시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

요약

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[^Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

초록

포스파티딜에탄올아민 메틸트랜스퍼라제는 S-아데노실-L-메티오닌에서 포스파티딜에탄올아민, 모노메틸-포스파티딜에탄올아민 또는 디메틸-포스파티딜에탄올아민으로 하나 이상의 메틸기를 전달하여 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 제공하는 생합성 효소입니다. 이러한 효소는 동물 세포, 곰팡이에서 흔히 볼 수 있으며 박테리아의 약 10%에서도 발견됩니다. 이들은 인슐린 저항성, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 세포 성장 또는 독성과 같은 지질 대사에서 직접적인 역할을 하는 것 외에도 세포 생리학에서 다양한 중요한 기능을 수행합니다. 본 원고는 전체 세포 추출물을 효소 공급원으로 사용하여 S-[^Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 phosphatidylethanolamine으로의 삼중화 메틸기의 전달을 측정하는 간단한 cell-free 효소 분석에 대해 보고합니다. 생성된 포스파티딜에탄올아민의 메틸화 형태는 소수성이므로 유기 추출에 의해 수용성 S-[메틸-³H]아데노실-L-메티오닌으로부터 분리될 수 있습니다. 이 분석은 잠재적으로 다른 세포 유형에 적용할 수 있으며 효소를 정제할 필요 없이 관심 있는 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소에 특이적인 억제제/약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

포스파티딜 에탄올 아민의 메틸화 된은 (PEMT) 효소 모노-PE, 디메틸 PE 및 / 또는 제공하기 위해 PE, 모노 - PE 또는 디메틸 PE 상 메틸기 공여체로서 S의 -adenosylmethionine (SAM)을 사용하여 하나 이상의 메틸 그룹의 공유 결합을 촉진 포스파티딜콜린 (PC). 이 효소는 동물 세포와 곰팡이에 거의 어디에나 있습니다. 이들은 또한 몇몇 식물 ¹ 세균의 약 10 %, 진핵 ^2와 상호 작용하는, 특히에서 찾을 수있다.

PEMTs이뿐만 아니라, 다른 중요한 세포 기능을 다함으로써 동물 세포에서 주요 지질 클래스 PC의 생산에 기여함으로써 세포 생물학에 적합하다. 포유류에서 PEMTs 주로 그들은 매우 저밀도 지질 단백질의 정상적인 분비에 필요한 간에서 발현되며, 또한식이 유도 비만 ^(3), 동맥 경화증 ^(4)에 기여하고, 인슐린 저항ANCE ^5. 또한, 포유류 PEMT은 비록 낮은 수준으로, 지방 세포에서 발현, 지방 침착 ^{(6, 7)에} 참여하고 있습니다. 암 발생 ^{8, 9} 사멸 및 세포 증식 ¹⁰ ....

프로토콜

1. 세포 추출물 준비

1. 20 mM의 HEPES pH 7.4로, 100 U는 / ㎖ 페니실린, / ㎖ 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 헴 (heme) 100 μg의 보충 1X M199 만든 배지에서 26 ºC에서 기밀 캡으로 밀봉 멸균 플라스틱 병에 슈만 편모충 세포를 성장 흔들림없이, 0.35 G / L 나코 ₂ H, 0.1 mM의 아데닌, 2 μg의 / ㎖ biopterin. 그들은 1-2 X ¹⁰⁷ / ml의 세포 밀도에 도달했을 때 4 ºC에서 5 분간 1,500g에서 원심 분리하여 세포를 수확.
2. 피펫으로 뜨는을 취소하고 차가운 인산염 완충 식염수의 문화의 볼륨 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl의 절반에 혈청 학적 피펫으로 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포를 씻어, 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.8 mM의 KH ₂ PO _4, pH 7.4로). BL2 안전 지침에 따라 세포의 상층 액을 폐기하십시오.
3. 원심 분리기 세포를 다시 4 ºC에서 5 분 1,500g에서. 피펫으로 상층 액을 버린다. T를 진행또는 다음 공정 o를하면 -80 ºC (최대 세 개월)에 장기 저장을 위해 액....

결과

도 1은 기판으로서 PE를 사용하여 내인성 효소 원으로서 Leishmania의 전체 세포 추출물로 행하여, 시간 종속 PEMT 분석을 보여준다. 유기 상 중의 방사능의 양을 섬광 계수에 의해 정량화 하였다. 얻어진 번호는 PE 삼중 전사 메틸기의 양을 계산하는데 이용되었다. PEMT 활성은 약 20 분 동안 선형이었다. 그런 다음, 또 다른 15 분 동안 일정한 머문 후 약 30 분에서 정체기에 도달했다. 예상대로 더 셀 추출물 분석 (그림 2)에 추가되지 때, PEMT 활동은 검출되지 않았다. 또한,이 활성의 억제제 L. 100 μM의 옥타 데실 브로마이드의 존재하에 폐지 주요 체육 methyltransferases LMJ PEM1 및 LMJ PEM2 ^(14). PEMT 활성은 .......

토론

이 단순한 빠른 PEMT 분석은 단백질 원으로 전체 세포 추출액을 이용하여 PE 상 SAM에서 방사성 메틸기의 전달로 인한 PE의 메틸화 된 형태의 정량을 허용한다. 그것은 빠르고, 민감한, 재현성, 정제 효소 ^17도 적합하다. 관심 메틸화 된 오히려 PE ^{12,13,18,19보다} 이들 기판에 특정한 경우 Monomethyl- 또는 디메틸 PE는 상기 분석에 첨가 될 수있다. 정제 PEMT 효소가 사용되는 경우, PE는 분석에 첨가 될 수있다. 이 프로토콜의 한계는 분석이 반응 제품 (모노-PE, 디메틸 PE 또는 PC)를 식별하지 않습니다. ^{20, 21에서} 설명하지만, 반응 생성물 (모노-PE, 디메틸 PE, PC)의 아이덴티티는 또한 하나의 차원 박층 크로마토 그래피에 의해 분석 될 수있다. 또한, 이러한 S의 -adenosylhomocysteine ​​및 5'- methylthioadenosine로서 SAM 분해 산물의 일부는 PEMT 활동.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
S-[메틸-3H]아데노실-L-메티오닌(5-15 Ci/mMole의 특정 활성)	Perkin Elmer	NET155050UC	시약을 분취하고 -20°C에서 동결합니다. C; 이 시약을 사용하는 동안 방사선 안전 지침을 따르십시오
프로테아제 억제제 칵테일	Roche Life Sciences	11836170001	그것을 신선하게 희석하십시오
유리 구슬, 산성 세척, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic 산 용액	Sigma Aldrich	B9643
구리 (II) 황산염	Sigma Aldrich	C2284
섬광 카운터 MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
분광광도계 Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA 재고 용액 (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
신틸레이션 액체	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	은 시약을 20mM HCl로 희석하고 -80°C에서 부분 표본을 동결합니다. 씨

.