인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
다계통 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 면역조절 특성은 광범위한 면역 관련 질병에 대한 임상적 사용과 매우 관련이 있는 것으로 보입니다. 관련된 메커니즘이 점점 더 밝혀지고 있으며, 이 기사에서는 effector 백혈구 증식 억제를 위한 분석을 통해 MSC 면역조절을 평가하는 기본 실험에 대해 설명합니다. 활성화를 나타내는 백혈구 증식은 여러 기술로 평가할 수 있으며, 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석을 통해 백혈구를 표지하기 위해 형광 세포 염료인 carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 방사능 없이 증식을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 발생한 세포 분열의 수를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 증식하는 세포의 특정 집단 및 세포 내 사이토카인/인자 발현을 식별할 수 있습니다. 또한, MSC와 공동 배양하기 전에 단일 말초 혈액 단핵 세포 집단의 자기 비드 표면 마커 선택을 통해 효과기 백혈구의 특정 집단을 평가하도록 분석을 조정할 수 있습니다. 이 공동 배양 분석의 유연성은 MSC와 백혈구 간의 세포 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다.
서론
인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 (13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다.
전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 [3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분....
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프로토콜
기관 심사위원회가 승인 한 환자 동의서는 인간 세포의 사용을 취득해야합니다.
사람 말초 혈액 단핵 세포의 1. 밀도 구배 분리 (PBMC를)
- 25 mL를 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 전체 혈액을 헤파린 25 ML을 추가합니다.
- 인산 완충 식염수 (PBS) 25 ㎖로 희석하여 세포.
- 새로운 50 ㎖ 튜브에 피콜 - 페이크 밀도 구배의 15 mL를 넣고 튜브 틸팅 동안 전혈의 믹싱으로 존재하지 않도록 매우 조심스럽게 천천히는 밀도 구배 위에 희석 세포 현탁액 25 ㎖에 추가 밀도 구배, 즉., 혈액 - 밀도 구배 인터페이스의 방해없이.
- 원심 분리기 20 ° C에서 브레이크없이 30 온도 조절 스윙 버킷 로터에서 분 40 400 × g에서 1.2 단계에서 정지.
참고 : 세 가지 층은 원심 분리 후 명백하다 : 일즉 상층 존재 플라즈마; 바닥 클리어 층은 피콜 - 페이크 밀도 구배되며; 및 얇은 층은 중간 셀룰러 PBMC를 되 - 기음과는 단핵 세포 (즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 계면 층을 방해하지 않도록주의로, 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 버린다.
- 조심스럽게 새로운 50 ....
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결과
도 1은 실험의 전반적인 스키마를 나타내고,도 2는 위상차 도립 현미경으로 가시화로서 다양한 세포 배양 조건의 모양을 보여준다. PBMC를하고 백혈구가 작은 원형 비 부착 세포 반면 중간 엽 줄기 세포는 섬유 모세포, 스핀들 모양의 형태와 부착 세포이다. 이 두 형태 학적으로 상이한 세포 유형은 명확 공존 배양에서 볼 수있다. 시험의 끝에, PBMC를 (또는 leuckotyes)를 유세포위한 흡인 될 때 점착성 엽 줄기 세포가 우연히 평가 아무런 문제가 없을 것, (열악한 부착 또는 격렬한 흡인 탈락에, IE)에 포함되는 경우에도, 분석 이 세포 이후 PBMC / 백혈구 분획 CFSE으로 표시됩니다. 더 확산이없는 경우, CFSE 표지 세포에 대한 히스토그램 결과는 하나 매우 긍정적이고 날카로운 피크로 볼 수 있습니다; 활성화가 발생한 경우에는, 확산이 발현 된 B로서 명백 할 것이다손실 및 형광 강도의 왼쪽 시프트 (그림 3)와 Y 여러 개의 작은 봉우리........
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토론
점점 더 MSC의 면역 조절 특성이 이러한 줄기 세포의 다계통 용량보다 더 빠르게 임상 사용으로 전환되고 있습니다18-20. 따라서 MSC와 백혈구의 공동 배양 기술 및 면역 기능을 평가하기 위한 분석은 효과적인 치료 적용을 최적화하기 위해 이러한 특성과 관련된 특정 메커니즘을 추가로 설명하는 데 중요합니다.
이러한 분석의 성공을 위한 가장 중요한 기술적 측면 중 하나는 적절한 PBMC 수를 갖는 것이며, 이는 헤파린화된 전혈 샘플의 시작 세포 수와 밀도 구배 분리 후 PBMC 순도에 따라 달라집니다(단계 1.3). 전혈과 밀도 구배 사이에 혼합되지 않도록 전혈을 밀도 구배에 조심스럽게 겹쳐 놓는 것은 적혈구와 혈소판을 배제하는 데 중요합니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 강력한 증식을 위해 이펙터 백혈구의 적절한 활성화가 필요하다는 것이며, 그렇지 않으면 억제를 식별하기 어렵습니다. 이는 순도뿐만 아니라 인간 백혈구 시작의 품질에 따라 달라지며, 이는 분석.......
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공개 사항
우리는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NHRI(CS-104-PP-06에서 B.L.Y.)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리를 위한 밀도 그랑ientVibrant |
| CFDA-SE 세포 추적 키트(CFSE) | Life Technologies | V12883 | 세포 분열 검출용 세포 라벨 |
| Phytoagglutininin(PHA) | Sigma | L8902 | 인간 PBMC의 활성화 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | 인간 T 림프구의 활성화, 예: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, etc. |
| autoMACS™ 분리기 | Miltenyi Biotec | autoMACS™ 분리기 | 자기 기반 셀 분리기 |
| autoMACS® 열 | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | 분리 열 |
| CD14 마이크로비즈, 인간 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | PBMC CD4 마이크로비즈에서 CD14+ 인간 단핵구 및 대식세포의 긍정적인 선택을 위해 |
| Miltenyi Biotec | 130-045-101 | PBMC에서 CD4+ 인간 T 림프구의 양성 선택을 위해 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | 인간 PBMC/백혈구 배양 배지 |
| DMEM, 저포도당, 피루브산 | Life Technologies | 11885 | 인간 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 배지 |
| L-글루타민 | Life Technologies | 25030-081 | MSC 완전 배지 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15070-063 | 보충 PBMC/백혈구 및 MSC 완전 배지 |
| 태아 소 혈청(FBS) | ) Hyclone, MSC 배양용 2) Life Technologies, 다른 모든 세포 (즉, PBMC, 특정 백혈구 집단) | 1) SH30070.03M 2) MSC | in vitro 배양 |
| 24-웰 세포 배양 플레이트 | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | Corning | 430291 | Ficoll-Paque PLUS 15 ml 원심분리기 튜브에 의한 전혈 분리 PBMCs 지원을 |
| ; | Corning | 430766 | 표지 및 표지되지 않은 세포 분획 수집 |
| 둥근 바닥 튜브 | BD Falcon | 352008 | 유세포 분석을 위한 세포 수집 |
참고문헌
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J.
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재인쇄 및 허가
