격근의 최소량 (~ 75-100 mg)을 미토콘드리아로부터 분리 절차의 상세한 설명을 제공한다. 이 분리 절차는 O 2 소비율, RCR 값, 최대 시트 레이트 신타 제 활성 및 면역에서 단백질 발현에 의해 입증되는 바와 같이 높은 작동, 순수한 미토콘드리아 (~ 450 μg의)을 수득 할 수있다. 중요한 것은,이 과정에서 분리 된 미토콘드리아는 높은 처리량을 가능 마이크로 기반 O 2 소비 기술 respirometirc 여러 분석에 사용될 수있다.

골격근의 미토콘드리아의 분리는 종종 결합 조직과 구조 단백질 7,16 주변에서 미토콘드리아를 해방 가혹한 방법을 필요로한다. 결과적으로, 미토콘드리아 막에 따라서 후속 respirome 미토콘드리아 동안 O 2 소비 활동 (및 정확도) 손상, 파괴 될 수있는⚻에 정해진 분석. 전술 한 프로토콜을 (7)에 ...

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공개 사항

George Rogers는 이 프로토콜이 수정된 기기를 생산하는 Seahorse Bioscience의 직원입니다.

감사의 글

버지니아 공대의 프랄린 생명과학 연구소(Fralin Life Science Research Institute)와 대사 표현형 코어(Metabolic Phenotyping Core)가 이 작업을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Essentially FattySigma AldrichA6003N/A
Acid Free- BSA
Tris/HClPromegaH5123N/A
KCL시그마 AldrichP9541N/A
Tris BasePromegaH5135N/A
EDTA 시그마 AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
자당Sigma AldrichS7903N/A
D-만니톨Sigma Aldrich63559N/A
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드Thermo Scientific25200-056N/A
염화나트륨
백색 결정 또는 결정성 분말
≥ 99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
도데실황산나트륨시그마 AldrichL3771 해당 사항 없음
나트륨 데옥시콜레이트시그마 알드리치D6750 해당 사항 없음
폴리옥시에틸렌 (12) 노닐페닐 에테르, 분지형Sigma Aldrich238651N/A
단일 모서리 면도날Fisher Scientific12-640N/A
Falcon- 100 uM 나일론 세포 여과기Fisher Scientific352360N/A
정지 프로테아제 & Phosphatse Inhibitor CocktailThermo Scientific1861284N/A
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브(스크류 캡 포함) Thermo Scientific3474N/A
산화지르코늄 비드Fisher ScientificC9012112N/A
GAPDH 항체 (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
Anti- COXIV 항체세포 신호4844s모든 미토콘드리아 내막 단백질은
Peroxidase conjugated affinipure 당나귀, 안티 토끼 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA 단백질 분석 키트 Thermo Scientific23225N/A
피루브산, 98%Sigma Aldrich1073604°C에 보관; 호흡량 측정 분석에서 사용하기 전에 C, pH 7.4, KOH
신산시그마 알드리치S9512사용하기 전에 실온에서 보관, KOH와 함께 pH 7.4로 저장
; 95%Sigma AldrichM6413실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지 L
-글루탐산Sigma AldrichG1251실온에서 보관, 호흡량 분석에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지, 호흡량 분석
Palmitoyl L-카르니틴 클로라이드 SigmaAldrichP1645-20°C에서 보관
올리고마이신 A, ≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351-20 °에 저장; C
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)시그마 알드리치C29202-8 °에 저장; C
페닐히드라존
≥ 98% (TLC), 분말 [FCCP]
스트렙토마이세스 sp.에서 추출한 안티마이신 A.시그마 알드리치A8674-20 °에 저장; C
아데노신 5&프라임;-디포스페이트 모노칼륨 염 탈수 [ADP]Sigma AldrichA5285-20 °에 저장; C, 호흡량 분석
RotenoneSigma AldrichR8875실온에서 보관
숙 호흡량 분석 L(-) 말산, BioXtra, &ge에 에 사용하기 전에 KOH와 함께 7.4까지 에 사용하기 전에 KOH로 7.4까지

참고문헌

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  2. Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
  3. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
  4. Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
  5. Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
  6. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
  8. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746(2011).
  9. Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
  10. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
  11. Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
  12. Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
  13. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
  14. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
  15. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
  16. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
  17. Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
  18. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

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