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방법 논문

사용

12.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53262

⸱

2015년 10월 21일

 , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

이 논문에서

요약

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

초록

자궁의 기관 형성을 조사하면 자궁 내에서 개발 배아에 의한 시약의 어려움에 태반 포유 동물에서 기술적으로 어려운 과정이다. 새로 개발 된 생체 똑바로 방울 문화 방법은 자궁 내에서 수행 연구에 매력적인 대안을 제공합니다. 생체 액적 배양 검사 및 다양한 차단 및 활성화 화합물의 사용을 통해 세포 상호 작용 및 다양한 신호 전달 경로를 조작하는 능력을 제공; 부가 적으로, 특정 기관의 개발에 다양한 약리 시약의 효과는 자궁 내 전신성 약물 투여의 부작용없이 조사 할 수있다. 시험 관내 시스템에서 다른 비교하여, 액적 배양 포유 동물 세포주에서 복제 될 수없는 삼차원 형태 형성 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 능력을 가능하게 할뿐만 아니라 (R)를 훨씬 적게 요구뿐만생체 전 다른 것보다 체외 프로토콜에 eagents. 본 논문은 방법의 효과를 입증하기 위해 전체 장기 면역 다음에 적절한 마우스 태아의 장기 해부 및 수직 방울 배양 기술을 보여줍니다. 생체 액적 배양법 유사한 생체 내에서 관찰되며, 생체 내 모델에서 배아 치 명성에 기인 달리 어려운 학습 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있는지에 대한 장기 구조의 형성을 허용한다. 모델 시스템과 같은 어플리케이션, 소분자 억제제는 고환 혈관의 형태 형성의 역할을 조사하기 위해 이용 될 것이다. 각 기관에 광범위하게 될 어떤 프로토콜 기관 특이 수정을 결정하기 위해 검토되어야하지만,이 생체 액적 배양법, 예컨대 폐 및 잠재적으로 다른 기타 태아 기관 시스템까지 확장된다. 이 기관 배양 물 시스템은 태아의 장기와 실험에 유연성을 제공하고, 결과 obtaineD 연구자들은 태아의 개발에 대한 통찰력을 얻을 도움이 될 것입니다이 기술을 사용.

서론

인간의 생체에서 장기 재생은 매우 제한적이다 따라서, 조직 공학, 조직 및 호스트에 의해 기증 개별 세포로부터 장기 개발, 장기 교체 매력적인 잠재적 치료되고있다. 이 치료 전략이 성공하려면 그러나, 요인과 기관의 형태 형성에 관여하는 세포의 상호 작용은 철저하게 공부해야 잘 이해했다. 전통적인 접근 방식과 특정 장기의 개발을 연구 할 수 없기 때문에, 연구자들은 대체 전체 배아 또는 전체 기관 배양에 돌았 다. Kalaskar 등. 1은 체외 배양 방법은 기관 형성 연구에 대한 실현 가능한 대안 제시, 자궁 개발에 (배양 된 배아의 58 %에서) 그 생체 전체 배아 문화가 유사한 결과를 얻을 보여 주었다.

개별적인 기관 배양 시스템 등이 생체 DRO시약 또는 약물 항체의 첨가를 통해 특정한 신호 경로 또는 세포 상호 작용의 조작을 허용하면서 plet 배양 시스템은 전신 효과의 전체 기관 독립 분석을 허용한다. 전통적으로, 태아 기관 개발 연구는 모체 약물 전달 시약 이외에, 트랜스 제닉 마우스와 녹아웃 기술에 한정되어왔다. 그러나, 생체 내에서 이러한 기술과 치료에 관련된 기술적 인 문제가있다; 대부분의 문제는 종종 배아 치사를 초래 동시에 여러 장기에 영향을 미치는 영향을 중심으로 돌고. 태아의 발달을 조작하는 연구의 또 다른 관심사는 약리학 등의 시약은 태반 장벽을 통과 할 수있는 경우 (예, 약물의 산모 대사는 배아에 도달하기 전에) 및 자궁 내 배아 발달에 약물의 모성 효과입니다.

전체 기관 배양 기술은 기재된여기서 전체 태아 생식선이 생체 직립 액적 배양 배양 된 제 Maatouk 외. (2)에 의해 설명 된 프로토콜에서 적응시켰다. 태아 생식선을 배양 한 가지 중요한 이점은 소분자 억제제가 용이 단순 확산에 의해 전체 기관에 액세스 할 수 있다는 것이다. . DeFalco 등은 소분자 억제제와 결합이 생체 액적 배양 방법을 활용하는 것은 프로세스 및 생식선 3 개발 중에 발생하는 상호 작용을 시그널링 연구하기 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다; 이러한 프로세스는 기술적 문제로 생체 내에서 검사하기 어려운 것 (예를 들어, 태반 또는 유전 또는 약리학 적 접근 방식을 사용하여 여러 기관에 영향을 미치는 치사를 통해 약물의 통과).

액적 배양뿐만 아니라 자궁 실험의 특정 측면을 개선하지만, 그것은 또한 시험 관내 및 EX VI 위에 개선이다VO 시스템도. 그들은, 다양한 세포 유형 부족 장기 구조의 형성을 허용하는 중요한 세포 외 기질 (ECM) 성분이 부족하고, 캐스케이드 신호에서 아티팩트를 나타낼 수 있기 때문에, 형태 형성을 연구하는 세포주의 이용은 매우 곤란하다. 조직 공학은 ECM 시뮬레이션 지지체를 작성을 크게 향상했다하더라도, 신호 형성기 중 각 세포 타입에 의해 요구되는 관련하여 기술의 부족은 도전 체외 기관 시스템을 구축 할 수있다. 다른 생체 시스템은 이전에, 필터 (6), 기타 발판 매트릭스 7,8 기관 형성을 연구하기 위해 설립, 또는 더 구체적 형태 형성, 한천 4 태아 기관의 라이브 영상에 매우 성공적이었다, 5 트랜스 웰되었다. 액적 배양 시스템의 장점은 O를 덜 시약을 이용할 수있는 기능을 제공함으로써, 형태 형성의 연구를 허용한다는 것이다ften 비싸고, 또한 성장 및 시그널링 기능 9 중요 장기 표면 장력을주는.

마우스에서, 초기 고환의 형태 형성 배아 (E) 사이에 일어난 일 E11.5 및 E13.5 스테이지; 이러한 단계는 특정 성 분화에 영향을 미치는 요인을 조사하기위한 최적의 시간 윈도우를 포함한다. 정소 형성시 발생하는 중요한 프로세스 중에서 고환 코드 구조의 생성 및 정소 특정 혈관 네트워크의 형성이다. 이 생체 전체 기관 액적 배양 시스템을 이용하여, 하나는 남성 관련 혈관 신생을 변경 및 소분자 억제제의 사용을 통해 정소의 형태 형성을 억제 할 수 있다는 것을 블록 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체의 활성; VEGF-매개 혈관 재는 고환 개발 10-12 중요하다. 이 방법은 성공적으로 다른 장기에 적용 할 수 있으며, 특정 시간을 타겟팅 할개발의 창. 전체 마운트 장기 이미징은 중요한 구조의 시각화뿐만 아니라 다양한 억제제의 투여로 인한 구조 및 세포 변화 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 시스템은 연구자가 생체 내 표적 유전자 전략 동안 모체 약물 또는 전신 투여 중단 잠재적 교란 효과를 무시할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서,이 전체 기관 체외 액적 배양 시스템은 크게 태아 발달 동안 특정 기관 내의 구체적 발생할 상호 작용 및 신호를 이해하는 능력을 향상시킬 수있다.

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프로토콜

이들 연구에 사용 된 모든 마우스는 찰스 리버 연구소에서 얻은 CD-1 마우스였다. 이전 배양 실험은 또한 C57BL / 6J (데이터는 미도시)와 같은 다른 균주에서 수행되었지만, 임의의 변형이 사용될 수있다. 임신 성인 여성은 약 2~3개월 이전이었고, 자궁 경부 전위와 배아를 제거하기 전에 양자 개흉술 다음 CO 2 흡입을 통해 안락사시켰다. 마우스는 NIH의 지침에 따라 보관하고, 실험 프로토콜은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비

  1. 70 % 에탄올 용액을 제조 하였다. (습윤 챔버를 제조 및 / 희석 용액의 제조) 오토 클레이브에 탈 이온수. 70 % 에탄올로 아래로 분사하여 해부 도구 (집게, 가위, 27 G 바늘 주사기를) 소독.
  2. 준비ml의 1 M의 MgCl 2 CaCl2를 3.75 1 M의 PO 4, 7,425 ml의 칼슘 및 마그네슘 (80g 염화나트륨, 2g의 KCl, 14.4 g (2) 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2를 함유 10X 인산염 완충 식염수 (PBS) ). 1 L 멸균 멸균 물에 용해 후 여과지로 필터링 저어. 1X PBS를 만들기 위해 물을 10 배 희석.
  3. 가열을 30 분 동안 55 ° C에서 소 태아 혈청 (FBS)을 비활성화 필터 및 0.22 μm의 주사기 필터로 멸균.
  4. 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)로 구성된, (완전한 DMEM, cDMEM라고도 함) 38 ㎖의 1X 전체 문화 매체를 준비, 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 주식의 열 불 활성화 FBS와 1/100 희석 필터링. 이것은 일반적으로 신선한 표기하지만 1 개월, 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  5. 5 ㎎ / ㎖의 주식 농도 DMSO의 VEGFR 티로신 키나제 억제제 II (TKI II)를 재구성하고, 작업 솔루션을 만들기 위해 cDMEM으로 주식을 희석. 마지막 사기꾼이 연구에 대한 자기 중심은 cDMEM에서 1.875 μg의 / ㎖이다. 회사의 권장 사항에 따라, 스톡 용액은 -20 ℃에서 최대 6 개월 동안 안정하다. 작업 솔루션으로, 신선하고 같은 날에 사용합니다.
    주 : 작동 용액에서이 약물의 농도 (그 방울의 두 배 희석 될 것이기 때문에) 원하는 최종 농도보다 더 높은 두 배이어야한다. 동시에, "제어"치료 DMSO의 동일 부피를 함유 cDMEM 동일한 볼륨을 준비한다.
  6. 증류수에 별도로 꼬리 소화 시약 (50 mM의 NaOH를 1 M 트리스 - 염산 [pH가 8.0]) 준비합니다.
  7. XY PCR 프라이머의 25 μm의 재고 확인 (XY 앞으로 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 '와 XY 역을 5'-CCG CTG C​​CA AAT TCT TTG G-3') 함께 뉴 클레아없는 물.
  8. 50X TAE 버퍼 (242g 후, Trizma 자료, 57.1 ml의 빙초산을 준비, 100 ml의 0.5 M EDTA, pH가 8.5, 및 추가 물 1 L Fi를최종 볼륨). 1X TAE 런닝 버퍼를 준비한다 (20 ㎖ 50X TAE 1 L의 총 부피로 물로 희석).
  9. 끓는 때까지 전자 레인지에서 2.5 % 아가로 오스 용액 (0.625 g의 아가로 오스, 0.5 ml의 50X TAE 버퍼, 24.5 ml의 물), 열 아가로 오스 솔루션을 만들려면, 다음 식지 약 55 ~ 65 ° C를 (터치 수)까지. 일단 멋진, 1 % 에티 디움 브로마이드 솔루션 2 μl를 추가하고 젤을 붓는다.
    주의! 에 티듐 브로마이드 돌연변이와 기형이고; 니트릴 장갑과 적절한 안전 프로토콜 처리를 사용하십시오. 대안 적으로, 다른 잠재적으로 독성이 덜한 해결 겔 화제 또는 염료를 사용할 수있다.
  10. 면역 형광 대 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 % 소 태아 혈청 [FBS, 및 3 % 소 혈청 알부민 [BSA]를 PBS) 블로킹 용액을 제조 하였다.
  11. 면역 용 세정액 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS, 1 % FBS, 및 3 % BSA)을 준비한다.
  12. 면역을 위해 (0.1 % 트리톤 X-100과 PBS) PBTx를 준비합니다.
  13. CU의 배양 챔버를 준비합니다lture. 물을 멸균 35 ㎖로 대형 (100mm 직경) 페트리 접시를 채우십시오. 해부와 문화를 수행 할 위치 근처에 배치합니다.

뮤스의 musculus에서 태아 고환 2. 분리

  1. 매일 아침 질 플러그의 여성 마우스를 확인합니다. 질 플러그가 감지되는 날 정오가 E0.5 간주됩니다. 승인 동물 프로토콜에 따른 방식으로, E11.5로 임신 여성 마우스를 안락사.
  2. 70 % 에탄올로 마우스의 복부를 스프레이.
  3. 미세 가위를 사용하여 V 자형 절개와 배꼽 피부와 복막을 열고 내부 장기를 노출 조직의 플랩을 다시 당깁니다.
  4. 자궁의 양쪽에있는 난소를 찾습니다. 가위를 사용하여, 모체로부터 배아를 함유 자궁을 분리 난소 및 결합 조직을 절단.
  5. 부드럽게, 태반 반대 측면을 절단 난황 주머니를 노출하여 자궁 벽을 엽니 다. PU에 조심하지 수ncture 난황는 손상 또는 손실 배아를 방지 할 수 있습니다.
  6. 배아 함유 난황 주머니를 제거하고 칼슘과 마그네슘과 PBS를 포함하는 접시에 그들을 배치 태반 근처 잘라. 칼슘 및 마그네슘 이온의 존재는지지 세포 유착 분자는 조직 구조를 유지하고 절개 도구에 달라 붙는 것을 방지하기 위하여 조직을 도울 것이다.
  7. 집게로 조심스럽게 배아 밖으로 밀어 수있는 구멍을 만들 난황을 천공하여 배아의 난황과 양막을 제거합니다. 배아는 난황의 외부되면, 탯줄을 잘라.
  8. 이 시점에서, 멸균 조직 문화 후드에있는 현미경을 사용합니다. 태아의 머리를 제거하고 목의 양쪽에 집게로 집어 버린다.
  9. 꼬리를 제거하고 태아의 성별을 결정하는 XY PCR 분석을위한 새로운 microcentrifuge 관에 배치합니다.
    주 : 수확 후 가능한 빨리 배양 생식선에 최적이지만,도이다 POSsible 꼬리 DNA를 제거하고 각 태아의 성별이 알려져 있습니다 만 원하는 섹스를 배양 할 필요가 있도록, 문화에 앞서 XX / XY의 유전자형을 수행 할 수 있습니다. 유전자형이 수행되는 동안 문화에 대한 준비가 될 때까지 4 ° C 또는 얼음에 (그들이 추적 할 수 있도록), 배아 분리 유지 될 수있다. 한 가지주의해야 할 점은 자궁 또는 문화 조건에서 외부의이 기간은 잠재적으로 문화 중 문화 또는 후속 개발을위한 생존 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것이다.
  10. (일반적으로 약한 손에 개최 집게) 포셉 일쌍와 배아의 겨드랑이를 달아하여 배양 접시의 바닥에 대한 앙와위에서 배아를 고정합니다. 전체 해부 과정에서 여전히 배아를 보유하는 대신에이 집게를 유지한다.
  11. 포셉의 다른 쌍으로, 피부 커버 복부를 제거하고 부드럽게 몸 벽을 다시 노출 간, 창자, 그리고 다른 장기를 제거합니다.
  12. 생식선은 등쪽 대동맥의 양쪽에 뒤쪽 몸통 벽 상에 위치되는 바와 같이,몸의 정중선을 따라 실행 큰 혈관 폐쇄 집게와 비뇨 생식기 능선 아래 특종과 집게를 열고 들어 올려 비뇨 생식기 능선을 제거합니다. 생식선이 느슨하게 벽에 부착 될 수있는 바와 같이, 이러한 연결을 제거하지 않고 너무 빨리 끌어이나 생식선이 기관에 손상을 초래, 스트레칭 할 수있다 않도록주의하십시오.
  13. 미디어에 조직을 적응하기 위해 접시에 cDMEM으로 비뇨 생식기 능선을 이동합니다.
  14. 27 G 바늘을 사용하여 비뇨 생식기 능선의 나머지 부분에서 생식선 - mesonephros 복합체를 분리합니다. 최적의 분리를 허용하도록 압하에 의해 절단 한 조직을 정확하게 안내하도록 다른 하나를 사용하는 바늘을 사용한다. 날카로운 바늘이 조직에 충실 할 수 있습니다 플라스틱 파편을 생성하므로, 접시 바닥에 대한 톱질 동작을 사용하지 마십시오. 완전히 생식선에 부착 된 mesonephros을 유지해야합니다.

소분자 억제제 생식소 3. 배양

  1. 두 20 μ 설정15 μL를 각각 L 피펫. 다른 피펫은 약물 치료 cDMEM으로 만 사용되는 반면, 생식선 및 제어 cDMEM의 첨가 전송을위한 청소, 소독 면도날을 사용하여 장벽 피펫 팁 하나 떨어져 약 1-2mm을 잘라.
  2. 그들은 쉽게 차단 피펫 팁을 사용 할 수 있도록 피펫 팁으로 장축과 평행 생식선 일렬. 피펫 팁의 내부에 부착 생식선의주의하십시오.
  3. 하나의 제어 방울로 측과 약물 함유 방울과 다른 레이블. 단 두 방울 35mm 접시 뚜껑에 들어갈 수 있습니다. 뚜껑에 라벨 꼬리 조직 함유 마이크로 원심 튜브에 라벨과 일치하는지 확인하십시오.
  4. 소형 (35mm) 배양 접시의 뚜껑에 물방울에 하나의 생식선을 포함 cDMEM의 피펫 15 μL (바닥이 가습 배양 접시 챔버 내에 맞게 너무 키가 큰만큼, 단지 뚜껑을 사용). 접시의 양쪽에 두 개의 생식선 함유 방울을 놓고, 잘 분리 FR톰 서로. 생식선이 방울로 전송되었는지 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다.
  5. 컨트롤로 지정 방울에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들기 위해 (단계 1.5에서 만든) DMSO를 포함 cDMEM의 추가로 15 μl를 추가합니다. 약물에 문의하지 않습니다 만 "컨트롤"피​​펫을 사용합니다.
  6. 다른 방울 (약 처리 샘플)에, 30 μl의 총 부피와 방울을 만들 TKI-II 함유 cDMEM의 15 μl를 추가합니다. 약물 처리 된 샘플에 대한 지정 만 피펫을 사용합니다.
  7. 그들은 직경 약 15-18mm이다 및 생식선이 대략 중간에 위치 할 때까지 피펫을 사용하여, 확대 원형 패턴으로 방울을 확산. 그것의 측면에 거짓말과 생식선과 mesonephros 쉽게 구별 할 수 있도록 생식선의 방향. 두 개의 돌출부가 평평 누워 있도록 폐의 방향.
    1. 물방울 직경이 약간 다를 수 있지만, 생식선이 floatin되지 않도록G와는 표면 장력에 의해 장소에서 개최됩니다. 물방울이 서로 또는 덮개의 측면을 만지지 않도록합니다. 표면 장력없이 장기 따라서 장기 형태를 왜곡, 배양 동안에 성장 및 뚜껑 상에 평평하게된다.
  8. 신중 직립 큰 (100mm) 가습기 접시 물의 표면에 물방울을 함유 배양 접시에 뚜껑을 배치. 뚜껑의 하단 아래에 갇힌 기포가 없는지 확인하고는 물 표면에 평평하게 눕혀져된다. 뚜껑을 반전과 물이 물방울이있는 뚜껑의 상단에 접촉하지 않도록주의하지 마십시오.
  9. 작은, 가습 실을 만들려면, 즉시 생식소 문화를 둘러싸는 큰 가습기 접시의 뚜껑 커버. 미디어 중 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 작동한다. 작은 접시가 자유롭게 이동하는 그것과 큰 접시의 뚜껑 사이의 공간이 있는지 확인하십시오; 그렇지 않으면, 응축 실 및 b를 만들 수 있습니다조직에 잠금 공기 교환.
  10. 두 개의 작은 뚜껑이 챔버에 배치되면, 바로 인큐베이터로 챔버를 놓습니다. 37 ℃에서 가습 된 CO2 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양 액적 부화.

배아 성을 결정하기위한 제 중합 효소 연쇄 반응

  1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 바닥에 배아 꼬리를 추가합니다.
  2. 각 튜브의 50 mM NaOH를 200 μl를 추가합니다.
  3. 15 분 동안 또는 조직이 완전히 용해 될 때까지 95 ° C에서 발생.
  4. 가볍게 간단히 50 1M 트리스 - 염산의 μL와 소용돌이를 추가합니다.
  5. 0.5 ㎕의 25 μM 프라이머 용액 2.5 μL 10X의 Taq 완충액, 0.5 ㎕의 10 mM의 dNTPs를 (뉴클레오티드), 19.3 μL nuclease- : 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에, 샘플의 총 수에 의해 각각 용적을 곱하여 새로운 PCR 마스터 믹스를 만들 무료 물, 0.2 μL DNA의 Taq 중합 효소. 잘 섞는다.
  6. 23 추가PCR 마스터 믹스의 μL 소화 꼬리의 3 ㎕의 용 해물을 함유하는 PCR 튜브.
  7. 톡 튜브는 튜브의 바닥에 샘플을 가지고 짧은 스핀을 수행을 혼합한다.
  8. XY (짧은) PCR 프로그램 (표 1)를 실행합니다.
  9. 1X TAE 버퍼에 2.5 % 아가로 오스 겔과 사다리 (5 배 염료) 샘플을로드합니다.
  10. XX와 XY 밴드가 해결 될 때까지 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다.
  11. 화상 UV 광 및 캡쳐 이미지와 겔.
  12. Y 염색체 특이 밴드 대 특정 X-염색체 (X 염색체를 = 331 염기쌍 [BP]와 XY = 302 BP) 분석 (13) XY (남성) 샘플, (331)의 두 밴드와 302 BP있을 것이다 XX 반면 (여성) 샘플은 하나의 331 bp의 밴드로 나타납니다.

5. 전체 마운트 장기 면역 형광

1 일 :

  1. 차단 팁과 1,000 μL 피펫을 사용하여 문화의 생식선을 제거합니다. 원한다면, 그들은 수있다미디어 및 시약을 씻어 PBS의 접시에 배치. 0.5 ml의 microcentrifuge 관에서 PBS에 놓습니다. 작은 튜브 크기는 시약을 보존하고 쉽게 튜브에 시료를 추적 할 수 있도록한다.
    1. 잠재적 인 약물 오염을 방지하기 위해 별도의 튜브, 제어 및 처리 샘플뿐만 아니라, XX와 XY 샘플을 유지하고 피펫의 별도의 세트 문화에서 제거해야합니다.
  2. PBS로 두 번 생식선을 씻으십시오. 이 시점부터,이 프로토콜은 칼슘과 마그네슘이 부족 1X PBS를 사용할 수 있습니다. 를 세척하기 위해, 생식선이 (중력에 의해) 튜브의 바닥에 침몰하고 위의 액체를 제거 할 수 있습니다. 그들에게 너무 가까이 피펫 팅에 의해 생식선을 잃지 않도록주의하십시오.
  3. 튜브에서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. PBS는 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 4 % 파라 포름 알데히드 250 μl를 추가하고, 로커에 4 ° C에서 O / N을 배양 할 수 있습니다. 대안 적으로,이 고정은 로커에 4 ℃에서 2 시간 동안 수행 될 수있다. 주의! Paraformaldehyde는 처리 할 때 매우 안전 프로토콜을 따르 독성 물질이다.

주 2 :

  1. 실온에서 250 μL의 PBTx 두 번 생식선을 씻어.
  2. 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx과 생식선 3 회 반복한다.
  3. 로커에 실온에서 솔루션을 차단 250 μL의 생식선이 적어도 1 시간 차단합니다.
  4. 솔루션을 차단에 희석 250 μL 차 항체의 로커에 4 ° C에서 생식선 O / N을 얼룩.

주 3 :

  1. 250 μL 세척 용액에 두 번 생식선을 씻어.
  2. 로커에 실온에서 10 분마다 생식선 250 μL 세척 용액으로 3 회 반복한다.
  3. 생식선에게 로커에 실온에서 차단 솔루션 250 μL에 1 시간을 차단합니다.
  4. 광으로부터 형광 이차 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 커버.
  5. AR에 실온에서 생식선 2-4 시간을 품어ocker 대안 훽스트 33342.을 포함 차단 솔루션에 희석 250 μL 차 항체에, 로커에 4 ° C에서 이차 항체와의 Hoechst 33342 배양 O / N을 수행합니다.
  6. 250 μL PBTx 두 번 생식선을 씻어.
  7. 로커에 실온에서 10 분 각 250 μL PBTx의 생식선 3 회 반복한다.
  8. 컷오프 피펫 팁을 사용하여, 최소한의 액체와 함께 생식선 슬라이드에 옮긴다. 피펫으로 물기를 제거하지만, 조직이 건조하지 않도록해야합니다.
  9. 집게로 원하는 방식으로 생식선의 방향을, 빠르게 슬라이드의 생식선을 마운트 장착 미디어의 한 방울을 추가합니다. 설치 미디어 코트 완전히 모든 샘플 확인; 이 샘플은 건조시키는 않도록하는 것이 중요합니다.
  10. 적절한 크기의 사용 된 커버 (수 1.5 스타일) 부드럽게 샘플을 포함합니다. 커버 슬립의 전체 표면을 접촉하는 설치 미디어의 확산을 보자. 필요하다면, 매우 가볍게되도록 커버 슬립의 모서리에 눌러더 큰 기포가 없습니다.
  11. 설치 미디어의 증발을 줄이기 위해 가장자리 명확 매니큐어와 슬라이드를 밀봉합니다. 스토어는 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 장착.

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결과

생체 방울 문화는 하나, 같은 생식선으로 전체 기관을 조작하는 세포의 상호 작용과 역학을 공부하기. (1) E11.5의 생식선 방울 문화를 준비하는 방법을 단계별 방식으로 보여줍니다도 있습니다. 문화 프로토콜의 첫 번째 단계는 어머니 마우스 (그림 1A 및 1B)에서 배아 함유 자궁의 초기 제거를 포함한다. 어머니의 자궁을 제거 후, 자궁 벽 절단 및 배아 더 해부 (그림 1C-E)에 대한 PBS에 난황에서 해방된다. 내장들을 제거한 후, 비뇨 생식 융기는 배아 (도 1F)의 뒤쪽 몸통 벽을 따라 명확하게 볼 수 있고 (도 1G)를 격리한다. 생식선 - mesonephros 단지는 다음 멀리 비뇨 생식기 능선 (그림 1H)에서 해부하고, 작은 분자 억제제 (...

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토론

이 연구는 태아의 발달을 연구하는 많은 응용 가능성을 갖는 생체 전체 기관 방울 방법을 보여줍니다. 이 기술로 인해 배아 및 배아 치사의 잠재적 어려움을 사용하여 생체 내에서 생물학적 검사하기 어려운 문제를 해결하기위한 접근 연구원 여러 기관에 사용하고, 허용 할 수있다. 이 배양 방법은 포유 동물 세포주와 같은 접근 체외 다른 위에 추가적인 이점이 전체 기관 그러므로 자궁 내 존재하는 중요한 세포 간 상호 작용을 유지하면서 사용될 수있다; 배양 부피는 따라서 드문 비싼 약제 학적 시약의 매우 소량을 사용하여 (~ 30 μL) 매우 작다.

방울 문화 프로토콜의 중요한 측면은 다음과 같습니다 기관의) 깨끗한 해부. 깨끗한 해부 조직 구조가 유지 될 수 있도록 노출 절단되거나 손상된 SUR의 수를 최소화배양 접시 표면에 흡착 될 수 있으며, 문화를 방해 할 수있다면,; b) 장기 성장 및 형태 형성을 허용하기 위해 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 CancerFree KIDS Research Grant, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award(#5-FY14-32), Cincinnati Children's Hospital Medical Center(CCHMC) Trustee Grant Award, CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award, CCHMC 개발 기금의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 이 기술의 초기 최적화를 위해 Capel 실험실을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisherbrand12-550-15
커버 안경: 사각형(22mm x 22mm, No. 1.5)Fisherbrand12-541B
Sally Hansen Xtreme 매니큐어, 보이지 않는Sally Hansen
8-Strip 0.2ml PCR 튜브 & 분리된 플랫 캡GeneMateT3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2LGilsonFA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 펜치FST91150-20
파인 가위FST91460-11
Posi-Click 1.7 ml 마이크로 원심분리기 튜브DenvilleC2170
Posi-Click 0.6 ml 마이크로 원심 분리기 튜브DenvilleC2176
10 μ 엘 샤프 정밀 배리어 팁DenvilleP1096FR
20 μ l 날카로운 정밀도 방벽 끝DenvilleP1121
200 μ 엘 샤프 정밀 배리어 팁DenvilleP1122
1,000 μ 엘 샤프 정밀 배리어 팁DenvilleP1126
1 ml 주사기, 27 게이지 바늘BD PrecisionGlide309623
10 ml 주사기BD305559
0.2 μ M PES 주사기 필터VWR28145-501
등급 3 정성 여과지 표준 등급, 원형, 185mmWhatman1003-185
Primaria 35mm 이지 그립 스타일 세포 배양 접시Falcon/Corning 353801
페트리 접시, 멸균(100mm x 15mm)VWR25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 인큐베이터EppendorfCO14S-120-0000
Biosafety CabinetNuareNU-425-400
미니 원심분리기 Fisher Scientific05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XLGeneMateR-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panelEppendorf950040015
SMZ445 실체현미경NikonSMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase SoftwareAlpha Innotech Corporation단종
절대 200 증거 에탄올피셔BP2818-500
트리톤 X-100피셔BP151-100
인산나트륨 (이염 기성 MW 142) Na2< / sub>HPO4< / sub>FisherS374-1
인산 칼륨 (일염기성 MW 136) KH 2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichP5379-1KG
염화나트륨(NaCl)FisherS671-3
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP3911-1KG
염화마그네슘(MgCl2)SigmaM2393-100g
염화칼슘(CaCl2)SigmaC5670-100g
Ambion 뉴클레아제가 없는 물생명 기술AM9938 
XY PCR 입문서 IDTN/A
빙초산FisherA38-500
에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)FisherBP2482-1
1% 브롬화 에티듐 용액FisherBP1302-10독성
아가로스GeneMateE-3120-500
수산화나트륨(NaOH)시그마-알드리치367176-2.5KG
Trizma BaseSigmaT1503-1KG
dNTP 세트, 100 mM 솔루션Thermo ScientificR0182
DNA Choice Taq 중합효소 10x 버퍼DenvilleCB-4050-3
파라포름알데히드FisherO4042-500독성
FluorMount-GSouthern Biotech0100-01
염화수소 ( HCl)FisherA144212
소 혈청 알부민 (BSA), 분말, 분획 V, 열 충격 절연Bioexpress0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies11965-092
소 태아 혈청 (FBS), 트리플 100 nm 필터링Fisher03-600-511
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml)Life Technologies15140-1221:100
디메틸 설폭사이드(DMSO), Hybri-max, 멸균 필터링SigmaD2650
VEGFR 티로신 키나아제 억제제 II - CAS 269390-69-4 - CalbiochemEMD Millipore676481
Rabbit Anti-Sox9 항체MilliporeAB5535희석시 사용: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) 항체BD Pharmingen553370희석시 사용: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) 항체세포 신호9661S희석시 사용: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 항체 (ECCD-2)Life Technologies13-1900희석시 사용: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen (Molecular Probes)H1399Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-165-153Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-153Use at 희석: 1:500
당나귀 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 555 conjugateLife TechnologiesA31572희석시 사용: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA21206희석시 사용: 1:500
당나귀 anti-Rat IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA21208희석 시 사용: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 647 conjugateLife TechnologiesA31573희석 시 사용: 1:500
사용 전 열 비활성화

참고문헌

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