생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자궁의 기관 형성을 조사하면 자궁 내에서 개발 배아에 의한 시약의 어려움에 태반 포유 동물에서 기술적으로 어려운 과정이다. 새로 개발 된 생체 똑바로 방울 문화 방법은 자궁 내에서 수행 연구에 매력적인 대안을 제공합니다. 생체 액적 배양 검사 및 다양한 차단 및 활성화 화합물의 사용을 통해 세포 상호 작용 및 다양한 신호 전달 경로를 조작하는 능력을 제공; 부가 적으로, 특정 기관의 개발에 다양한 약리 시약의 효과는 자궁 내 전신성 약물 투여의 부작용없이 조사 할 수있다. 시험 관내 시스템에서 다른 비교하여, 액적 배양 포유 동물 세포주에서 복제 될 수없는 삼차원 형태 형성 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 능력을 가능하게 할뿐만 아니라 (R)를 훨씬 적게 요구뿐만생체 전 다른 것보다 체외 프로토콜에 eagents. 본 논문은 방법의 효과를 입증하기 위해 전체 장기 면역 다음에 적절한 마우스 태아의 장기 해부 및 수직 방울 배양 기술을 보여줍니다. 생체 액적 배양법 유사한 생체 내에서 관찰되며, 생체 내 모델에서 배아 치 명성에 기인 달리 어려운 학습 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있는지에 대한 장기 구조의 형성을 허용한다. 모델 시스템과 같은 어플리케이션, 소분자 억제제는 고환 혈관의 형태 형성의 역할을 조사하기 위해 이용 될 것이다. 각 기관에 광범위하게 될 어떤 프로토콜 기관 특이 수정을 결정하기 위해 검토되어야하지만,이 생체 액적 배양법, 예컨대 폐 및 잠재적으로 다른 기타 태아 기관 시스템까지 확장된다. 이 기관 배양 물 시스템은 태아의 장기와 실험에 유연성을 제공하고, 결과 obtaineD 연구자들은 태아의 개발에 대한 통찰력을 얻을 도움이 될 것입니다이 기술을 사용.
서론
인간의 생체에서 장기 재생은 매우 제한적이다 따라서, 조직 공학, 조직 및 호스트에 의해 기증 개별 세포로부터 장기 개발, 장기 교체 매력적인 잠재적 치료되고있다. 이 치료 전략이 성공하려면 그러나, 요인과 기관의 형태 형성에 관여하는 세포의 상호 작용은 철저하게 공부해야 잘 이해했다. 전통적인 접근 방식과 특정 장기의 개발을 연구 할 수 없기 때문에, 연구자들은 대체 전체 배아 또는 전체 기관 배양에 돌았 다. Kalaskar 등. 1은 체외 배양 방법은 기관 형성 연구에 대한 실현 가능한 대안 제시, 자궁 개발에 (배양 된 배아의 58 %에서) 그 생체 전체 배아 문화가 유사한 결과를 얻을 보여 주었다.
개별적인 기관 배양 시스템 등이 생체 DRO시약 또는 약물 항체의 첨가를 통해 특정한 신호 경로 또는 세포 상호 작용의 조작을 허용하면서 plet 배양 시스템은 전신 효과의 전체 기관 독립 분석을 허용한다. 전통적으로, 태아 기관 개발 연구는 모체 약물 전달 시약 이외에, 트랜스 제닉 마우스와 녹아웃 기술에 한정되어왔다. 그러나, 생체 내에서 이러한 기술과 치료에 관련된 기술적 인 문제가있다; 대부분의 문....
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프로토콜
이들 연구에 사용 된 모든 마우스는 찰스 리버 연구소에서 얻은 CD-1 마우스였다. 이전 배양 실험은 또한 C57BL / 6J (데이터는 미도시)와 같은 다른 균주에서 수행되었지만, 임의의 변형이 사용될 수있다. 임신 성인 여성은 약 2~3개월 이전이었고, 자궁 경부 전위와 배아를 제거하기 전에 양자 개흉술 다음 CO 2 흡입을 통해 안락사시켰다. 마우스는 NIH의 지침에 따라 보관하고, 실험 프로토콜은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비
- 70 % 에탄올 용액을 제조 하였다. (습윤 챔버를 제조 및 / 희석 용액의 제조) 오토 클레이브에 탈 이온수. 70 % 에탄올로 아래로 분사하여 해부 도구 (집게, 가위, 27 G 바늘 주사기를) 소독.
- 준비ml의 1 M의 MgCl 2 CaCl2를 3.75 1 M의 PO 4, 7,425 ml의 칼슘 및 마그네슘 (80g 염화나트륨, 2g의 KCl, 14.4 g (2) 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2를 함유 10X 인산염 완충 식....
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결과
생체 방울 문화는 하나, 같은 생식선으로 전체 기관을 조작하는 세포의 상호 작용과 역학을 공부하기. (1) E11.5의 생식선 방울 문화를 준비하는 방법을 단계별 방식으로 보여줍니다도 있습니다. 문화 프로토콜의 첫 번째 단계는 어머니 마우스 (그림 1A 및 1B)에서 배아 함유 자궁의 초기 제거를 포함한다. 어머니의 자궁을 제거 후, 자궁 벽 절단 및 배아 더 해부 (그림 1C-E)에 대한 PBS에 난황에서 해방된다. 내장들을 제거한 후, 비뇨 생식 융기는 배아 (도 1F)의 뒤쪽 몸통 벽을 따라 명확하게 볼 수 있고 (도 1G)를 격리한다. 생식선 - mesonephros 단지는 다음 멀리 비뇨 생식기 능선 (그림 1H)에서 해부하고, 작은 분자 억제제 (.......
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토론
이 연구는 태아의 발달을 연구하는 많은 응용 가능성을 갖는 생체 전체 기관 방울 방법을 보여줍니다. 이 기술로 인해 배아 및 배아 치사의 잠재적 어려움을 사용하여 생체 내에서 생물학적 검사하기 어려운 문제를 해결하기위한 접근 연구원 여러 기관에 사용하고, 허용 할 수있다. 이 배양 방법은 포유 동물 세포주와 같은 접근 체외 다른 위에 추가적인 이점이 전체 기관 그러므로 자궁 내 존재하는 중요한 세포 간 상호 작용을 유지하면서 사용될 수있다; 배양 부피는 따라서 드문 비싼 약제 학적 시약의 매우 소량을 사용하여 (~ 30 μL) 매우 작다.
방울 문화 프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다 기관의) 깨끗한 해부. 깨끗한 해부 조직 구조가 유지 될 수 있도록 노출 절단되거나 손상된 SUR의 수를 최소화배양 접시 표면에 흡착 될 수 있으며, 문화를 방해 할 수있다면,; b) 장기 성장 및 형태 형성을 허용하기 위해 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 CancerFree KIDS Research Grant, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award(#5-FY14-32), Cincinnati Children's Hospital Medical Center(CCHMC) Trustee Grant Award, CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award, CCHMC 개발 기금의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 이 기술의 초기 최적화를 위해 Capel 실험실을 인정합니다.
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참고문헌
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
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