우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.
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이 논문에서
요약
초록
아데노바이러스(Ad)에 의한 인간 세포의 감염 동안, 숙주 세포핵은 극적으로 재조직되어 바이러스 게놈이 차지하는 부위에 바이러스 및 세포 단백질의 동원을 통해 핵 미세환경을 형성합니다. 복제 구획(replication compartment, RC)이라고 하는 이러한 부위는 바이러스 게놈이 국소화되고 복제, 전사 및 전사 후 처리에 참여하는 바이러스 및 세포 단백질이 모집되는 바이러스 유도 핵 도메인으로 간주될 수 있습니다. 또한, 종양 억제 단백질, DNA 손상 반응(DDR) 구성 요소 및 선천성 면역 반응 인자와 같은 항바이러스 반응에 관여하는 세포 단백질도 RC에 선택됩니다. RC가 효율적이고 생산적인 복제 주기를 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만 구성 및 관련 활동에 대한 자세한 분석은 이루어지지 않았습니다. 아데노바이러스 RC 및 세포핵에서 복제되는 다른 DNA 바이러스의 잠재적 연구에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 속도 구배를 기반으로 하는 간단한 절차를 조정하여 Ad RC를 분리하고 이러한 바이러스 유도 핵 구조에 대한 형태학적, 기능적 및 구성 연구를 수행하고 숙주-세포 상호 작용에 미치는 영향을 연구할 수 있는 무세포 시스템을 구축했습니다.
서론
아데노 바이러스는 감염된 세포의 핵에서 복제하는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함합니다. 바이러스의 DNA는 핵 진입하면 PML 핵 몸체 (1)에 인접하여 국소화. 바이러스 초기 유전자 발현 다음, 핵 구조는 과장 되나, 바이러스 성 미세 환경의 형성을 유도하는, 재구성 바이러스 복제 격실 (RC) 2. 아데노 바이러스 (AD) RC는 바이러스 게놈의 복제 및 바이러스 유전자의 발현 늦은이 일어나는 부위이기 때문에, 이들은 이러한 프로세스에 참여하는 모든 필요한 바이러스 및 세포 인자의 채용을위한 환경을 제공한다. 흥미롭게도, 이러한 DNA 손상 반응으로서 세포의 항 바이러스 반응을 담당 세포 단백질의 다양성은 선천성 면역 반응 및 종양 억제는 공동하기로 이들 바이러스 2 위치한다. 병용을 조절하면서 효율적인 바이러스 복제를 촉진 따라서, 광고 RC가 고려 될 수 규제 허브이러한 구조는 바이러스 숙주 세포 상호 작용의 이해에 중요한 것을 나타내는 응답 세포 바이러스. 그럼에도 불구하고, RC 형성의 분자 메커니즘은 그들의 조성과 연관된 활동을 제대로 이해된다.
핵에서 복제 다른 DNA 바이러스에서 아데노 바이러스 RC뿐만 아니라 RC는 세포질 RC 3 대조적으로, ....
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프로토콜
1. HFF 세포 배양 및 광고 감염
- 앞서 설명 된 바와 같이 8 HFF 세포에 형광 형성 유닛 (FFU)로서 HEK-293 세포의 단층에서 역가의 Ad5 WT 바이러스를 전파.
- 가습 인큐베이터에서 DMEM / 10 % 태아 소 37 ºC에서 멸균 문화 100mm 요리 혈청 (FBS) 5 % CO 2 10ml에 인간의 포피 섬유 아세포 (HFF)을 성장. 네 16 평방 세트에서 세포를 계산하여 노이 바 우어 챔버를 이용하여 세포 수를 결정합니다. 용액 당 세포 수는 4-16 개의 정사각형 세트 세포 수의 평균을 산출하고 (10) (4)에 의해이 값을 곱함으로써 얻어진다. 스텝 130에 포함 된 각 시간 후 감염, 1 × 10 7 HFF 셀을 사용한다.
- 모의 감염시킬가 형성 부 (30) 포커스의 방어에 접시 당 DMEM에서의 Ad5 1 ㎖를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에서 아데노 바이러스 5 형 (의 Ad5) 야생형 (WT) (H5pg4100 8)로 HFF 세포를 감염, 또는 FFU 또는 셀 당. 아에 2 시간 동안 품어신중 요리마다 15 분간 흔들 umidified 37 ºC에서 세포 배양 인큐베이터 및 5 % CO 2,<....
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결과
바이러스 복제 용 구획 (RC)는 단백질과 다른 핵 도메인 유사한 핵산 이루어지는 subnuclear 바이러스 - 유도 된 구조이기 때문에, 그들은 생화학 적 특징에 기초하여 속도 구배에 의해 분리 의무가 것을 알았다. 분별 프로토콜의 중요한 단계는 샘플이 다른 서브 세포 분획의 무결성을 보장하기 위해 명 시야 현미경으로 관찰 할 필요가 각 단계에서,도 1에 도시되어있다. 세포를 팽창 할 때 예를 들어, 저장성 완충액 배양 시간은 핵의 손상을 방지 세포질을 팽창하기 위해 표준화 될 필요가있다. 소포체 막 포함 세포질 구성 요소를 무료로 휴대 균질화 그대로 핵, 후, 획득해야합니다. 또한, 초음파 처리 시간은 RC 중단없이 모든 세포의 핵막을 파열시키기 위해 표준화 될 필요가있다.
하위 핵 분획을 얻은 후, 키컨트롤은 RCF에서 협회와 선의의 RC 마커의 농축을 결정하기 위해 포함 할 필요가있다. 아데노 바이러스는 통상적으로 RC .......
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토론
바이러스 감염에 의한 세포 활동의 조절을 지배하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해서는 RC와 관련된 구성 및 활동을 이해하는 것이 도움이 될 것입니다. 따라서 RC에 대한 자세한 분석을 위해 우리는 이러한 바이러스 유도 구조의 크기와 생화학적 조성을 이용하는 무세포 시스템을 구축하여 자당 쿠션을 사용한 속도 구배에 의존하는 간단한 절차를 사용하여 RC가 풍부한 핵 이하 분획을 분리했습니다. 사용된 세포 유형에 따라 표준화가 필요한 절차의 중요한 단계는 다음과 같습니다: i) 핵의 파괴를 피하기 위해 세포 팽종에 사용되는 시간의 표준화; ii) 분획이 적절하게 분리될 수 있도록 자당 구배의 형성; iii) 명시야 현미경에 의한 절차 전반에 걸쳐 샘플의 지속적인 모니터링; iv) 모든 핵이 용해되지만 RC가 중단되지 않도록 초음파 처리 시간 및 강도; v) 모든 분획 단계는 핵 구조의 파괴를 피하기 위해 얼음 위에서 수행되어야 합니다.
접할 수 있거나 예상할 수 있는 기술의 한계는 다.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 CONACyT-SEP의 보조금으로 지원되었습니다(SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) 및 R.A.G.의 경우 Promep-SEP; PH는 CONACyT (447442)에서 장학금을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 12100-046 | 37 º에서 따뜻한; C 사용 전 수조 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | 2.55M 재고 용액을 준비하고 4 º에 보관하십시오. C |
| Dounce 균질화기 | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 초음파 욕조 | Branson | Z769533 SIGMA | 사용 15분 전에 전원을 켜십시오. |
| Goat anti-Mouse IgG1 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | 에서 1:2,000 희석으로 사용 |
| Sigma | S4651-72EA | 층류 캐비닛에서 열기 | |
| SuperSignal West Pico 화학발광 기판 | Pierce ThermoScientific | 34080 |
참고문헌
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-142....
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재인쇄 및 허가
