Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF)은 독특한 피브린 구조, 풍부한 혈소판 및 풍부한 성장 인자를 가진 자가 혈소판 농축액의 FDA 승인 제제를 나타냅니다. 여기에서는 L-PRF의 체어 사이드 생성을 위한 프로토콜을 제시하고 단축 테스트 및 봉합사 유지 강도 테스트를 포함한 기계적 특성을 평가합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자가 혈소판 농축액은 재생 의학 분야에서 유망한 혁신적인 도구이며 구강 수술에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 겔 또는 현탁액인 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 달리 Leukocyte-Platelet Rich Fibrin(L-PRF)은 항응고제가 포함되지 않은 전혈에서 체어 사이드에 생성된 고체 3D 피브린 멤브레인입니다. 이 막은 농축된 혈소판과 풍부한 성장 인자를 가진 조밀한 3차원 섬유소 매트릭스를 가지고 있습니다. L-PRF는 우수한 취급 특성과 상처 부위에 대한 봉합성으로 인해 수술에서 인기 있는 보조 약물입니다. 이 연구의 목표는 생성을 입증하고 임상 성공의 기초가 되는 L-PRF의 관련 특성에 대한 자세한 특성을 제공하는 것입니다.
서론
다양한 임상 상황에서 상처를 봉합하고 치유를 개선하기 위해 혈액 및 혈액 유래 제품을 사용하는 것은 주로 피브리노겐 농축액인 피브린 접착제로 시작되었습니다. 피브린 접착제에 혈소판을 첨가하면 혈소판의 강도가 향상되었을 뿐만 아니라 신생 혈관 형성과 재생이 촉진되었습니다. 이러한 이점은 활성화 시 혈소판의 알파 과립에서 다양한 펩타이드 성장 인자를 방출하는 데 기인합니다1. 혈소판 농축액(PC)은 성장 인자를 전달하는 실용적인 방법으로 간주되었으며2 연구 특성화보다는 상업적 이익에 의해 사용이 주도되었습니다3. 실제로, PC는 균질하고 정의된 약리학적 제제와 달리 특성화하기 어려우며, 피브린 기질 내에 갇힌 신호 분자와 혈액 세포(혈소판 및 백혈구)의 포푸리입니다. 다양한 상용 및 독점 제제는 세포 구성, 성장 인자 회복 및 방출4의 역학이 다른 다양한 PC를 생성합니다.
대부분의 구강 수술에서 혈소판 풍부 혈장(PRP) 제제는 혈소판 현탁액이 아닌 개방 수술 상처의 젤로 사용된다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 이러한 상황에서는 트롬빈(thrombin), 염화칼슘(calcium chloride), 배트록소빈(batroxobin) 또는 다른 제제의 첨가에 의해 겔화가 유도되고 손상 부위에 직접 배치된다5. 빠른 활성화로 인해 피브리노겐 중합은 종종 불완전하며 기계적 강도가 거의 없는 부서지기 쉬운 피브린 겔이 생성됩니다. 또한 주사 가능한 PRP 젤은 빠른 섬유소 용해를 겪습니다6,7.
대조적으로, 혈액 응고(피브리노겐 중합), 혈소판 농축 및 활성화 과정은 L-PRF8의 제조에서 동시에 발생합니다. 응고 폭포는 전혈이 건조한 유리관의 벽과 접촉할 때 촉발되며 원심분리 과정 내내 계속됩니다. 그 결과 외과적으로 처리하고 사용할 수 있는 기계적으로 강한 혈전(L-PRF)이 형성됩니다.
L-PRF는 최적의 준비 방법, 성장 인자 방출 및 세포 분포9-11 측면에서 조사되었지만 이러한 멤브레인의 상세한 기계적 특성화는 부족합니다. 이는 임상 실습에서 이러한 멤브레인의 인기와 생체 재료로 사용될 수 있는 잠재력을 감안할 때 지식의 상당한 격차입니다. 현재 연구는 L-PRF를 유도하기 위한 프로토콜과 기계적 특성을 연구하는 데 사용할 수 있는 방법에 중점을 두고 있습니다. 이 데이터는 이 흥미로운 천연 생체 재료의 점탄성 특성을 조사하는 진행 중인 연구의 기준선 역할을 하기 위한 것입니다.
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프로토콜
모든 혈액 그리기 절차는 허가 및 인증 전문가에 의해 수행되어야합니다. 연구를위한 인체의 사용은 임상 시험 심사위원회 또는 기타 적절한 권한 승인을 포함한다. 동의서에 관한 및 참가자 식별을 보호하는 특별주의 사항을 따라야합니다. 이 프로토콜에 나와있는 모든 실험은 인간의 혈액 및 / 또는 혈액 제품과 적절한 개인 보호 장비의 처리는 항상 착용해야합니다 포함한다. 폐기물은 생물로 간주 규정에 따라 처리해야한다.
1. 정맥 천자
- 환자 / 참가자를 확인하고 기존의 기록을 확인합니다. 세부 연구를 설명하고 동의를 얻을.
- 평평하고 안정된 표면에 표시 튜브와 개별 환자에 대한 설정 트레이가 있습니다.
- 절차를 설명하고 지원 팔을 편안하게 환자 좌석을 확인합니다. 환자 자신 또는 SH 알리전자는 작은 핀치를 느낄 것이다 및 절차 전반에 걸쳐 여전히 남아 있어야한다.
- 어댑터에 바늘을 연결합니다.
- 손을 씻고 장갑을 착용하십시오.
- 바깥쪽으로 중심에서 동심원 70 % 이소 프로필 알코올로 청소하여 정맥 천자에 대한 전주 포사를 준비합니다. 30 초 동안 자연 건조 사이트를 허용합니다.
- 촉진하여 적절한 정맥을 확인합니다.
- (아직 반경 펄스를 느끼면서) 너무 꽉 있는지 만드는 천자 사이트 위의 지혈대 3-4을 적용합니다.
- 하나의 부드러운 동작으로 피부에 바늘 15 ~ 30 도의 경사를 삽입하여 정맥 천자를 수행합니다. 바늘을 통해 혈관을 누르고 전체 혈액의 9 ml의를 수집합니다.
- 지혈대를 제거합니다. 바늘에서 튜브를 제거합니다.
- 바늘을 철회하고 바늘을 제거하기 전에 천자 부위에 거즈 광장을 적용합니다. 적절한 생물 학적 용기에 바늘을 폐기하십시오.
- 홍보 유지하기 위해 환자에게 문의펑크 사이트에서 essure.
- 튜브 레이블
- 출혈이 중지 확인하기 위해 천자 사이트를 확인하십시오.
- 환자가 (통증이 팽창하거나 빛 머리가) 확실히 느끼고 있는지 물어, 거즈 광장을 통해 접착 붕대 나 테이프를 적용
- 배출하기 전에 환자 / 참가자 감사합니다.
2. L-PRF 준비
- 바로 붉은 얹어 건조 유리 튜브에 정맥 채혈 한 후, 원심 분리기에 넣습니다.
- 적절한 카운터 밸런스를 배치 한 후 실온에서 12 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
- 주기의 끝에서 튜브를 제거한다. 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP), 혈소판 풍부 피브린 (L-PRF) 및 적혈구베이스 (그림 1) : 세 개의 층을 확인할 수 있습니다.
- 피펫을 사용하여 PPP를 대기음. 사용 핀셋 부드럽게 L-PRF를 당겨 멸균, 천공 금속 메쉬에 넣습니다.
- 외과 용 메스를 사용하여 조심스럽게 버프 떠나는 RBC 층의 벌크를 긁어Y 코트 그대로.
- 부드럽게 30 초 동안 (멸균 금속 플레이트, 대략적인 무게 225g 사용) L-PRF 응고를 압축. 혈소판 가난한 플라즈마는 압착된다.
- 플레이트를 제거하고 부드럽게 L-PRF 막을 올립니다. L-PRF 막은 실험 12에서 사용하기위한 준비가되어있다.
3. 일축 인장 시험
- 취급의 용이성을 위해 여과지에 놓고 L-PRF 막 (N = 6)과 (7.5 mm의 게이지 길이 자신의 좁은 지점에 폭 2.75 mm)를 주문 제작 금속이 죽었을 사용하여 "개 뼈"에 펀치.
- 세 지점에서 각 샘플의 두께를 측정하고 평균을 취.
- 신중 축성 테스트 시스템의 턱 그립의 중앙에 L-PRF 막 결합.
- 조심스럽게 L-PRF 막을 노출 파일러 용지 지원을 찢어.
- 프로그램 장비 가동 헤드가 일정한 속도 (10.0 mm / 분)로 작동되도록 할 때 L- 실험을 시작할PRF는 아직 젖어있다.
- 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.
4. 봉합 유지 강도
- 장소 L-PRF 처리의 용이성을 위해 여과지에 멤브레인 (N = 3)과 수술 메스를 사용하여 측정 시료의 직사각형 (10mm X 25mm)로 잘라.
- 각 시료 ((3)의 평균)의 두께를 측정한다.
- 스테인리스 교정 결찰 와이어 (지름 220 μm의)을 사용하여 시료의 중심에 핀홀을 만든다.
- 루프를 형성하고, 인장 시험기에 그것을 해결하기 위해 핀홀을 통해 합자 와이어를 전달합니다. 아래턱 그립 (13)에 L-PRF 멤브레인의 가장자리를 놓습니다.
- 이동 헤드가 일정한 속도 (10mm / 분) 시작에서 작동되도록 기기를 프로그래밍실험.
- 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.
5. 형태 학적 검사
- 10mm 피부 생검 펀치를 사용하여 현미경 검사의 L-PRF 샘플을 준비하고 24 웰 플레이트에 배치합니다.
- PBS로 샘플을 씻고 20 분 (PBS)에 2.5 % 글루 타르 알데하이드로 고정한다.
- 순차적으로 5 분마다의 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 %) 증가에 침지하여 시험편 탈수.
- 5 분 동안 100 % HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔) 0.5 ㎖로 처리한다. HMDS (14) 초과 제거 O / N을 공급하십시오.
- 양면 테이프를 이용하여 스터브에 마운트 샘플은 70 초 동안 백금 스퍼터 코팅 및 가속 작동 주사 전자 현미경으로 검사또한 알고리즘 20 kV의 전압 (또는 적절한 설정).
L-PRF, 트립신 감수성과 닌히 드린 분석 6. Genipin 가교
- genipin 가교 L-PRF를 준비하려면, PBS로 세포막을 씻어 48 시간 동안 (70 % 에탄올) 1 % genipin 용액 4 mL에 흠뻑 젖어. 초과 genipin (15), (16)를 제거하기 전에 실험에 PBS로 씻어.
- 트립신 분해에의 저항에 의해 L-PRF의 genipin 가교의 안정성을 평가합니다. 장소 L-PRF 막 (N = 3), 0.01 % 트립신 500 μL에 가교 L-PRF genipin 트립신의 일일 변화로 3 일 동안 37 ℃에서 배양 하였다.
- 시작에 노출 하루 3에서 차이를 효소와 무게는 효소 분해 (17)를 나타냅니다 종료 1 일 이전에 샘플의 무게를 측정.
- 닌히 드린 시험을하여 처리 genipin L-PRF (G-PRF)로 가교 결합의 양을 정량화. 먼저 표준 CURV를 준비E 글리신을 사용하여 (1 ㎜의 0.031 mM)을 곡선은 유리 아미노산 농도 (FAA)와 흡광도 사이의 관계를 수립한다.
- 2 % 1 ㎖와 샘플 열 PRF (w / v)의 100 ℃에서 15 분 동안 닌히 드린.
- 용액을 실온으로 냉각하고 50 % 에탄올 1.5 mL를 추가 할 수 있습니다.
- 적합한 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 분석한다.
- (15) 아래의 식을 이용하여 가교 결합 백분율을 결정
7. MTS 세포 증식 분석
- 80 %의 합류 단층을 얻을 때까지 T-75 플라스크에 최소 필수 중간 - 알파 수정 (αMEM)에서 MC3T3 (마우스 두개골 preosteoblasts)을 성장.
- 신선한 멸균 L-PRF 막 (세포 배양 후드 안쪽 L-PRF 튜브를 열)를 준비하고 새로운 세포 배양 접시에 막 전송.
- 대기음 플라스크에서 미디어와, PBS와 단층 린스 5 ml의 0.05 % 트립신을 추가 5 분 동안 37 오 C 배양기에 플라스크를 놓고, 5, 400 XG에서 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 플라스크의 내용물을 피펫 분.
- 부드럽게, 뜨는을 가만히 따르다 세포 펠렛을 깰 튜브를 누르고 신선한 α의 (MEM)의 4 ㎖로 다시 중단, 혈구에 세포 현탁액 (50 μL)와 트리 판 블루 (50 μL)의 혼합물을 분배하고의 수를 계산 세포
- 시드 막 내에 세포를 유지하기 위해 L-PRF 막 위에 배치 10mm 유리 클로닝 고리 내에 4 × 5 셀 (링 24 시간 후에 제거 될 수있다).
- 4 일에, 10 분 동안 PBS의 세 번에 구조를 씻어.
- 각 웰에 혈청이없는 배지 200 ㎕를 MTS 시약 1 ML을 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어.
- 490 nm에서 200 μL 씩에서 흡광도를 측정한다.
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결과
(상부, 중간 및 하부) 층이도 2에 도시 된 다른 섹션에서 L-PRF 응고의 주사 전자 현미경 이미지. 알 수있는 바와 같이, 상기 상부는 더 세포 주로 섬유소 네트워크로 구성된다. 중간 층은 자신의 활성화 및 탈과립의 증거와 혈소판 풍부하다. 하층은 백혈구 및 피브린 매트릭스 내에 포획 적혈구의 혼합물을 갖는다.
단축 인장 시험 및 봉합 고정 강도 시험 : 기계적 특성은 두 가지 모드에서 평가 하였다. 결과는 L-PRF의 점탄성 동작을 보여줍니다. 탄성률 (0.47 MPa의) 낮은 경우에도, 막 터프 (5 N · mm 휴식 에너지)이며 심각한 변형 (217퍼센트,도 3)을 견딜 수있다. 봉합 유지 테스트로부터의 데이터가, 멤브레인의 능력의 지표가 조직에 봉합하는, 상당히 힘든 제안차 변형 가능한 재료 (계수-0.2 MPa의, 변형 140 %, 에너지는 브레이크 3.2 N.mm) L-PRF에 (그림 ...
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토론
자가 혈소판 농축 때문에 성장 인자의 풍부 (18)의 재생 의료 분야에서 유망. 그러나, 이러한 제제는 종종 외과 적 조작이 매우 곤란하게 정의 구조 부족. 여러 번, 현탁액 젤은 예측할 수없는 결과를 초래, 배달의 현장에서 효과적으로 유지되지 않습니다. L-PRF는 혈소판의 발전에 큰 사전이 본질적으로 내포 된 혈소판과 회사 섬유소 막 인 것을 집중 나타냅니다. 이 고체 막은 우수한 핸들링 특성을 가지고, 안전하게 개방 수술 중 해부학 적으로 원하는 위치에 봉합 될 수있다. 그러나, 물리적 및 생물학적 특성은 상대적으로 알려져 있지 않다.
위에서 설명한 단계를 엄격하게 (그림 1)에 부착 할 때 L-PRF는 지속적으로 형성 할 것이다. 좋은 L-PRF 막 생성에 중요한 고려 사항 중 하나 인 TI나 채혈 및 원심 분리 사이에 지연. L-PRF 기술의 성공은 전적으로 통상적 분 이내에 원심 분리기 (19)에...
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어 그리고이 책과 관련된 관심의 알려진 충돌이 없는지 확인합니다.
감사의 글
이 프로젝트는 National Center for Advancing Translational Sciences의 CTSA(UL1TR000058)와 Virginia Commonwealth University의 CCTR 기부 기금의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 미국 국립중개과학발전센터(National Center for Advancing Translational Sciences) 또는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 대변하는 것은 아닙니다.
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재료
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