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방법 논문

미생물 학적으로 방해석 강수량 유도에 의해 중재

22.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53253

⸱

2016년 4월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Alberta, 2Department of Mechanical Engineering, York University, 3Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta

이 논문에서

요약

Sporosarcina pasteurii 박테리아를 사용한 미생물 유도 방해석 침전(MICP)에 대한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 침전된 탄산칼슘은 광학 현미경 및 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 특성화되었습니다. 또한 MICP에 노출되면 스펀지의 압축 강도가 증가하는 것으로 나타났습니다.

초록

여기에서 조사중인 특정 세균 (S.의 pasteurii)는 자연 효소 분해 효소의 분비를 통해 환경을 발생에 요소 (ureolysis)의 가수 분해를 유도하기 위해, 오른쪽 조건, 능력에 고유합니다. ureolysis이 과정은 화학 반응의 체인을 통해, 탄산 칼슘 침전물의 형성을 이끈다. 이것은 미생물 학적 유도 방해석 강수량 (MICP)로 알려져있다. MICP에 대한 적절한 배양 프로토콜은 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 마지막으로, 현미경의 다양한 모드 하에서 가시화 실험은 침전 과정의 다양한 양상을 이해하기 위해 수행 하였다. 광학 현미경과 같은 기술은, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 X 선 사진 전자 분광법 (XPS)을 화학적으로 최종 제품의 특성을 이용 하였다. 또한, 천연 다공성 매질의 내부에 기공이 막히게하는 석출물의 능력은 어디 스폰지 질적 실험을 통해 증명되었다막대는 길이 스케일의 범위의 기공 망을 모방 하였다. 균체를 함유하는 배양액에 침지 스폰지 바 인해 화학적 침전의 연속 공정에서 얻어진 그 기공의 막힘 경화. 경화 된 바 거의 변형과 동일한 중량을지지 할 수있는 반면, 압축 및인가되는 외력의 작용에 의해 압착된다 제어 스폰지 바 비교했을 때 강화 된 스폰지 바는 우수한 강도를 나타낸다.

서론

Sporosarcina pasteurii이 높은 알칼리성 환경 (pH를 ~ 10) 1 살아남을 수 그람 양성 세균과 (MICP) 2-4 미생물 학적 유도 방해석 강수량라는 현상의 원인 물질이 될 수있는 박테리아 종 중 하나입니다. MICP 탄산 칼슘의 침전은 적합한 환경 조건 하에서 특정 미생물에 의해 유발되는 것을 특징으로하는 공정이다. S. pasteurii 인해 특정 조건에서 MICP의 상당한 볼륨을 유도 가능한 에이전트로의 식별에 최근 몇 년 동안 중요성을 가정하고있다. 이러한 가능성은 사실에서 유래하는 S. pasteurii는 효소 분해 효소의 풍부한 양을 분비하는 고유 한 기능이 있습니다. 이 효소는 물 분자의 존재 하에서 우레아 가속 분해 (광범위하고 풍부한 공급 천연 생화학 화합물)을 촉진하는 촉매로서 작용한다. 반응의 폭포,이 과정 궁극적 통해LY는 음전하 탄산염 이온의 발생을 이끈다. 이러한 이온 차례로 마지막 탄산 칼슘 (방해석)의 침전물을 형성하는 양의 칼슘 등의 금속 이온과 반응; 따라서 라벨 MICP 5-9.

MICP 과정은 수십 10,11 알려져 및 연구되어왔다. 지난 몇 년간, MICP 엔지니어링 상향식 녹색 건설 12 대규모 구조 (13, 14) 및 탄소 제거 및 스토리지 (15, 16)의 개선을 포함하여 환경 광범위한 애플리케이션에 대해 조사되었다.

예를 들어, Cunnigham 동부 표준시 01시 07분. 알은 베레 사암 코어를 포함하는 고압 적당한 온도 유동 반응기를 설계 하였다. 반응기 세균 S. 접종시켰다 fridgidimarina 고압의 초 임계 이산화탄소를 주입, 세공 용적 내부 ​​미생물의 대량 축적의 조건 하에서을 메은 투과성이 95 % 이상 감소되었다하는 관찰되었다. Jonkers 및 슐 랑겐 (18)는 콘크리트의 자기 치유 과정에 대한 박테리아의 특수한 변형의 효과를 연구 하였다. 표면의 기공을 통해 입력 기공 네트워크로 전송 외부 물은 다시 MICP를 통해 구조 강도 도움이 휴면 박테리아를 활성화 할 것으로 예상된다. TOBLER (19) 등. S. ureolytic의 활성을 비교 한 대규모 MCIP를 선호하는 조건에서 원주민 지하수 ureolytic의 소우주로 pasteurii 것을 발견 S. pasteurii은 토착 공동체 전에 분해 효소 활동이 부족하더라도 방해석의 침전을 개선하기 위해 일관성있는 기능이 있습니다. MORTENSEN 20 et.al 토양 종류, 염화 암모늄, 염분 농도, 산소 농도 및 MICP에 세포의 용해 농도 등 외부 요인의 영향을 연구 하였다. 생물학적 처리 공정 RESP 매우 강력한 그들의 데모요법 파라미터 공간에서 넓은 변동이 수행되는 박테리아를 강화 적절한 농축 과정을 제공하는 다양한 대규모 교정 애플리케이션이 프로세스의 적합성을 입증 할. 필립스 동부 표준시 02시 01분. 알은 S. 주입 후 모래 열 및 사암 코어의 투자율과 강도의 변화를 연구하는 실험을 설계 pasteurii 문화. 파단 강도가 세 배 증가하면서 4 번 - 그들은 투과성이 감소하면서하였습니다.

S.의 pasteurii과 MICP의 역할은 활발한 연구 및 화학 침전의 메커니즘에 관한 몇 가지 문제의 주제는 아직 완전히 이해되지 않습니다 있습니다. 이것에 비추어,에 정확하게 배양 S.를 적절히 농축 스톡 일관된 표준 프로토콜 집합이 매우 중요 MICP를 달성하기 위해 pasteurii. 여기서 우리는 반복성과 재현성을 보장하는 엄격한 프로토콜을 설명합니다. 이 엄마nuscript는 S.을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다 pasteurii 적절 침전을 유도하는 배양 배지를 농축. 이 공정은 광학 및 주사 전자 현미경 (SEM) 및 X 선 사진 전자 분광법 (XPS) 등의 각종 현미경 기술을 통해 조사된다. 원고의 초점은 MICP의 과정에 있습니다. 잘 확립 된 표준 프로토콜 인 SEM과 SIMS 같은 절차는 별도로 설명하지 않는다.

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프로토콜

주 : 이하의 순서로 실험 프로토콜을 수행한다. 세균 배양 프로토콜이 제 1 절에 설명되어 있습니다 (또한 그림 1 참조). 제 2 절 외부 첨가제를 사용하여 배양 배지를 농축하기위한 프로토콜을 설명합니다. 3 장에서는 다중 모드 현미경을위한 프로토콜을 설명합니다. 모든 각 요소의 가중치는 분석 저울을 사용하여 측정 될 수있다. 각 용액의 부피 체적 실린더를 사용하여 측정 될 수있다.

참고 : - 자세한 내용은 제도적 안전 사무실에 문의 2. 적절한 바이오 안전성 프로토콜 섹션 1 따라야합니다.

1. 세균성 문화

  1. 문화 박테리아 - 한천은 중간 준비 플레이트
    1. 이러한 배양 접시, 플라스크로 장비와 재료를 조립, 트리스베이스, 염산, 한천, 밀리 포아 물, 산도 미터 etc.Sterilize 사용하기 전에 121 ° C에서 고압 증기 멸균하여 모든 컨테이너.
    2. 0.1 1 L 준비밀리 포어의 물 1 L로 15.75 g 트리스 -베이스를 혼합하여 트리스​​ 완충액 3 M 수용액. 원래 용액 (pH를 10.4)의 pH 레벨을 낮추기 위해 염산 (50 % 농도)의 2,800 μl를 추가합니다. = 9의 pH를 설정하여 pH 미터를 사용하여 지속적으로 확인합니다.
    3. 다음과 같이 두 부분으로 1 L 완충 용액을 나눈다 :
      1. 이 액 800 mL를 취하여. 400 ml의 각각의 두 부분으로 동등를 나눈다. 8g (NH 4) 2 SO 4, 다른 솔루션 용액 16g 효모 추출물 하나를 녹여.
      2. 솔루션 나머지 (200 ㎖)을 타고 100 ㎖ 각각의 두 부분으로 다시 나눕니다. 2g (NH 4) 2 SO 4 일에 섞는다. 4g 효모 추출물과 다른 4g 한천을 추가합니다.
    4. 별도 알루미늄 호일에 각각의 플라스크를 배치하고 오토 클레이브 테이프를 부착 한 후 4 솔루션을 압력솥.
      주 : 탁상용 오토 클레이브 장치가 사용되는 경우, 부피가 500 ㎖ (온도 및 압력을 자동으로 설정되어야ically) 부피의 함수로서 지정.
    5. 오토 클레이브에서 그들을 복용 후, 옆으로 단계 1.3.1 (아래)의 두 400 ml의 솔루션을 설정합니다. 200㎖의 용액을 가지고 두 개의 100 ㎖ 용액을 혼합한다. 12 배양 접시 - (10)에 혼합물을 부어.
  2. 문화 박테리아 - 한천 플레이트 샘플 준비
    1. 냉동고 (-80 ° C)에서 세균 주식을 제거하고 해동 할 수 있습니다. 제대로 해동 후, 세균 재고 및 바이오 안전성 후드 내부의 한천 플레이트를 배치합니다.
    2. Sporosarcina pasteurii 재고와 팁을 만연하기 - (10 μl를 선택하는 것이 좋습니다 0.5)이 가장 작은 크기의 마이크로 피펫을 선택합니다. 킬 마이크로 피펫 팁과 한천 플레이트. 48 시간 동안 31 ° C에서 비 진탕 배양기 내부의 줄무늬 한천 플레이트를 놓습니다.
    3. 48 시간 후, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 단일 식민지의 존재 여부를 검사 시각. 단일 콜로니가없는 경우, t에 배치그는 또 다른 24 시간 동안 인큐베이터.
    4. 단일 콜로니가 감지 될 때까지이 과정을 반복합니다. 시험 후 7 일을 초과하지 마십시오.
      주 : 단일 콜로니도 일주일 후, 다음이 단계를 제대로 따르지 않았습니다 전체 과정은 1 단계에서 반복해야한다는 결론이 나타나지 않는 경우.
  3. 문화 박테리아 - 최종 샘플 준비
    1. 두 개의 400 ml의 솔루션 (트리스 버퍼 + (NH 4) 혼합 2 SO 4 및 트리스 버퍼 + 효모 추출물 (1.5.1)이 함께 800 ml의 솔루션. 플라스크에이 용액 125 ml의 이동 구하십시오.
    2. 단일 콜로니의 고농도 영역을 식별하는 한천 판 표면의 시각적 검사를 수행한다. 조심스럽게 조금씩 이동 및 마이크로 피펫 팁과 식민지 중 하나를 휴식.
    3. 125 ml의 플라스크에 동일한 마이크로 피펫 팁을 찍어 전송받을 강력한 곱셈에 대한 세포의 충분한 수를 확인하기 위해 철저하게 저어. 삼일 - 150 rpm으로 2, 30 ℃에서 진탕 배양기에서 플라스크를 놓습니다. 이 후 - 삼일, 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다.
  4. 문화 박테리아 - 최종 세포 수
    1. 가산 단일 콜로니가 나타날 수 있도록 적어도 천만 (10-7)의 희석을 달성하기 위해 PBS를 사용하여 희석되지 않은 배양액의 연속 희석을 수행한다. 한천 플레이트 중 하나에 7 병렬 등거리 선을 그립니다.
      1. 위에서 볼 수있을 정도로 눈에 띄는 페트리 접시의 바닥면에 굵은 선을 그려이 작업을 수행합니다. 하나의 세그먼트로 비 희석 용액의 3 작은 방울을 삭제합니다. 1:10 희석 수득 인산염 완충액 (PBS) 9 ml의 비 희석 된 용액 1ml를 추가.
    2. 피펫이 새로 희석액의 작은 나누어지는 (~ 0.1 ㎖) 가지고 다음 세그먼트에 3 개의 작은 방울을 놓습니다. 새로운 플라스크에 추가로 희석 열 배 (10 배)에 의해 새로 희석액을 전송PBS를 추가. 이것은 10-2 또는 1로 희석을 가져온다 : 100.
      1. 다음 세그먼트에서 100 솔루션 :이 일을 사용합니다. 1000 끝까지 연속하여 새로운 플라스크로 옮기고 연속적 10-3 또는 1에서 더 희석 된 샘플들을 획득하기 위해 PBS에 직렬로 10 배 (10 배) 희석 그는 갓 희석 용액의 소량으로 가공이 반복 마지막 세그먼트에 아래에 10-7 1:10 만.
    3. 31 ° C에서 2 일 - 1 플레이트 배양 후 한천 플레이트에있는 세포의 수를 세어 단위 (CFU) 플레이트 카운트 콜로니 포밍 수행한다. 이 희석 시료의 세균 수의 정량적 측정을 제공합니다.
      주 : CFU 값 각 콜로니를 분리하고 생존 한 균체 설립라고 가정 영양 배지, 온도, 시간의 특정 조건하에 콜로니를 야기 할 수있는 시스템의 능력에 기초하여 측정된다.
    4. 봉인필름을 자체 밀봉 저장은 나중에 사용하기 위해 냉장고에 나머지 항목으로 배양 접시.

강수량을 가속화하는 영양소의 보충 2. 프로토콜

  1. 전송 몇몇 멸균 원심 분리기 튜브로 제조 된 배양액 (+ 세포 배지) 9 ㎖, 10 ㎖ 양의 각.
  2. 우레아 : 2g / L 염화 암모늄 : 새로운 배지에 다음 농도로 네 가지 구성 요소로 이루어진 외부 농축 100ml의 스톡 용액을 준비 1g / L을 탄산 수​​소 나트륨 212 ㎎ / ℓ, 염화칼슘 : 280 mg의 /엘. 조심스럽게 분석 균형을 사용하여 모든 성분을 측정하고 오토 클레이브에 신선한 비커 중간 위치 (121 ° C, 15 PSI, 15 분)를 제외한 모든 요소를​​ 섞는다.
    1. 오토 클레이브 후, 새로운 배지 1 ㎖와 우레아 (2 mg)을 필요한 양을 혼합하여 농축 과정을 완료 0.22 μm의 주사기 필터를 갖춘 주사기를 통과한다.
    2. 1 추가준비된 배양액 (+ 세포 배지) 9 mL를 함유 멸균 원심 분리기 튜브에 첨가물이 농축 배지 ㎖ (단계 2.1 참조).
      주 : 모든 성분, 상승 된 온도에서 분해되는 요소는, 오토 클레이브에서 멸균 될 수 없다. 다른 성분은 멸균 한 후 따라서, (121 ° C, 15 PSI, 15 분)을, 우레아 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 마지막으로 첨가된다.
  3. 소용돌이 각각의 튜브는 철저하게 기계 vortexer를를 사용. 30 ° C에서 비 진탕 배양기에서 농축 액체 (세포 + 중간 + 첨가제)를 놓습니다. 강수량의 개시를 위해 정기적으로 모든 장치를 모니터링합니다. 강수량의 발병이 육안으로 감지되면 광학 현미경을 사용하여, 현미경 관찰을 시작합니다. 실험 시작 후 36 시간 - 이것은 보통 30 사이입니다.

멀티 모드 현미경 3. 프로토콜

  1. 높은 MAGNIFICAT 유체의 소량 (~ 1 ㎖)에 전송이온 시야 모드 초기 관찰을 수행하는 시스템의 coverglass 현미경 - 챔버. ,로 시작하는 가장 낮은 배율 (4X) 모든 관측을 시작합니다. 이는 따르면 석출물의 분포에 대한 따라서 글로벌 정보의 넓은 범위를 제공한다.
  2. 강수량의 큰 볼륨으로 특정 영역을 선택하고 점진적으로 배율을 증가시켜 (20X, 40X, 60X)를 확대합니다.
    참고 : 제대로 (때문에 매우 가까운 굴절률에) 세포 외 고분자 물질 시야에서 (EPS)에서 세포를 해결하는 것은 불가능하기 때문에 필요할 때마다, 위상 콘트라스트 모드를 전환 할 수 있습니다. 이 모드에서는, (벌크 셀 상이한 위상 인) 세포막 단지 윤곽 따라서 시각적 차별화를 가능하게 표시된다.
  3. 마지막으로, 빨간색 죽은 구성 요소를 색칠하면서 선택적으로 녹색으로 흐르는 부품 염료 라이브 / 죽은 얼룩 약간의 실을 염색. 표준 프로토콜 28을 참조하십시오 </ SUP>.
  4. 형광 모드에 스위치가 제대로 빨간색과 녹색 지역을 구분합니다. 레드 ((540)의 여기 파장 레드 필터 큐브 - 660 나노 미터 - 580 nm의, 600의 595 nm의 배리어 필터의 다이크로 익 미러) - 480 나노 미터의 다이크로 익 미러 (440)의 여기 파장을 가진 녹색 (GFP 롱 패스 그린 필터 큐브 510 ㎚) 필터 큐브의 505 nm의 배리어 필터는 형광 현미경을 용이하게하기 위해 사용된다.
  5. 일단 모든 멀티 모드 데이터는 최상의 명암비와 선명도를 얻기 위해 가장 좋은 이미지를 수동으로 오버레이 (개별 시야, 위상차 및 형광 이미지)를 선택, 수집되었습니다.
  6. 결정 구조를 이해하기 위해 건조 된 고체 시료에 대한 SEM을 수행합니다. 이것은 잘 확립 된 표준 절차입니다. (22)는 작용기 (탄산염)의 화학 서명을 확인하기 XPS를 수행합니다. 이뿐만 아니라 잘 설립 및 표준 절차입니다. (23)

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결과

S.는 alkaliphile (24)는 상대적으로 가혹한 조건에서 살아남을 수있는 pasteurii. 전술 한 배양 프로토콜 및 S. 하였다 때 pasteurii 박테리아 시간 (도 2a)을 통해 탄산 칼슘의 석출을 유도, 챔버 내부에서 성장된다.도 2 (b) 배양액 내의 박테리아 세포 집단의 위상차 광학 현미경 이미지를 나타낸다. 각 셀은 매우 명백 세균 바실러스 클래스의 특성로드 형 모양으로 명확하게 구별 될 수있다. 작은 갈색 화살표는 특히 두 개의 개별 셀을 강조하기 위해 사용되어왔다. 탄산 칼슘의 석출 며칠의 기간에 걸쳐 발생한다.도 2a는 침전물은 원심 분리 튜브의 하단에 정착 방법을 보여준다. 이것은 생생하게와 액체 매질 밑에 앉아 백탁 분말로서 육안으로 볼 수있는노란 액체 반대로 색...

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토론

중요한 단계 :이 논문은 S.의 가능한 샘플을 배양 상세히 설명 프로토콜 pasteurii. 배양이 readied 한 후에는 적절히 농축되어야한다. 적절한 화학적 환경을 제공하는 실패가 어느 매우 긴 시간 척도 침전 또는 이들 전체 부족 리드 때문에 실험의 성공에 필수적인 중요한 단계이다. S. pasteurii 여러 외부 기관에 매우 민감하며 생화학 적 안정성과 반복성을 보장하는 치료 및 고정밀 도로 배양한다. 농축의 정도 및 투여 량은 지금 강수의 화학적 특성을 지시하는 것으로 알려져있다 따라서뿐만 아니라 정확하게 제어해야합니다.

수정 / 문제 해결 : 여러 측면은 최종 결과에 약간의 차이로 변형 될 수있다. 플레이트 카운트는 일 당 (일련 희석 상술 된 기술에 따라 수행 될 필요) 마일 Misra는 방법 전자. 여기서, 일련의 희석은 바닥면에 그려진 코드 일곱 개...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 협력에 참여하여 지원을 받은 Helmholtz-Alberta Initiative, Helmholtz Association 및 University of Alberta의 파트너에게 감사드립니다. 연구 자금은 헬름홀츠 협회의 이니셔티브 및 네트워킹 기금, 참여 헬름홀츠 센터, 앨버타 환경부의 ecoTrust 프로그램을 통해 앨버타 정부에서 제공합니다.

Tanushree Ghosh 박사는 여러 중요한 단계에서 중요한 의견을

제시한 것에 대해 감사하게 생각합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PetridishFisher ScientificFB0875712로 사용되는 Petridish
Fisher ScientificS63268Corning Erlenmeyer
Tris-BasePromegaH5133은 Tris-Buffer
Hydrochloric AcidSigma-AldrichH98921.0 N, Bioreagent, 세포 배양
한천 분말을 만드는 데 사용됩니다.Sigma-AldrichA1296미생물학 테스트, 식물 세포 배양 테스트, 세포 배양 테스트, 분자
생물학용황산 암모늄Sigma-AldrichA4418
효모 추출물 분말Sigma-Aldrich51475
측정 실린더Cole-ParmerCP08559GCCole-Parmer Class A 눈금 실린더 w/Cal Cert, TC; 1,000ml, 1/Pk
분석 저울: OHAUSAX124E, 시약의 무게를 측정하는 데 사용,
오토 클레이브: Brinkmann58619000
오토 클레이브 테이프VWR52428864
알루미늄 호일, Sigma-Aldrich, Z185140에 넣기 전에 플라스크를 밀봉하는 데 사용됩니다
-80 > S. pasteurii의 C 주식, ATCC No. Cat에 대해 언급됩니다. 아니요.
Mline 단일 채널 기계식 피펫터, 가변 볼륨Biohit725010카탈로그 번호 14005976
Micropipette TipFisher Scientific212772B한천 플레이트 긁힘에 사용
인큐베이터바인더80079098미생물학 인큐베이터, BF 시리즈
쉐이킹 인큐베이터VWR14004300VWR 시그니처 벤치 탑 쉐이킹 인큐베이터
인산염 완충액 식염수(PBS) Sigma-AldrichP7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting DeviceBD Biosciences357590카탈로그 번호 53106220
ParafilmSigma-AldrichP7793한천 플레이트를 밀봉하는 데 사용
UreaSigma-AldrichU1250영양 매체
중탄산나트륨Sigma-AldrichS8875영양소 배지에 대한 농축
염화칼슘Sigma-AldrichC1016영양소 배지에 대한 농축
한천 플레이트 Pyrex 플라스크, 플라스크를 오토 클레이브 박테리아 스톡 Cedarlane 11859. 농축

참고문헌

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