본 연구에서는 관심 있는 전사 인자를 표적으로 하는 작은 헤어핀(sh)RNA로 세포를 transfection한 후 공개적으로 사용 가능한 데이터, 계산 리소스 및 microRNA 어레이의 높은 처리량 데이터를 사용하여 microRNA 전사체에 대한 전사 인자의 영향을 연구하는 전략을 제안합니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 코딩 유전자의 전사 조절이 광범위하게 연구 동안, 약간은 특히 마이크로 RNA 전사 인자가 비 코딩의 RNA 전사에 관여하는 방법에 공지되어있다. 여기서, 우리는 공개적으로 이용 가능한 데이터, 연산 리소스 및 높은 처리량 데이터를 이용하여 마이크로 RNA의 전사를 조절하는 전사 인자의 잠재적 인 역할을 연구하기위한 전략을 제안한다. 우리는 전사 인자 결합 부위에 충실 마이크로 RNA 프로모터를 식별 할 ENCODE 프로젝트에서 -sequencing 데이터를 마이크로 RNA 발기인 및 염색질 면역 침전 (칩)을 식별 할 H3K4me3 후생 유전 학적 서명을 사용합니다. shRNA를 관심 전사 인자 타겟팅 및 마이크로 RNA 배열 셀을 실시하여 원하는 세포를 형질 감염함으로써, 우리는 마이크로 RNA 전 사체에서이 전사 인자의 효과를 연구한다. 예시 예를 들어 우리는 만성 만민의 마이크로 RNA 전 사체에 STAT3의 효과에 대한 연구를 사용mphocytic 백혈병 (CLL) 세포.
서론
마이크로 RNA는 일반적으로 전사 후 수준에서 mRNA 발현의 부정적인 레귤레이터 기능 내생 작은 비 코딩 규제 RNA를합니다. 약 1,000 비 코딩 긴 마이크로 RNA가 인간 게놈 1,2에서 발견되는 20 뉴클레오티드 25. 마이크로 RNA는 통상 3 '비 번역 영역 대상의 mRNA (UTR)에있는 마이크로 RNA와 상보 시드 일치 서열의 시드 서열 간의 정규 염기쌍을 통해 유전자 발현을 조절한다. 종합적으로, 마이크로 RNA는 단백질 코딩 유전자 (3)의 30 % 이상을 조절하지만, 단지 작은 마이크로 RNA는 DNA로부터의 전사에 대해 공지되어있다. 이는 마이크로 RNA 전사의 조절이 mRNA의 4,5- 유사한 것으로 제안되었다. 특히, 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 촉진하는 활성과 유사하게, 전사 인자는 마이크로 RNA (6)의 전사를 활성화하는 것으로 생각된다. 전사 인자-microRNA의 작용 유전자 발현 (7)의 변조 요소로보고되었으며 수도 또한 피드백 및 피드 포워드 루프를 형성한다. 예를 들어, Yamakuchi 등 알.이 p53과 p53의 차례로 리프레 SIRT 환산하여 p53의 활성을 증가 8 억제 microRNA34a의 발현을 유도하는 피드백 루프를보고 하였다.
마이크로 RNA의 전사 인자 의존성 발현의 구체적인 예는보고 된 반면, 관심의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하는 방법에 관한 정보를 제공하는 방법으로 인정이 부족하다. 본 명세서에 제안 된 프로토콜의 목적은 마이크로 RNA-사체의 전사 인자 의존성 규제에 대해 자세히 설명한다. 공개적으로 이용 가능한 데이터, 생물 정보학 도구 결합 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여이 알고리즘을 수행 연구자 게놈 규모에 캡처 할 수있는 얼마나관심 셀 타입의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하고 마이크로 RNA 발현을 조절하는 전사 인자의 mRNA의 기여도를 추정 탐색.
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프로토콜
1. 데이터 마이닝 접근법을 사용하여 마이크로 RNA 유전자의 프로모터에서 전사 인자 바인딩 사이트를 확인
- DNA 요소 (ENCODE) 프로젝트의 백과 사전의 일부로서 생성 된 크로 마틴 면역 침강 (칩) 시퀀싱 데이터를 추출하기 위해 캘리포니아 대학 산타 크루즈 (UCSC) 게놈 브라우저를 사용합니다.
- UCSC 게놈 브라우저에서 테이블 브라우저를 엽니 다.
- 테이블을 추출하기 위해 다음과 같은 사양을 사용하여 계통 군 (포유류), 게놈 (인간), 조립 (Feb2009 (GRch37 / hg18)), 그룹 (규제), 트랙 (TxnFactorChIP을), 테이블 (weEncoderesTFbsCo7steredv3), 지역 (게놈), 출력 형식 (선택 테이블에서 모든 유전자).
- .txt 파일로 스프레드 시트에 1.1.2의 출력을 저장합니다.
- 관심있는 전사 인자 (예를 들어, STAT2)에 대한 정렬 및 필터.
- Baeer 등에서 사용할 수 H3K4me3의 후성 유전학 서명을 기반으로 마이크로 RNA 프로모터의 목록을 사용합니다. (9) . .txt 파일에이 목록을 복사합니다.
- 인간 게놈의 좌표에 따른 일치 (예를 들어, STAT3은 추정 마이크로 RNA 프로모터에 결합) 1.1 및 1.2에서 데이터를 매핑 파일 1 코딩 기업에서 설명한 바와 같이 날카로운 C에 기록 된 코드를 이용하여 평균 결합 친화도를 결정한다.
2. 사용의 shRNA 관심의 전사 인자의 발현을 다운 조절
- 플레이트에서 약 50 % 합류 (DMEM, 10 % FBS)와 10cm 플레이트에서 293 인간 배아 신장 세포주에서 1.5 × 106 세포.
- shRNA를 함유 녹색 형광 단백질 (GFP) 렌티 바이러스 5 μg의 293 인간 배아 신장 세포주에서 형질 세포는 관심의 전사 인자에 관한 포장 벡터 5㎍을가 제조사의 프로토콜에 따라 부착 된 세포 형질 감염 시약을 이용하여 함께.
- 대조군으로서, 293 인간 배아 신장 세포주에서 세포를 형질shRNA를 제조사의 프로토콜에 따라 패키징 벡터를 스크램블링.
- (37 ° C, CO 2 배양기에서) 16 시간 동안 세포에 형질 전환 믹스를 유지 한 후 10 % FBS와 신선한 10 % DMEM 미디어 10 ml의 미디어를 변경합니다.
- 48 시간 포스트 형질을 기다립니다 세포 배양 (300 XG, 5 분) 원심 분리 및 감염 상층 액을 수집합니다. 부동 세포를 제거하기 위해 0.45 μm의 주사기 필터 (25 mm 계면 활성제 무료 셀룰로오스 아세테이트 막)을 통해 뜨는을 필터링합니다.
- 상등액을 농축시키고 100 kDa의의 임계 값과 함께 ultracentrifugal 필터 장치를 사용하는 렌티 바이러스를 수집한다. (30) 950 XG에 스핀 - 볼륨까지 60 분 미만 250 μL에 집중하고있다. -80 ° C에서 집중 바이러스를 저장합니다.
- 렌티 바이러스와 함께 세포를 형질 감염. -80 ° C의 냉동고에서 냉동 렌티 바이러스를 제거하고 실온에 해동. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 바이러스 뜨는 100 μl를 전송합니다.
- 브린g까지 감소 된 혈청 배지 1 ㎖의에 튜브에 볼륨. 10 ng를 / ㎖의 최종 농도 1 ml의 바이러스 현탁액에 hexadimethrine 브로마이드를 추가 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 5 분 동안 서 보자.
- 원심 5 × 106 세포에 대한 각각의 전달 부드럽게 바이러스를 함유 배지에 0.5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 다음, 10 % FBS의 최종 농도로 20 % FBS 배지로 0.5를 가하여 24 시간 - 셀 4 동안 인큐베이터에 머물게.
- 48 ~ 72 시간을 기다린 요오드화 프로피 듐 (PI) 및 제조업체의 지침에 따라 녹색 형광 단백질 (GFP)와 세포를 얼룩. 빛으로부터 세포를 보호하고 GFP + / PI의 속도 측정하기 위해 FACS 분류기를 사용 - 세포. PI 얼룩 만 사균 때문에,이 비율은 살아있는 세포에서 형질 감염 효율의 추정치이다.
- 이전 10 설명 된대로 FACS 분류기에 의한 GFP 발현 (GFP의 +)에 대한 긍정적 인 세포 인구를 정렬합니다.
- 사용 WesteRN 면역 블롯은 이미 전에 shRNA를 지정하여 (예를 들어, CLL 세포) 관심의 세포를 감염 후 관심있는 전사 인자의 수준을 결정하기 위해 열을 설명했다.
3. 전사 인자-shRNA를 형질 세포에서 마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 발현 수준을 결정
- RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용하여 분리.
- RNA의 레이블 및 마이크로 RNA 마이크로 어레이 (11)에 혼성화.
- 전사 인자의 shRNA 또는 빈 벡터 제어 5 형질 감염된 세포에서 차별적으로 발현 마이크로 RNA를 결정합니다.
- PCR 5 실시간하여 가장 차별적으로 발현 마이크로 RNA에 대한 마이크로 어레이 결과를 검증.
4. 전사 인자 종속 사체 (Transcriptome)를 설명하기에 생물 정보학 및 shRNA를 접근 사이의 중복 결정
- DET하려면, 형질 전환 된 세포를 자신의 프로모터에 결합 부위 전사 인자 항구 및 전사 인자의 shRNA에서 하향 조절 된 마이크로 RNA 유전자의 예상 및 관찰 비율을 족제비 다음을 수행하십시오
- 1.3에서 생성 된 목록에서 자신의 프로모터 / 총 마이크로 RNA에 대한 관심의 전사 인자 항구 유전자의 비율을 얻습니다. 이 목록은 (예를 들어, STAT3 결합 부위 / 총 마이크로 RNA 유전자와 마이크로 RNA 유전자 = 0.25 시험) 예상 비율이다.
- 3.3 생성 목록에서 전사 인자 shRNA를 형질 감염된 세포에서 하향 조절 1.3 생성 목록에서 관심 결합 부위의 전사 인자를 가지고 있었다 유전자의 수를 결정한다. 하향 조절 유전자의이 수 / 총 수는 관찰 된 비율 (예를 들어, 하향 조절 마이크로 RNA의 STAT3 사이트를 결합 / 총 수 = 0.6과 마이크로 RNA 유전자).
- 상기 생성 된 관찰 예상 비율을 비교하고 전사 인자 shRNA를 형질 세포에서 하향 조절 된 유전자의 목록을 자신의 발기인에 전사 인자 결합 부위에 농축되어 있는지 여부를 확인하기 위해 통계를 χ2 사용합니다.
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결과
STAT3은 전형적 항 세포 사멸 및 증식 효과가 12 유전자의 전사를 유도하는 전사 인자이다. STAT3 여부는 비 코딩 된 RNA 전 사체는 현재 알려지지 않은 영향을 미친다. 모든 CLL 세포에서 STAT3는 세린 (707) 잔류 10,13에 구성 적 인산화이다. 핵에 포스 포세린 STAT3 셔틀은 DNA에 결합하고, 다른 세포 유형 10 티로신 pSTAT3 의해 활성화 될 것으로 알려진 유전자를 활성화합니다. CLL은 마이크로 RNA 네트워크 (14)의 전역 완화 특징으로하기 때문에, 우리는 세린 pSTAT3의 존재 CLL 세포에서 마이크로 RNA의 발현에 영향을 미치는 것으로 가정 하였다.
이 STAT3 바인딩 사이트를 식별 할 수 있었다 항구 마이크로 RNA의 프로모터를 ...
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토론
단백질 코딩 유전자의 RNA 폴리머 라제 전사에 의존 II- 근본적인 메커니즘은 광범위하게 연구되어왔다. 이들 원소는 1 %를 구성하지만 - 인간 게놈의 2 %, 인 코드 프로젝트 증거가 인간 게놈의 80 % 이상이 전사 17 겪을 수 있고, 어떻게 비 - 코딩 DNA 요소의 전사를 조절하는 것을 제안은 거의 알려지지 않았다 6 .
폴 II는 또한 마이크로 RNA (6) 등 일부 비 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 책임이 있음을 나타내는 여러 연구는 잠재력을 해독하기 위해 공개적으로 이용 가능한 자원, 계산 알고리즘에서와 시험관 연구에서 데이터를 결합 전략을 개발하기 위해 우리를 안내 마이크로 RNA의 전사를 조절에 대한 관심이 전사 인자의 기능. 여기에서 제안 된 전략이 중요한 단계를 포함한다. 먼저 우리는 전사 인자 (B)을 식별하기 위해 공개적으로 이용 가능한 데이터를 사용하여마이크로 RNA 프...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
본 연구는 CLL 글로벌 연구 재단에서 기금에 의해 지원되었다. 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학은 암 센터 지원 그랜트 (P30CA16672)을 통해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 &마이크로; m 주사기 필터 | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon 초원심 필터 장치, 임계값 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol 시약 | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 세포주 인간 | Sigma-Aldrich | 85120602 |
참고문헌
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