경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

Summary

이 프로토콜은 Rac1을 포함한 Rho-family GTPase에 대한 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교합니다. 생체 내에서 Rac1 결합 단백질은 단일 결합 계면을 놓고 경쟁하며, 그 형태는 결합된 뉴클레오티드에 의해 결정됩니다. 뉴클레오티드는 중요하면서도 높은 가수분해 속도로 인해 실험적으로 제어하기 어렵습니다.

Abstract

이 프로토콜에서는 GTPase 결합 단백질 간의 경쟁을 비교하는 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법은 두 가지 이유로 GTPase의 결합 능력을 결정하는 데 중요합니다: 모든 상호 작용이 GTPase의 동일한 면을 포함한다는 사실은 결합 이벤트를 경쟁업체의 맥락에서 고려해야 함을 의미하고, 결합된 뉴클레오티드도 제어해야 한다는 사실은 면역침전과 같은 기존 접근 방식이 GTPase 생화학에 적합하지 않다는 것을 의미합니다. 이 분석은 정제된 단백질의 사용에 의존합니다. 비드에 고정된 정제된 Rac1은 미끼 단백질로 사용되며, GDP, GTP의 비가수분해성 버전 또는 좌측 뉴클레오티드를 장전할 수 있으므로 조사할 신호 단계를 제어할 수 있습니다. 조사될 결합할 단백질은 GFP 꼬리표를 통해, 정확한 folding를 허용하기 위하여 포유류 세포에서 정제됩니다. 두 단백질에 동일한 태그를 사용하는 것은 신속한 정제 및 용리를 가능하게 할 뿐만 아니라 용리 중에 동일한 항체를 가진 두 경쟁자를 검출할 수 있기 때문에 중요합니다. 이는 두 결합된 단백질의 상대적인 양을 정확하게 측정할 수 있음을 의미합니다.

Introduction

포유류 세포의 모양, 극성 및 이동 특성을 결정하는 액틴 세포골격은 작은 GTPase의 Rho-family에 의해 조절됩니다. Rho-family GTPase에는 세포골격 수축을 자극하는 RhoA, 액틴 분지 및 막 돌출을 자극하는 Rac1, Rac1과 액틴 중합에 유사한 영향을 미치고 filopodia ^1,2의 형성을 유발하는 Cdc42가 포함됩니다. GTPase 신호 활성은 뉴클레오티드의 결합에 의해 결정되며, 이는 조절자 및 효과기 모두와 단백질-단백질 상호 작용을 매개하는 스위치 I 및 스위치 II 루프의 수축 및 이완을 제어합니다. 구아노신 5'-삼인산(GTP) 결합 GTPase는 다운스트림 효과기를 활성화하는 반면, 구아노신 5'-이인산(GDP) 결합 형태는 비활성 상태입니다. 세포에서 GTP 가수분해 및 뉴클레오티드 교환 주기는 세포골격 역학에 필요한 GTPase 신호의 빠른 전환을 가능하게 합니다. 뉴클레오티드 회전율은 세 가지 메커니즘에 의해 조절됩니다. 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)는 뉴클레오타이드가 없는 GTPase를 안정화하여 GDP와 GTP의 교환을 촉매하여 GTPase 신호 전달 활성을 자극합니다 ^3,4. GTPase 활성화 단백질(GAP)은 GTP에서 GDP로의 가수분해를 촉매하여 GTPase 신호 전달 활성을 억제합니다 ⁵. RCC2(Crystalatin Condensation 2) 및 GDI(guanine nucleotide dissociation inhibitors)와 같은 격리 분자는 스위치 루프를 모호하게 하고 GDI의 경우 프레닐 꼬리 ^6,7과 상호 작용하여 멤브레인에서 GTPase를 제거합니다. 조절 분자의 세 가지 부류는 각각 스위치 루프와 상호 작용하며, 다운스트림 효과기 및 coronin-1C ⁷과 같은 일부 트래픽 조절자도 마찬가지입니다. 이 프로토콜의 목적은 추정 조절자와 다운스트림 신호 분자 사이의 스위치 I/II 결합 부위에 대한 경쟁을 측정하는 것입니다. 경쟁 분석은 공유 결합 부위에 대한 결합을 테스트하므로 이 프로토콜은 프레닐 테일에 GDI의 결합과 같은 다른 부위와의 상호 작용을 테스트하는 데 적합하지 않다는 점에 유의해야 합니다.

결합 뉴클레오티드의 불안정한 특성과 결합된 활성 형태와 비활성 형태 간의 형태 차이의 미묘함은 GTPase 결합 이벤트에 대한 연구를 어렵게 만들었습니다. 결합된 뉴클레오티드의 역할은 뉴클레오티드를 제어할 수 없기 때문에 면역침전 또는 표면 플라즈몬 공명과 같은 기존 결합 분석이 조사에 적합하지 않다는 것을 의미합니다. 이러한 장애는 GEF, GAP, effector, 격리 분자 및 밀매 분자의 결합 부위가 겹치기 때문에 더욱 복잡해지며, 이로 인해 세포에서 발생할 경쟁의 맥락에서 단일 상호 작용에 대한 결합 데이터를 해석하기 어렵습니다. 특히 면역침전은 결합 파트너 간의 경쟁에 의해 손상되는데, 특정 세포 조건에서는 하나의 결합 파트너가 다른 모든 파트너를 희생시켜 식별될 수 있는 반면, 다른 조건에서는 다른 파트너가 우세할 수 있기 때문입니다. GTPase 신호전달의 동적 특성은 GTPase 기능에 필수적이며 서로 다른 조절자의 결합 상호 작용 간의 관계를 분석할 때 고려해야 합니다. 실제로, 우리는 최근에 경쟁 바인딩에 크게 의존하는 경로에 대해 설명했습니다. 우리는 coronin-1C를 GDP-Rac1 ⁷의 스위치 루프에 결합하는 교통 분자로 확인했습니다. GEF 활동이 적은 지역에서는 인신매매가 우세하여 해당 지역에서 Rac1을 제거할 것입니다. 그러나, Rac1이 GEF 활성이 높은 세포 부위에 전달될 때, GEF는 coronin-1C를 능가하게 되며, 그로 인해 Rac1을 활성화하고 해당 영역에서 Rac1이 coronin-1C에 의해 제거되는 것을 방지할 수 있습니다. 이 모델은 더 나아가 GEF 거래소의 행동이 GDP를 GTP에 종속시켜 균형을 코로나닌-1C에서 훨씬 더 멀리 이동시키기 때문입니다. 결과적으로, Rac1 활동은 전적으로 경쟁과 상대적 친화력의 관점에서 설명될 수 있다.

이 프로토콜에서는 Rac1을 예로 사용하여 작은 GTPase에 대한 서로 다른 바인딩 파트너의 상대적 친화도를 비교하는 방법을 설명합니다. 정제된 단백질 접근법을 사용하면 결합된 뉴클레오티드를 밀접하게 제어할 수 있는 실험에서 쌍별 비교를 통해 신호 전달 이벤트의 사슬을 결합할 수 있습니다.

Protocol

GST-태그는 GTPase 1. 정제

1. 문화 E. 예컨대 220 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 유전자 pGEX-RAC1 O / N로 형질 전환 된 BL21로서 대장균, autoinduction 배지 500 ㎖ (25 mM의 나트륨 ₂ HPO _4, 25 mM의 KH ₂ PO _4, 50 mM의 NH ₄ CL, 5 mM의 SO ₄ 나 _2, 2 mM의 _황산, 2 mM의 _CaCl2를, 0.5 % 글리세롤, 0.05 % 글루코스, 0.2 % 락토오스, 5g 트립 톤, 2.5 g 효모 추출물, 100 μg의 / ㎖ 암피실린).
2. 10,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확 박테리아.
3. 20 ㎖의 단백질 추출 시약, 1X 프로테아제 억제제 세균 펠렛을 재현 탁하고 반전하여 실온에서 20 분 동안 배양한다.
4. 30 분 동안 40,000 XG에서 원심 분리하여 해물을 명확히.
5. 인산염 완충 식염수로 세척 2 ㎖의 글루타티온 자석 구슬, 추가 (PBS : 10 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 1.8 mM의 KH ₂ PO _4, 137 mM의 NaCl을, 2.7 밀리미터의 KCl).
6. 4 ° C에서 반전하여 혼합, 2 시간 동안 품어.
7. 각 단계에서 비즈를 침전 자분 분류기를 사용하여, 10 ml의 PBS로 단백질 로딩 비드 네 번 씻는다.
8. 필요할 때까지 재현 탁의 100 μL 씩에 -80 ° C에서 2 ml의 PBS에서 구슬과 상점을 단백질로드.

는 GTPase 결합 단백질의 2 식

1. 다음 실험 하루 전에, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 플라스미드를 형질 HEK293T 별도 75 ^cm-2는 GTPase 플라스크에 각각 결합 단백질의 버전 -tagged. 염기로드의 검증을 위해, 트랜의 HEK293T의 세 번째 75 cm ² 플라스크에 TrioD1을 GFP - 태그.
   1. 100 μL에 1 ㎎ / ㎖ 멸균 150 mM의 염화나트륨에 polyethylamine을 희석.
   2. 223 μL 감소 혈청 미디어에 27 μl를 희석 polyethylamine를 추가합니다.
   3. 250 μL 감소 혈청 배지에 12 μg의 플라스미드 DNA를 추가합니다.
   4. 실온에서 2 분 동안 각 튜브를 품어.
   5. polyethylamine을 결합하고 DNA는 2 분에 대해 하나의 튜브와 소용돌이에 혼합.
   6. 실온에서 15 ~ 20 분 동안 품어.
   7. 5 ml의 신선한 성장 배지에 90 % 합류에 HEK293T 성장 배지 (둘 베코 변형 이글 미디어, 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 항생제)를 대체.
   8. 플라스크에 결합 polyethylamine / DNA 믹스를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO _2에서 O / N을 품어.

는 GTPase 결합 단백질의 3 정화

1. PBS에서 형질 세포의 플라스크를 씻어 무료로 액체를 흡입, 5 분 동안 플라스크 드레인.
2. 500 ㎕의 용해 완충액에 세포를 긁어 (50mM 트리스 - 염산 (pH7.8), 1 % Nonidet P-40, 1X 프로테아제 억제제) 미세 원심 분리 튜브에.
3. 30 분 동안 4 ° C에서 반전하여 혼합하여 세포를 Lyse.
4. 용해시, 세척 사이에 2 분 동안 2,700 XG에 40 μL GFP - 트랩 구슬이 많은 신선한 용해 완충액으로 3 회, 침강 구슬을 씻어.
5. 10 분 동안 21,000 XG에서 원심 분리 용 해물을 명확히.
6. 전사는 4 ° C에서 반전하여 혼합, 세척 GFP 트랩 비드를 분리 및 GFP 융합 단백질은 2 시간 동안 결합​​하게 경쟁 단백질의 각각의 용 해물을 정화. 얼음에 GFP - TrioD1 세포에서 해물을 유지합니다.
7. 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.8), 50 mM의 NaCl을 두번로드 GFP 트랩 구슬 씻어 0.7 % (W / V) Nonidet P-40 회 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6)에서, 20 밀리미터의 MgCl ₂ , 세척 사이에 2 분 동안 2,700 XG에 구슬을 침강.
8. 40 ㎕의 0.2 M 글리신 (PH 2.5)을 추가하고 30 초 동안 아래로 피펫 팅에 의해 GFP - 융합 단백질을 용출. 4 μL 1 M 트리스 - 염산 (PH 10.4)를 포함하는 새로운 미세 원심 분리 튜브에 21,000 60 초 동안 XG 및 전송 액체에서 즉시 침전물 구슬. 정제 된 단백질의 손상을 제한하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다.
9. 정량적 blott를 사용 상대적인 수율을 확립 항 GFP 항체와 함께 웨스턴 블랏에 의한 각 프로브와 정제 된 단백질의 1 μL를 분석제조 업체의 프로토콜에 따라 시스템을 보내고. 대안 적으로, bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석으로 농도를 결정하지만, 단백질과 동일한 방식으로 분석과 반응하지 않거나 오염 단백질이 존재하면 에러를 도입한다.
10. 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl _2를 첨가하여 단백질의 몰 농도를 등화.

는 GTPase의 4 염기로드

1. 단계 1에서 제조 한 GST-RAC1 자성 비드, 하나의 분취 량을 해동.
2. 각 단계에서 비즈를 침전 자분 분류기를 사용하여, GST-RAC1 비드의 90 μl를 취하여 20 mM 트리스 - 염산 (PH 7.6), 25 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 DTT, 4 mM의 EDTA로 3 회 세척 하였다.
3. 대기음 구슬에서 버퍼와 100 μL 20 mM 트리스 - 염산 (PH 7.6), 25 mM의 NaCl을 0.1 mM의 DTT, 4 mM의 EDTA를 추가합니다.
4. 국내 총생산 (GDP), GTP 또는 전혀 염기 로딩 경쟁 실험에 필요한지 여부에 따라, 12 μl의 100 mM의 국내 총생산 (GDP), 12 ㎕의 10 mM의 번지를 추가anosine 5 '- [γ-티오] 트리 포스페이트 (GTPγS) 또는 60 μL GST-RAC1 비즈없이 염기.
5. 염기 로딩 컨트롤, 세 10 μL 분취에 남아있는 구슬을 분할하여 2 μL 100 mM의 국내 총생산 (GDP), 2 μL 10 밀리미터 GTPγS 각 튜브없이 염기를 추가합니다.
6. 교반하면서 30 ℃에서 30 분 동안 비드 혼합물을 배양한다.
7. 실험 믹스 3 μL (단계 4.4), 제어 믹스 (단계 4.5)의 각각 0.5 μL 1 M의 MgCl _2를 첨가하여 핵산 - 결합 RAC1 안정화.

바인딩 5. 경쟁.

1. 6의 microfuge 튜브를 설정, 각 포함 :
   200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl ₂
   (단계 4.7에서) 10 μL 실험 염기로드 RAC1 비즈
   5 μL RAC1 결합 단백질 A (단백질 결합 상수)
2. 각 튜브에, 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μL의 RAC1 - 결합 단백질 B (가변 결합 단백질)를 추가한다. 이 볼륨은 가정pproximately 동일한 주식 상수와 변수 결합 단백질의 농도를 조정해야 할 수도 있습니다.
   1. 이 두 단백질의 결합 친화도에 큰 차이가 있으며 이것이 반복 실험을 통해 경험적으로 결정되어야하는 경우 결합 단백질의 양 및 B를 조정한다. 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl _2를 첨가하여 235 μL로 결합 혼합물의 전체 부피를 차지한다.
3. 포함하는 미세 원심 분리 튜브를 설정합니다 :
   200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl ₂
   (단계 4.7에서) 10 μL 실험 염기로드 RAC1 비즈
   10 μL RAC1 결합 단백질 A (단백질 결합 상수)
4. 국내 총생산 (GDP), GTPγS없이 염기 제어 튜브를 설정합니다 :
   200 ㎕의 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl ₂
   10 μL 제어 RAC1 비즈는 국내 총생산 (GDP), GTPγS 또는 전혀 염기와 4.5 단계에서로드 단계 4.7에서 안정화.
   180 μL H단계 3.6에서와 같이 제조 EK293T GFP - TrioD1 용 해물,
   4 μL 1 M의 MgCl ₂
5. 4 ° C에서 반전하여 혼합, 2 시간 동안 상기 혼합물을 배양한다.
6. 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.6), 20 mM의의 MgCl ₂ 비드 세 번 세척 하였다.
7. 용출 시료 완충액을 20 μL 환원 단백질을 결합 (50 mM 트리스 -HCl (pH 7), 5 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.02 ㎎ / ㎖ 브로 모 페놀 블루, 5 % β 메르 캅토 에탄올).

경쟁 6. 분석

1. 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯에 의해 결합 된 단백질 (단계 5.6) 10 μL를 해결.
2. 39 °에서 CO 막을 인큐베이션 / N 안티 GFP 항체로 블로킹 완충액으로 1/1000 희석하여 PBS로 1 배 희석하고, 0.1 % 트윈 -20은이 태그는 GTPase - 결합 단백질의 양을 검출한다.
3. PBS로 10 분, 0.1 % 트윈 20 막 세 번 씻으십시오.
4. 800 - 공액 안티 - 토끼 초 DyLight에 RT에서 30 분 동안 인큐베이션 막을ondary 항체, 버퍼를 차단에서 1 / 10,000을 희석하면, 0.1 % 트윈 20 PBS에 1 배 희석.
5. PBS로 10 분, 0.1 % 트윈 20 막 세 번 씻으십시오.
6. 제조사의 프로토콜에 따라 밴드 강도를 측정하기 위해 소프트웨어를 사용하여, 적외선 이미지 시스템을 사용하여 멤브레인을 스캔.
7. 가변 경쟁자 (단백질 B)의 양에 대해 각 단백질 밴드의 강도를 플롯.
8. 라인이 평형이 달성되는 경쟁자 비율을 결정하는 상수 경쟁자 (단백질 A, 5 μL)의 체적 교차하는 점에서 가변 경쟁자의 볼륨을 나눈다.
9. 단계 6.1-6.6에 설명 된대로 P21 활성화 키나제 1 (PAK1) (이펙터)와 GFP - TrioD1 (GEF)에 대한 염기 로딩 상태, 프로브 막 확인하십시오.

Results

이 프로토콜은 경쟁사의 정확한 농도를 알 필요 (그림 1)하지 않고, RAC1 바인딩 파트너의 상대적 친화도를 계산하도록 설계되었습니다. 단백질 농도의 측정 오류를 소개하고 신호 경로의 분자 사이의 경쟁을 고려할 때 필요하지 않습니다. 그러나, 두 경쟁 분석법으로 상이한 양을 추가 할 때 단순 비율이 계산 될 수 있도록하는 스톡 용액에 동일 몰 농도가 있음을 아는 것이 중요하다. GFP 트랩 비드 40 ㎕를 300 pmol의 그래서 합류 75cm 높은 두 개의 다른 결합 단백질의 제제는 조정 전의 유사 할 것이라는 결과, 비드 포화 것이다 발현 세포의 ² 플라스크 ~의 결합능을 가지고 (도 2A). 단백질 중 하나가 잘못 표현하면,이 문제는 셀의 하나 이상의 플라스크에서 그 단백질을 정제에 의해 극복 될 수있다.

(8) (그림 2B)에 의해 검출 될 수있다. 전이 상태를 안정화시키기는 GTPase없는 뉴클레오티드 우선적 결합 GEFs. GEFs는 일반적으로 비활성 낮은 풍부,의이고 자주 가난시킨다, 그것은 시험 염기 프리는 GTPase에 GEF 또는 GEF 단편을 과발현하는 것이 좋습니다. 우리는 자주 트리오의 첫 번째 DBL 동성을 사용하여, GFP 융합 (GFP - TrioD1 ⁹⁾ (그림 2B)로 표현하지만 어떤 GEF는 작동합니다. 국내 총생산 (GDP)로드는 GTPase에 결합하는 단백질은 희소하다. BINDI로 간단하게 검증 할 수있는 하나의 단백질 ^(7), 또는 국내 총생산 (GDP) 로딩으로 우리는 최근 RCC2보고도 지구 환경 기금이나 이펙터에 겨.

실험의 출력에 결합는 GTPase 두 GFP 표지 된 결합 파트너를 나타내는 웨스턴 블롯 것이다. 두 단백질을 검출하기 위해 하나의 항체를 사용하여, 두 경쟁 유사한 양 결합되는 농도를 결정할 수 있으므로 상대적 친화 유추. RAC1 인신 매매 단백질의 프로펠러 도메인 사이에이 예 대회에서, coronin-1C (단백질을 RAC1가 결합) 및 RAC1 - 금속 이온 봉쇄 단백질, RCC2은 (단백질 B를 RAC1가 결합), (그림 3A)를 시연한다. coronin-1C 프로펠러 (5 μL)의 일정한 볼륨을 사용하고, RCC2의 증가 볼륨을 추가함으로써, 우리는 RCC2가 강하게 가지고 있음을 보여주는 GFP에서 그 평형이 RCC2 (별표)의 1.25-2.5 μL에 도달시킨다 볼 수 있습니다 coronin-1C보다 RAC1에 대한 친화력. 각 competito 평균치를 정량적 웨스턴 블 롯팅을 사용하여 밴드의 강도를 측정하고, 플롯에 의해R, 평형 점은 볼륨되는 곡선 (도 3b)를 교차를 식별하여 정확하게 계산 될 수있다.

결합 파트너가 서로뿐만 아니라 RAC1 결합에 결합하는 경우 성공적인 경쟁 분석에 사용할 수있는 하나의 장애물이다. 그림 3A의 + B의 우리는 오히려 전체 길이 coronin-1C보다 RCC2과 coronin-1C의 프로펠러 도메인 간의 경쟁을 보여줍니다. 절두 coronin를 사용하는 이유는 coronin-1C는 테일 도메인 통해 RCC2 결합한다는 것이다. 전장 coronin-1C는 RCC2 대해 적정하면, 두 단백질의 결합으로 인해 삼원 복합체 형성보다는 경쟁 (도 3c)로 검출된다. 경쟁이 발생하는 경우, 하나의 단백질의 결합은 다른 감소하면서 증가하고 총 결합 GFP 융합은 일정하게 유지 될 것이다. 경우 삼원 복합체는는 GTPase 결합 단백질 중 하나자를 형성 할 필요가 있기 때문에 여기서 compet적인 억제제는 더 이상 상호 작용하지 않습니다.

그림 1. 워크 플로우. 경쟁 분석을 사용하여는 GTPase 결합 단백질의 친 화성을 ​​결정하기위한 워크 플로우의 도식 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

정제 된 단백질의 그림 2. 검증. (A)으로 정제하여 GFP - 태그 두 단백질의 상대 수익률을 결정하는 안티 GFP와 프로빙, 웨스턴 블롯 분석 결합 단백질 RAC1. 실험 기간 동안 보상이 유형들이 결합 실험에 일치하도록 두 단백질의 농도가 조절 될 수있다. (B) GDP, GTPγS없이 염기로드 GST-RAC1이 내생 PAK1 또는 과발현 GFP - TrioD1에 대한 플롯에 의해 감지 단백질 GFP - TrioD1을 표현 HEK293T에서 해물 배양과 결합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

상대 단백질의 그림 3. 웨스턴 블롯 분석을 결합. 예 출력을 경쟁 결합 분석에서. (A) RAC1 5 μL GFP - coronin-1C 프로펠러 도메인과 혼합에 적정 된 GFP - RCC2의 볼륨을 증가하고 국내 총생산 (GDP)로드.으로 GFP에 대한 웨스턴 블롯 결합 단백질, 두 단백질의 검출 시차의 문제가 회피되고, GFP 신호는 두 개의 융합 단백질 사이의 몰비를보고한다. 별표는 eithe의 경쟁 비율을 나타냅니다평형 점의 R 측. (B) 3 개의 독립적 인 실험으로부터 바운드 GFP 융합 단백질의 밴드 강도는 평형에 도달하는 데 필요한 형광 접합 된 이차 항체 및 평균 RCC2의 양을 계산하는 플롯하여 정량적 웨스턴 블롯으로 측정 하였다. (C RAC1 결합 단백질 오히려 경쟁보다는 서로에 결합 원 복합체를 형성 실험에서) 예 출력. 국내 총생산 (GDP)이 장착 된 RAC1 5 μL의 GFP - RCC2와 혼합 GFP - coronin-1C 전체 길이의 볼륨을 증가했다가에 적정 하였다. 바운드 GFP - coronin-1C의 증가를 결합 GFP - RCC2의 손실없이이 원 복합체 형성을 나타냅니다. 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 작은 GTPase-결합 단백질 쌍의 상대적 친화도를 비교하는 방법을 설명합니다. 핵심 단계는 정제된 GTPase-결합 단백질의 준비와 GTPase의 뉴클레오티드 로딩입니다. 동일한 GFP 태그를 가진 GTPase 결합 단백질을 사용하면 각 경쟁자의 유사한 양이 결합하는 농도를 정확하게 결정할 수 있습니다. 재조합 뉴클레오티드 로드 GTPase를 사용하면 특정 활성 조건에서 GTPase의 결합 특성을 조사할 수 있습니다. 이 단계는 또한 마그네슘 조건이 정확하게 유지되지 않으면 뉴클레오티드가 가수분해되고 GTPase에서 분리되기 때문에 가장 민감합니다.

세포에서 빠른 뉴클레오티드 회전율과 결합된 많은 수의 GTPase 결합 단백질은 이러한 경로를 해석하기 어렵게 만듭니다. 결합 단백질 쌍만 비교하고 신중하게 제어된 뉴클레오티드 로딩 조건을 사용하는 이 방법의 단순성으로 신호 전달 경로를 밝힐 수 있습니다. 그러나 프로토콜의 가장 큰 강점은 생체 내 상황을 단순화한다는 점에서 가장 큰 약점이기도 합니다. 경쟁 분석은 강력한 가설을 세우는 데 사용될 수 있지만 이는 녹다운 실험을 통해 세포에서 테스트되어야 합니다.

실험에 사용할 GFP 태그 GTPase 결합 단백질을 선택할 때 고려해야 할 세 가지 기능이 있습니다. 첫째, 융합 단백질은 HEK293T와 같은 포유류 세포에서 잘 발현되어야 하며, 경쟁 분석에는 합리적인 양의 단백질이 필요하기 때문입니다. 둘째, 상당한 분해 없이 재조합 단백질을 정제할 수 있어야 하며, 이것이 불가능한 경우 GTPase-결합 단편의 복제를 고려해야 합니다. 셋째, 두 개의 GTPase-결합 단백질은 섹션 6에서 분석을 허용하기 위해 SDS-PAGE에서 서로 분리되어야 합니다.

실험에는 고려해야 할 몇 가지 잠재적인 주의 사항이 있으며 해결될 수 있습니다.

산 용출 단계 동안 정제된 GTPase-결합 단백질의 변성 가능성 또는 GFP 태그에 의한 입체 장애. 우리 손에서는 이것이 문제가 되지 않았지만 테스트해야 합니다. 정제된 단백질은 기능 분석 ⁽¹⁰)에서 시험될 수 있다. 현재 동위원소 표지 뉴클레오티드 없이 GEF 또는 GAP의 활성을 테스트하기 위한 상용 키트가 존재합니다. 격리 단백질은 본질적으로 GEF 또는 GAP 활성으로부터 GTPase를 보호하므로 최근 간행물에서 그랬던 것처럼 상업용 GEF 또는 GAP 분석에서 경쟁적 억제제로 사용할 수 있습니다 ⁷. GTPase를 운행하는 단백질의 관련 특징은 GTPase에 결합하는 능력이며, 이는 풀다운 분석에서 쉽게 테스트할 수 있습니다. 모든 결합 단백질에 적용할 수 있는 단백질 무결성을 테스트하는 다른 접근 방식은 효소 절단에 의해 GFP-트랩 비드에서 제거된 동일한 단백질을 사용하여 GFP-트랩 비드에서 용출된 단백질을 글리신으로 적정하는 것입니다. 실험은 단백질 자체에 대한 항체로 GFP 태그 단백질과 절단된 단백질을 모두 조사하여 분석됩니다. 단백질이 용출에 의해 손상되지 않은 경우 1:1 비율로 평형을 이루어야 합니다. 이 접근법은 또한 GFP 태그 자체의 존재가 후보 단백질의 결합 특성을 손상시키는지 여부를 나타내지만, 이를 위해서는 태그와 결합 단백질 사이에 효소 절단 부위가 있는 구조물의 생성이 필요합니다. 단백질이 태그 또는 용출 단계에 의해 손상되든 대체 정제 방법을 사용하도록 프로토콜을 수정하여 문제를 해결할 수 있습니다. GFP 대신 결합 단백질은 His-tagged, Ni-NTA를 사용하여 정제되고 His-tag에 대한 항체를 사용하여 분석될 수 있습니다. 중요한 특징은 두 결합 단백질이 공통 태그를 공유해야 하지만 필요한 경우 두 개의 태그를 단백질에 추가할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜은 스위치 I/II 도메인과의 상호 작용 간의 경쟁을 조사하도록 설계되었습니다. GTPase 상호작용의 대부분은 이 모티프에 의해 매개되지만, 몇 가지 예외가 있는데, 특히 프레닐 테일에 결합하고 스위치 도메인을 가리는 GDI의 상호작용이 가장 두드러집니다. 원칙적으로, 프로토콜은 포유류 세포로부터 정제된 GTPase를 사용하도록 조정될 수 있으므로 GTPase가 프레닐화되지만, 다중 결합 부위 또는 알로스테릭 효과의 존재는 경쟁 결합 데이터의 해석을 복잡하게 만듭니다. 이러한 변형과 관련된 추가 문제는 GDI가 포유류 세포의 GTPase와 공동 정제되어 분리된 단백질의 순도를 손상시키고 프레닐 그룹의 소수성 특성은 프레닐화된 GTPase가 GDI 또는 지질막과 연관되어 있으며 이러한 요인이 실험에서 고려되어야 한다는 것입니다.

분석에 사용되는 GST-Rac1의 양입니다. 일정한 GTPase 결합 단백질은 Rac1보다 더 높은 농도에 있어야 하며, 그렇지 않으면 경쟁자가 추가되면 단순히 자유 Rac1에 결합합니다. 그림 3B와 같이 두 개의 경쟁 단백질이 서로 결합할 때와 거의 동일한 방식으로 일정한 단백질의 손실 없이 경쟁자의 결합이 감지되기 때문에 이것이 발생했는지 즉시 명백해질 것입니다. 추가 대조군(단계 5.3)으로서, 두 배의 양의 일정한 결합 단백질을 함유하고 가변 결합 단백질을 포함하지 않는 결합 반응을 포함해야 한다(단계 5.3). 적정 실험에서 Rac1이 포화 상태인 경우 일정한 결합 단백질의 양을 두 배로 늘려도 출력에 영향을 미치지 않습니다. 프로토콜에서 제안한 양은 적절해야 하지만 Rac1의 양은 쉽게 줄일 수 있습니다. 일정한 결합 파트너의 손실 없이 경쟁자의 결합이 관찰되는 경우, 삼원 복합체 형성을 피하기 위해 결합 부위를 매핑하기 전에 Rac1의 양을 줄여야 합니다.

GTPase-결합 단백질과 GST 또는 비드, 특히 Rac1과의 비특이적 상호작용. 이 문제는 가변 GTPase-결합 단백질이 고농도에서 정체기에 도달한 경우에도 일정한 GTPase-결합 단백질의 잔류 결합으로 나타납니다. 이 문제의 식별은 일정하고 가변적인 GTPase 결합 단백질이 교환되는 상호 실험을 수행함으로써 도움이 될 것입니다. 상호 실험은 또한 평형점 추정치의 정확도를 크게 향상시키므로 항상 포함해야 합니다. 비특이적 결합의 경우, 평형이 달성되는 상대 농도는 각 단백질에 대한 최대값과 최소값 사이의 밴드 강도를 비교하거나 GST-Rac1이 아닌 GST 비드를 미끼로 사용하여 비특이적 결합 정도를 측정하여 계산할 수 있습니다.

이 프로토콜에 설명된 경쟁 분석을 보완하기 위해 다른 뉴클레오티드 로딩 조건을 사용하는 풀다운 분석을 사용해야 합니다. 파트너의 뉴클레오티드 선호도를 결정하는 것은 경쟁 이벤트를 이해하고 GTPase 결합 단백질이 관여하는 신호 전달 경로를 이해하는 데 중요합니다. 그림 2B 에서는 뉴클레오티드 로딩을 검증하기 위한 수단으로 GTP 로딩 또는 뉴클레오티드가 없는 GTPase에 대한 확립된 선호도를 가진 단백질의 결합을 분석합니다. 그러나 각 경쟁자에 대한 뉴클레오티드 로딩의 영향을 조사하는 것도 현명합니다. 가상의 경쟁자가 다른 선호도를 보이면 경쟁은 신호 전달 경로에 덜 기여할 것이며 실제로 뉴클레오티드 회전율은 결합 단백질의 교환을 지시하는 메커니즘일 가능성이 높습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE 프로테아제 억제제	Roche	05 056 489 001
글루타티온 마그네틱 비드	Pierce	88821
폴리에틸렌이민, 분지, 평균 Mw ~25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	매우 불안정합니다. 부분 표본 및 재구성
GTP&감마 즉시 -80에 저장; S	시그마 알드리치	G8634	매우 불안정합니다. 재구성 즉시 -80으로 분할 및 보관
차단 버퍼	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP 항체	Living	Colors 632592	1/1000 희석에서 사용
DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary 항체	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 항체	세포 신호	2602S	1/1000 희석에서 사용
Odyssey SA 적외선 이미징 시스템	Li-cor	9260-11PC