방법 논문

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

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DOI:

10.3791/53265

⸱

2015년 12월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center

이 논문에서

요약

인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.

초록

다계통 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 면역조절 특성은 광범위한 면역 관련 질병에 대한 임상적 사용과 매우 관련이 있는 것으로 보입니다. 관련된 메커니즘이 점점 더 밝혀지고 있으며, 이 기사에서는 effector 백혈구 증식 억제를 위한 분석을 통해 MSC 면역조절을 평가하는 기본 실험에 대해 설명합니다. 활성화를 나타내는 백혈구 증식은 여러 기술로 평가할 수 있으며, 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석을 통해 백혈구를 표지하기 위해 형광 세포 염료인 carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 방사능 없이 증식을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 발생한 세포 분열의 수를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 증식하는 세포의 특정 집단 및 세포 내 사이토카인/인자 발현을 식별할 수 있습니다. 또한, MSC와 공동 배양하기 전에 단일 말초 혈액 단핵 세포 집단의 자기 비드 표면 마커 선택을 통해 효과기 백혈구의 특정 집단을 평가하도록 분석을 조정할 수 있습니다. 이 공동 배양 분석의 유연성은 MSC와 백혈구 간의 세포 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다.

서론

인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 (13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다.

전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 [3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분석은 여러 유형의 세포를 포함하는 공동 배양 실험에 특히 유용하다 특정 세포 개체수의 식별을 허용하는 다른 이점을 갖는다. CFSE은 유세포 분석에 의해 평가 될 수 셀룰러 형광 염료이다. 세포 분열,이 휴대 라벨의 강도는 비례 적으로 감소된다; 이뿐만 아니라 전반적인 세​​포 증식의 판정을 가능하게 할뿐만 아니라 형광 DET 곤란해진다 전에 8 분할 최대 세포 분열 횟수에 평가를 허용요법 배경 신호에 대하여. 또한, 형광 CFSE의 안정성은 많은 세포가 14 개월까지 가시화 될 수있는 표지 된 세포를 생체 내 추적을 허용한다.

이 분석은 또한 이펙터 백혈구 또는 특정 집단의 면역 기능의 특정 유형을 평가하기 위해 변화 될 수의 자성 비드 표면 마커의 선택을 행함으로써 면역 백혈구 - 인터루킨 10 (IL-10)의 제조 CD14 + 단핵구 15를 MSC를 유발 이전에 또는 적절한 공동 배양 한 후 관심의 세포 집단. 우리 프로토콜 (흐름도가 도시는 (플로우 차트는도 1에 도시) 이펙터 백혈구에서 중간 엽 줄기 세포의 면역 조절 효과를 평가의 기본적인 분석 및 동종 CD4 + 이펙터 T 림프구에 MSC 유도 백혈구 면역 평가를위한 기본적인 분석의 변형을 설명 그림 4).

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프로토콜

기관 심사위원회가 승인 한 환자 동의서는 인간 세포의 사용을 취득해야합니다.

사람 말초 혈액 단핵 세포의 1. 밀도 구배 분리 (PBMC를)

  1. 25 mL를 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 전체 혈액을 헤파린 25 ML을 추가합니다.
    1. 인산 완충 식염수 (PBS) 25 ㎖로 희석하여 세포.
  2. 새로운 50 ㎖ 튜브에 피콜 - 페이크 밀도 구배의 15 mL를 넣고 튜브 틸팅 동안 전혈의 믹싱으로 존재하지 않도록 매우 조심스럽게 천천히는 밀도 구배 위에 희석 세포 현탁액 25 ㎖에 추가 밀도 구배, 즉., 혈액 - 밀도 구배 인터페이스의 방해없이.
  3. 원심 분리기 20 ° C에서 브레이크없이 30 온도 조절 스윙 버킷 로터에서 분 40 400 × g에서 1.2 단계에서 정지.
    참고 : 세 가지 층은 원심 분리 후 명백하다 : 일즉 상층 존재 플라즈마; 바닥 클리어 층은 피콜 - 페이크 밀도 구배되며; 및 얇은 층은 중간 셀룰러 PBMC를 되
  4. 기음과는 단핵 세포 (즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 계면 층을 방해하지 않도록주의로, 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 버린다.
  5. 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 10 ㎖ 피펫이 단핵 세포층을 수집한다.
  6. , PBS의 20 ㎖와 튜브를 채우 잘 혼합하고, 20 ℃에서 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
  7. 20 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 200 × g에서 세포 PBS 20ml에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
    참고 :이 단계는 혈소판 - 원치 않는-내에서 PBMC를하다을 제거; 이 단계는 혈소판의 완전한 제거를 보장하기 위해 반복 될 수있다.
  8. 특정 집단의 선택 범위가 없으면세포 수 (16)를 수행 한 후, 배양을 위해 바람직한, 백혈구 완전 배지에 재현 탁 된 세포 펠릿 (10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / RPMI-1640 배지에서 스트렙토 마이신)을 1 ml의 중단을 다음 단계로 진행하기 전에 10 7 PBMC를 당 매체.

백혈구 인구 2. 자기 라벨링 (특정 집단의 어떤 선택이 필요없는 경우 4 단계로 건너 뜁니다)

  1. 완전히 10 분, 흡인 상층 액 300 × g에서 원심 분리기 PBMC 서스펜션.
  2. 10 7 총 세포 당 PBS의 80 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
  3. 10 7 총 세포 당 (T 림프구의 분리를위한 단핵 세포, CD4 자석 구슬의 격리를 위해 즉, CD14 자석 구슬) 지정된 자석 구슬의 20 μl를 추가합니다.
  4. 잘 섞어 냉장고에 8 ° C에 2에서 15 분 동안 품어.
  5. 씻어 10 7 세포 당 PBS의 1-2 ML을 추가하고, 원심 분리기10 분 동안 300 × g에서.
  6. 대기음 상층 액을 완전히 PBS 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁.

백혈구의 부분 집단 3. 자기 선택

참고 : 자기 비드 구분과 열의 다양한 제조 업체의 수와 세포 표면 마커에 의한 백혈구의 특정 인구의 분리에 사용할 수 있습니다. 격리 하나 또는 몇 가지 긍정적 인 마커 또는 원치 않는 인구의 고갈 후 음의 선택에 기반한 선택에 의해 할 수있다. (즉, 단핵구에 대한 CD4 T 헬퍼 림프구에 대한, 또는 CD14) 한 마커를 사용하여 긍정적 인 선택을 수행하는 일반적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

  1. 준비 및 주요 마그네틱 분리기는 제조업체의 지침에 따라 분리 컬럼을 포함.
  2. 표시 PBMC를의 샘플이 포함 튜브를 적용합니다. 긍정적으로 표지 및 unlabel의 수집이 15 ml의 원심 분리기 튜브를 제공합니다제조업체의 지침에 따라 에드 셀 분수,.
  3. 107 세포 당 1 ml의 배지를 이용하여 세포 수를 카운트하고 15 백혈구 완전 배지에서 긍정적으로 선택된 백혈구 (예, CD4 + T 림프구 또는 CD14 + 세포)를 재현 탁.

대량 살상 무기 확산의 평가를위한 백혈구 4. CFSE 얼룩

주 : CFSE 널리 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두, 면역 학적 조사에 사용되었다. 우리의 프로토콜은 MSC / PBMC (또는 다른 백혈구)의 상호 작용의 체외 연구를 위해 최적화되었습니다. CFSE 체외 라벨을 수행에 관련된 일반적인 단계는 유사하지만, 프로토콜 (14)의 특정 용량과 타이밍의 차이가있을 수 있습니다. 이 때문에 다수의 인자, 즉, 사용 된 특정 세포 유형, 세포 수로 사용할 수 있고-있는 가능성 CFSE 형광 신호의 강도에 영향을 미칠 수있다.

  1. 10 μm의 (CFSE - 작업 솔루션)의 원하는 작업 농도로 PBS에서 CFSE 주식 솔루션 (10 mm)를 희석. CFSE-작동 용액으로 라벨링 10 7 세포 (즉, PBMC를 또는 T 세포)를 준비한다.
  2. 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기는 세포 펠렛을 얻고 뜨는을 대기음합니다.
  3. 부드럽게 예열 (37 ° C) CFSE-작동 용액 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 37 ℃에서 10 분 동안 세포를 배양한다.
  4. 과량 CFSE을 씻어, 예비 냉각 (4 ℃) RPMI 배지를 10 % FBS를 함유하는 (부피 기준)으로 10 배의 세포 현탁액을 희석. 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 세포 침전물과 상층 액을 버린다. 두 번 더 이런 방식으로 세포 펠렛을 씻으십시오.
  5. 원심 분리하여 세포를 다시 펠렛 세포 수 (15)를 계산. 1 ㎖의 백혈구 데워진 신선한 완전 배지에서 10 7 세포 (PBMC를 또는 T 세포를) 재현 탁.

M 5. 공동 문화백혈구 및 백혈구의 활성화와 희주

  1. 이하에서 30 분 동안 37 ° C까지 미리 따뜻한 MSC 완전 배지 (최적 MSC 성장을위한 테스트 된 10 % FBS (), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / DMEM 낮은 포도당 배지에서 스트렙토 마이신).
  2. 24 웰 플레이트에서 MSC 완전 배지 1 ㎖에 50,000 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 시드 엽 줄기 37 ° C의 배양기에 부착 O / N에 대한, 줄기 세포 수는 80 % 합류에 도달한다.
  3. 시드 MSC 번호를 기반으로 대기음 매체와는 CFSE 표지 PBMC를 추가 (이전에 표시된 제발 위의 프로토콜 4 단계 참조)에 백혈구 완전 배지 1 ㎖에 (24 웰 플레이트에 전날 시드) 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 1시 10분 (셀 비율)로 PBMC를 엽 줄기 세포의 공동 배양 비율.
  4. 1 ㎖의 백혈구 완전 배지의 총 부피에서 10 μg의 / ml의 최종 농도로, 미토 겐의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA), 비특이적 백혈구 활성화 제를 추가 웰당.
    1. Alternativ엘리는, 구체적으로 T 림프구의 활성화를 자극하기 위해 : α-CD3 / 28 마이크로 비드를 사용하여 (1)의 비드 간 T 림프구의 비율을 얻기 위해 두 세포 공동 배양에 추가 1.
  5. 50 PBMC를 / 웰 음성 대조군, 플레이트 (; 세포 밀도 또는 특정 이펙터 백혈구 인구 : 25 만 백혈구 / ㎠)의 경우 만 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와 24 웰 플레이트에; 양성 대조군을 위해, 추가로, PBMC를 웰 / 동일한 수의 도금을 10 μg / ML의 최종 농도로 PHA를 추가한다.
  6. 3와 공동 배양 실험 5 일에, 형광에 적합한 488 nm의 여기 및 방출 필터와 유세포 분석 (17)에 의해 CFSE 표지 백혈구의 증식 (둥근 바닥 튜브에 배치)을 평가한다.
    주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 또한 MO 같은 백혈구 사이토 카인 발현 양상의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 이러한 CFSE로 표지 백혈구를 위해 수행 될 수있다중간 엽 줄기 세포에 의해 dulated. CFSE이 형광 용 필터에 적절한 평가되기 때문에, 항체는 각종 사이토 카인이 형광 또는 유사한 스펙트럼 이외의 형광 색소에 접합 될 필요가 평가하도록 선택 (즉, 피코 에리 트린, 엽록소 단백질 복합체 (를 PerCP) peridinin).

6. 변화 : 이펙터 억제 분석 마그네틱 활성화 CFSE 표지 이펙터 CD4 + T 세포에 면역 백혈구를 MSC 유도, 비드 선택

  1. 6 웰 플레이트에 MSC 전체 매체의 3 ㎖에 25 만 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 / ㎠)에서 종자 중간 엽 줄기 세포 37 ° C 배양기에 부착 O / N를 들어, 줄기 세포 수는 80 %의 합류에 도달합니다. 적어도 3 개의 6- 웰 플레이트 모집단 선택 충분한 MSC-PBMC를 공 배양을 보장하기 위해 필요하다.
  2. 대기음 매체는, 및 1 단계에 따라하지만 / 웰 (세포 밀도 2.5 × 10 6 세포에서 6 웰 플레이트에서 분리 PBMC를 추가 : 250,000 르를백혈구 전체 매체의 3 ㎖와 ukocytes / ㎠). 37 ° C 배양기에서 48 ~ 72 시간 동안 공동 문화.
  3. 자기 섹션 2-3에 따라 MSC에 의한 면역 백혈구 (즉, CD14 + 세포)의 특정 인구 비드-선택합니다.
    주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 백혈구 사이토 카인의 발현 프로필, 즉, 발현의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 수행 될 수있다 인터루킨 10와 같은 MSC들에 의해 변조.
  4. 24 웰 플레이트 섹션 2-4에 따라 생성 된 동종 CD4 + T 세포를 CFSE 표지 된 추가 한 백혈구 완전 배지 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠) ml의 다양한 비율로 비드 선택된 MSC 유도 백혈구에 즉, 1:10, 1 : 5, 1 : 2, 1 : 1 비율 (셀로 셀).
  5. CD4 + T 세포를 자극하기 위해, (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 28 공액 마이크로 비드를 추가 1.
  6. 음성 대조군은 5 판00,000 CD4 + T 세포 / 웰로 24- 웰 플레이트 (T 세포 밀도 250,000 세포 / ㎠)에 단 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와; 양성 대조군을 위해, 추가로 (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 공액 마이크로 비드 (28)를 추가 / 웰의 CD4 + T 세포의 수를 동일한 도금 : 1이다.
  7. 공동 배양 3 일째에, 플루오 레세 적합한 488 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 유세포 분석 (16)에 의해 (둥근 바닥 튜브에 배치) CFSE 표지 된 CD4 + T 세포의 증식을 평가.

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결과

도 1은 실험의 전반적인 스키마를 나타내고,도 2는 위상차 도립 현미경으로 가시화로서 다양한 세포 배양 조건의 모양을 보여준다. PBMC를하고 백혈구가 작은 원형 비 부착 세포 반면 중간 엽 줄기 세포는 섬유 모세포, 스핀들 모양의 형태와 부착 세포이다. 이 두 형태 학적으로 상이한 세포 유형은 명확 공존 배양에서 볼 수있다. 시험의 끝에, PBMC를 (또는 leuckotyes)를 유세포위한 흡인 될 때 점착성 엽 줄기 세포가 우연히 평가 아무런 문제가 없을 것, (열악한 부착 또는 격렬한 흡인 탈락에, IE)에 포함되는 경우에도, 분석 이 세포 이후 PBMC / 백혈구 분획 CFSE으로 표시됩니다. 더 확산이없는 경우, CFSE 표지 세포에 대한 히스토그램 결과는 하나 매우 긍정적이고 날카로운 피크로 볼 수 있습니다; 활성화가 발생한 경우에는, 확산이 발현 된 B로서 명백 할 것이다손실 및 형광 강도의 왼쪽 시프트 (그림 3)와 Y 여러 개의 작은 봉우리....

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토론

점점 더 MSC의 면역 조절 특성이 이러한 줄기 세포의 다계통 용량보다 더 빠르게 임상 사용으로 전환되고 있습니다18-20. 따라서 MSC와 백혈구의 공동 배양 기술 및 면역 기능을 평가하기 위한 분석은 효과적인 치료 적용을 최적화하기 위해 이러한 특성과 관련된 특정 메커니즘을 추가로 설명하는 데 중요합니다.

이러한 분석의 성공을 위한 가장 중요한 기술적 측면 중 하나는 적절한 PBMC 수를 갖는 것이며, 이는 헤파린화된 전혈 샘플의 시작 세포 수와 밀도 구배 분리 후 PBMC 순도에 따라 달라집니다(단계 1.3). 전혈과 밀도 구배 사이에 혼합되지 않도록 전혈을 밀도 구배에 조심스럽게 겹쳐 놓는 것은 적혈구와 혈소판을 배제하는 데 중요합니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 강력한 증식을 위해 이펙터 백혈구의 적절한 활성화가 필요하다는 것이며, 그렇지 않으면 억제를 식별하기 어렵습니다. 이는 순도뿐만 아니라 인간 백혈구 시작의 품질에 따라 달라지며, 이는 분석...

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공개 사항

우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NHRI(CS-104-PP-06에서 B.L.Y.)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare71-7167-00 AG말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리를 위한 밀도 그랑ientVibrant
CFDA-SE 세포 추적 키트(CFSE)Life TechnologiesV12883세포 분열 검출용 세포 라벨
Phytoagglutininin(PHA)SigmaL8902인간 PBMC의 활성화
Dynabeads Human T-Activator CD3/28Life Technologies111.32D인간 T 림프구의 활성화, 예: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, etc.
autoMACS™ 분리기Miltenyi BiotecautoMACS™ 분리기자기 기반 셀 분리기
autoMACS® 열Miltenyi Biotec130-021-101분리 열
CD14 마이크로비즈, 인간 Miltenyi Biotec130-050-201PBMC CD4 마이크로비즈에서 CD14+ 인간 단핵구 및 대식세포의 긍정적인 선택을 위해
 Miltenyi Biotec130-045-101PBMC에서 CD4+ 인간 T 림프구의 양성 선택을 위해
RPMI 1640 MediumLife Technologies11875인간 PBMC/백혈구 배양 배지
DMEM, 저포도당, 피루브산Life Technologies11885인간 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 배지
L-글루타민Life Technologies25030-081MSC 완전 배지
페니실린/스트렙토마이신생명 기술15070-063보충 PBMC/백혈구 및 MSC 완전 배지
태아 소 혈청(FBS)) Hyclone, MSC 배양용                                    2) Life Technologies, 다른 모든 세포 (즉, PBMC, 특정 백혈구 집단)1) SH30070.03M 2) MSCin vitro 배양
24-웰 세포 배양 플레이트CorningCOR3524Co-culture plate
50 ml 원심분리기 튜브Corning430291Ficoll-Paque PLUS 15 ml 원심분리기 튜브에 의한 전혈 분리 PBMCs 지원을
;Corning430766표지 및 표지되지 않은 세포 분획 수집
둥근 바닥 튜브BD Falcon 352008유세포 분석을 위한 세포 수집
에 대한 보충1 위한 10091-148 사전 테스트 로트

참고문헌

  1. Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  3. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
  4. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
  7. Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
  8. Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
  9. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
  10. Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
  11. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
  12. Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
  13. Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
  14. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  15. Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
  16. Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
  17. Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
  18. Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
  19. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
  20. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
  21. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
  22. Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
  23. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
  24. Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).

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