방법 논문

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

DOI:

10.3791/53280

⸱

2015년 12월 14일

 , 
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

이 논문에서

요약

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이 논문의 목표는 표피 각질세포와 활력을 잃은 인간 진피로부터 유전적으로 변형된 인간 유기형 피부를 생성하는 방법에 대한 포괄적이고 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

초록

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의 Organotypic 문화 기능과 생체 조직의 대응의 생리를 모방 세포 - 세포 연락처 및 세포 - 기질 상호 작용에 중요한 3D 환경의 재구성 할 수 있습니다. 이 충실히 표피 분화와 계층화 프로그램을 되풀이되었습니다의 Organotypic 피부 배양을들 수있다. 기본 인간의 표피 각질 세포는 유전자가 쉽게 과발현 또는 무너 뜨렸다 수 있습니다 레트로 바이러스를 통해 유전자 조작 될 수 있습니다. 이러한 유 전적으로 변형 된 각질 세포는 유전자 전달 경로에 충격을 표피 성장, 분화, 및 질병 진행을 연구하는 모델을 제공하는 강력한의 Organotypic 피부 배양 인간 표피를 재생성하기 위해 사용될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 약화 된 인간의 진피를 준비뿐만 아니라 유 전적으로 피부의 Organotypic 문화를 생성하기 위해 기본 인간의 각질 세포를 조작하는 방법을 설명합니다. 인간의 피부는 재생 downstr 사용될 수있다이러한 유전자 발현 프로파일, 면역 및 높은 처리량 시퀀싱 하였다 염색질 면역 침전 등 EAM 애플리케이션. 따라서, 이러한 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성은 피부의 항상성 유지에 중요한 유전자의 결정을하실 수 있습니다.

서론

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인간 표피뿐만 아니라이 아니라를 보호하는 제 1의 방어선 수분의 손실을 방지하는 불 투과성 장벽 역할 기저막 zone.The 표피로 알려진 세포 외 기질을 통해 하부 진피에 연결 성층 상피이고 외국과 독성 물질 1 몸. 표피의 가장 깊은 층 인 기저층은, 표피 (2)의 나머지를 형성하는 분화 된 자손을 야기 표피 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 상피 전구 세포는 분화 된 바와 같이 그들은 가시 층 (3)으로 알려진 분화 된 세포의 제 1 층을 형성하기 위해 위쪽으로 이동한다. 가시 층에서, 세포는 표피의 분화 층 물리적 응력을 견딜 수 있도록 강도를 제공 케라틴 1 내지 10의 발현에 차례. 가시 층 세포는 상기 차별화 된 바와 같이, 그들에 대한 표피의 위쪽으로 이동세포막 아래 조립 keratohyalin와 라멜라 과립의 형성뿐만 아니라, 구조 단백질을 특징으로 과립 층 미터. 세포 분화 과정에서 진행하는 라멜라 과립이 풍부한 층은 각질층 4라는 지질을 형성하는 셀로부터 압출되는 동안, 세포막 밑 단백질은 서로 결합 가교이다.

상피 세포 성장과 분화에 미치는 영향 ~ 인구 5의 20 %의 변화를 포함하는 질병. 따라서,이 과정의 기전을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 질병의 많은 표현이 세포 - 세포 또는 세포 - 매트릭스 접촉에 달려 있기 때문에, 인간의 표피가 3D 환경에서 재구성의 Organotypic 문화 6-10 만들어졌습니다. 이들 방법은 일반적으로 약화 된 인간과 같은 세포 외 기질에 파종 차 또는 변환 된 각화 세포의 사용을 포함진피, 마트 리겔, 또는 콜라겐.

표피 성장과 분화에 중요한 유전자 조절 기전을 이해하기 위하여 케 라티노 유전자 차원 배양 유전자 녹다운 또는 과발현하는 레트로 바이러스 벡터를 통해 조작 된 후 3D로 재구성 될 수있다. 이러한 방법은 종양 11-21 표피 줄기 및 전구 세포자가 재생과 분화뿐만 아니라 진행에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 여기서, 레트로 바이러스를 사용하여 배양 물에서, 표피의 Organotypic 유전자 발현을 변경하는 방법에 대한 심도있는 프로토콜이 제공된다.

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프로토콜

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인간의 피부 프로토콜 캘리포니아 대학, 샌디에고의 연구 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 인간의 피부는 폐기 수술 샘플에서 얻은 또는 (피부 은행이 소재 / 장비의 표에 나와있는) 피부 은행에서 구입하실 수 있습니다. 피부 또는 기증자의 나이 파생 위치는 실험만큼 진피의 기저막 영역 단백질 (콜라겐 / 라미닌)에 중요하지 않은 것은 성능이 저하되지 않습니다.

약화 된 인간의 진피 1. 준비

  1. 인간의 피부를 수신하면, (~ 3-5 분) 해동 조직 배양 후드에서 조직을 배치. 피부의 크기에 따라, 일회용 무균 50 ㎖ 원뿔형 튜브 또는 125 ml의 용기에 해동 조직을 배치. 피부 은행에서 피부의 전형적인 크기는 0.75 평방 피트입니다.
  2. 1X PBS에서 4 배 페니실린과 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄 구균)와 75 %의 전체 컨테이너를 채 웁니다. 격렬하게 흔들어5 분 및 액체 폐기하십시오. 이 단계를 3 번​​ 이상 반복합니다.
  3. 마지막 세척 후, 새로운 튜브 / 병에 조직을 전송하고 컨테이너의 75 %를 채우기 위해 신선한 배 펜 / 패 혈성 / PBS를 추가합니다. 2 주부터 표피 진피의 분리를 허용하기 위해 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서이 혼합물을 배양한다.
  4. 무균 조건에서, 진피에서 표피를 벗겨 집게를 사용합니다. 표피는 기증자 (그림 1A)의 인종에 따라 색상이 반면 진피는 완전히 흰색입니다. 인체 조직을 다루는 기관의 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오.
  5. 관 또는 병에 진피를 놓고 (4 시간 5 분 세척) 활발한 진탕 1X PBS에 희석 배 펜 / 연쇄상 구균에 씻는다. 마지막 세척 후 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 4 배 펜 / 1X PBS에 희석 연쇄 구균과 상점에서 새로운 튜브 / 병에 진피를 전송합니다. 진피 년까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.

2. 유전자 수정 기본 인간의 각질 형성 세포

주 : 차 인간 각화 세포를 감염 바이러스를 생산하기 위해 완벽한 DMEM 배지 [DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) + 펜 / 연쇄상] 재배 사용 amphotropic 피닉스 세포. 이러한 개그-POL 및 봉투와 같은 단백질을 인코딩 바이러스 성 포장 유전자가 안정적으로 레트로 바이러스 벡터로 형질 전환 된 경우 바이러스 생산을 허용 피닉스 세포 게놈에 통합되어 있습니다. 피닉스 세포 고효율 높은 역가의 바이러스 생산을위한 형질 허용 될 수있다. 이 포장 라인에서 생산 된 바이러스는 인간을 포함한 포유 동물 세포의 큰 다양성을 감염시킬 수 있습니다.

  1. 1 일 : 형질 전날, 완전한 DMEM 매체 잘 당 800,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 피닉스 세포.
  2. 주 2 : 형질의 날, 3 레트로 바이러스 벡터의 μg의 당을 잘 사용합니다. 1.5 ML 튜브에 레트로 바이러스 벡터의 나누어지는 3 μg의. 100 μ의 혼합을 사​​용하여; L의 DMEM 플러스 벡터의 모든 3 μg의에 대한 형질 전환 시약의 6 μL. 1.5 ML 튜브에 100 μL의 DMEM으로 형질 전환 시약의 6 μl를 섞는다. (사용되는 레트로 바이러스 벡터는 장비 / 재료 표에 나와 있습니다).
    1. 5 분 동안 인큐베이션 및 레트로 바이러스 벡터를 함유하는 3 μg의 사전 분취 튜브에 106 ㎕의 혼합물을 추가한다. 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 피닉스 세포의 각 웰이 전체 혼합물의 적가를 추가합니다.
  3. 주 3 : 형질 전환 후 날, 피닉스 세포에서 미디어를 제거하고 신선한 완전한 DMEM 배지 2 ㎖를 추가합니다. 같은 날에, 웰 당 75,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 차 인간 각화 세포를 시드. 항생제와 각질 세포의 무 혈청 배지 (KCSFM) (펜 / 연쇄상 구균)에있는 각질을 유지한다.
    참고 : 1 차 인간의 각질 세포가 구입 하였다. 세포 (소재 / 장비의 표에 나와있는) 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다.
  4. 주 4 : 하르지금은 바이러스 입자를 포함하는 형질 전환 피닉스 세포에서 용지를 가득. 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 미디어를 전달 (모든 오염 피닉스 세포를 제거하기 위해) 및 각질 형성 세포에 2 ml의 배치 (전날 / 잘 75,000 세포에서 도금 : 단계 2.3 참조). 감염 과정을 중재하기 위해 언론에 hexadimethrine 브로마이드 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 바이러스 역가는 ~ 1 × 10 7 TU / ㎖이다.
    1. RT에서 1 시간 동안 200 XG에서 원심 분리기에서 6 웰 플레이트 스핀. 스핀 후, 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하고 KCSFM를 추가하기 전에 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오.
  5. 제 5 일 : 단계를 다시 2.4로 각질 세포의 동일한 배치를 감염.
    참고 : 레트로 바이러스 벡터의 선택 마커가있는 경우 약물을 사용하여 각질을 선택하고 다운 스트림 분석 또는의 Organotypic 문화 등의 용도로 확장합니다.

3. 피부의 Organotypic 문화를 설정

  1. 구축일반 실험실에있는 자료 또는 카세트에서의 Organotypic 카세트 사용자 정의 금속 제조 가게를 통해 할 수있다 (그림 2A - F). 3.5 cm 조직 문화 판에서 이러한 카세트를하려면, 3.5 cm 접시 (그림 2A-B)의 뚜껑의 중심에서 1.0 cm X 1.0 cm 사각형을 제거하는 소작을 사용합니다. 무균 상태에서이 작업을 수행합니다.
    1. 명확한 매니큐어 (그림 2C)를 사용하여 카세트 (3.5 cm 접시의 뚜껑)의 바닥에 사각형 못을 연결합니다. 매니큐어 5 분 건조하고 광장 못 (그림 2D)에 쉬고되도록 카세트를 뒤집어하도록 허용합니다. 6cm 접시에 카세트를 놓습니다.
      참고 : 광장 예술과 공예 상점의 다양한에서 구입하실 수 있습니다 쐐기.
  2. 각질 세포 성장 배지 DMEM 66 %, 22 %, 햄 F12, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % FBS, 2.67 μg의 / ㎖ 아데닌 100 μg의 40 N로 구성된 (KGM)를 준비g / ㎖ 하이드로 코르티손, 10 NG / ㎖ 콜레라 독소, 4.94 / ㎖ μg의 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 1.36 NG / ㎖ Triiodo-L-로닌, 10 NG / ㎖ EGF 및 10 μg의 / ㎖ 시프로플록사신 염산염. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 미디어를 필터링합니다.
  3. 배 펜 / 연쇄상 구균 + PBS 용액에서 진피를 타고 KGM에서 2 회 반복 한 후 사용하기 전에 이틀 동안 37 ° C에서 KGM에 품어.
  4. 1.5 cm X 1.5 cm 크기의 조각으로 메스를 사용하여 진피를 잘라 다음의 Organotypic 카세트에 배치합니다. 이 위를 향하게하여 진피의 상부와 진피를 놓습니다. 진피의 정상은 각질 세포 (그림 1B)와 접촉하는면 될 것입니다.
  5. (그림 3A)를 직면하고있는 진피의 상부면의 Organotypic 카세트의 사각형 구멍에 사전 컷 진피를 놓습니다.
  6. 집게를 사용하여 위에 진피를 함유하는 전체의 Organotypic 카세트 (도 3b 플립). 얼음 외 기질 용액을 해동. 카세트 당 세포 외 기질 용액 100 μL를 그려 바늘과 주사기를 사용합니다. 진피 (광택면)의 바닥에 5 방울을 추가하고 진피 (그림 3B)에 걸쳐 고른 분포를 확인하기 위해 약간 흔들.
  7. 상업 세포 외 매트릭스 솔루션을위한 5 분은 완전히 (그림 3C)를 공고히 할 수 있습니다. 응고 후, 다시 위에 카세트를 플립 집게를 사용합니다. 6cm 접시에 KGM의 4 ML을 추가합니다.
  8. 진피 (그림 3D)를 포함하는의 Organotypic 카세트에 0.5-1000000 유 전적으로 변형 된 각질 세포를 놓습니다.
    1. 5 분 동안 10cm 플레이트에 0.05 % 트립신 4㎖를 배치하고 완전 DMEM 배지 4 ㎖로 급냉하여 각화 세포를 Trypsinize.
    2. 혈구를 사용하여 각질 세포를 계산 한 다음 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 재현 탁 0.5-1000000 세포는 90 μ로 (사용 가능한 셀의 수)에 따라그리고 KGM의 L은 진피에있는 모든 세포를 놓습니다.
      주 : 재생 된 표피의 두께에 차이가 보이는 세포 수를 시작하는 차이에 의해되지 않도록 동일한 실험 진피 내에서 동일한 수의 셀을 배치하는 것이 중요하다. 진피에 미만 50 만 셀을 배치하면 가난한 계층화와 차별화 될 수 있습니다.
  9. 매일의 Organotypic 문화에 KGM 미디어를 변경합니다. 수확 조직 진피에 각질 세포의 배치 후 1-14일. 표피의 전체 계층화 및 분화는 일반적으로 5 일 후에 발생합니다.

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결과

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인간 피부의 Organotypic를 생성하는 첫 번째 단계는 표피 진피를 제거하는 것이다. 37 ° C에서 4X 펜 / 연쇄상 / PBS에서 피부의 2 주 인큐베이션 표피 (도 1a)에서 진피의 분리를 허용한다. 표피와 진피를 분리하는 것이 어려운 경우 다른 주 동안 4 배 펜 / 연쇄상 구균에 37 ° C / PBS에서 조직을 배치하고 다시 벗겨 집게를 사용해보십시오.

약화 된 진피에 인간의 표피를 재생의 열쇠 중 하나는 각질 세포가 진피의 올바른 측면에 배치되어 있는지 확인하는 것입니다. 진피는 상단과 하단이 있습니다. 진피의 정상은 생체 내에서 각질 세포와 접촉뿐만 아니라의 Organotypic 문화에서 제공되는 측면이다. 진피의 상부 인해 저면 (도 1b)의 광택도에 진피의 바닥으로부터 구별 될 수있다. 각질 세포가 바닥에 직접 배치하는 경우진피의 (광택) 측, 표피는 차별화 또는 제대로 계층...

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토론

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의 Organotypic 문화가 많은 장점을 제공하는 사람의 피부에서 유전자 조작은 일반적으로 2D를 배양 된 세포뿐만 아니라 마우스 모델을 공부합니다. 2D 배양 본래 조직 및 기관에서 발견 삼차원 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하다. 최근의 연구는 16 차 종양이 사람의 피부에 많은 유전자 발현 유사성을 보여주는 3 차원 배양 된 세포와 함께 배양 된 2D 및 3D 피부암 세포 사이의 상당한 차이를 발견 하였다. 인간의 Organotypic 피부의 문화는 마우스 모델에 비해 여러 가지 장점이있다. 마우스 모델은 시간 소모적이고, 인간 및 마우스의 피부 사이에 주목할만한 차이를 생성 할뿐만 아니라, 고가이다. 이들은 다른 조직의 이직률뿐만 아니라 쥐와 인간의 표피 (8) 사이의 표피의 두께를 포함한다. 이러한 CRISPR-CAS으로 부상하고 새로운 기술은 특정 유전자가 변형 될 수와 /의 Organotypic 스킨이 배양을 이용하여 인간의 피부 질환을 모델로...

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공개 사항

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우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 미국 암 학회 (American Cancer Society) 연구 학자 그랜트 (RSG-12-148-01-DDC) 및 CIRM 기본 생물학 상 (RB4-05779) supportedby했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 피부뉴욕 소방관 스킨 뱅크http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
양쪽 친화성 피닉스 세포주ATCCCRL-3213
FUGENE 6 형질 주입 시약PromegaE2691
각질 세포 매체 (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
아데닌시그마A-9795
콜레라 독소시그마  C-8052
하이드로코르티손Calbiochem3896
인슐린시그마I-1882
EGF인비트로젠13247-051
트랜스페린 시그마T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride혈청 제약89-001-1
소작기Bovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 항체BiolegendPRB-149P
사각 못예술 공예품 상점
인간 신생아 각질 세포ATCCPCS-200-010
인간 신생아 각질 세포응용102K-05n
MSCV 레트로바이러스 벡터클론텍634401
LZRS 레트로바이러스 벡터Addgene
pSuper.Retro.Puro 레트로바이러스 벡터OligoengineVEC-PRT-0002 
헥사디메트린 브로마이드 시그마H9268-5G

참고문헌

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