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방법 논문

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53313

⸱

2015년 12월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

이 논문에서

요약

저자는 인플루엔자 A 바이러스를 탐지하고 격리하기 위해 돼지 비강 물티슈를 수집하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

인플루엔자 바이러스가 빠르게 돼지 인구의 진화와 새로운 변종이 지속적으로 등장하고 있기 때문에 돼지에서 인플루엔자 A 바이러스에 대한 감시는 인간과 동물의 건강에 중요하다. 돼지는 그들에게 출현과 새로운 인플루엔자의 유지 보수 바이러스 균주에 대한 중요한 호스트를 만드는 인플루엔자 A 바이러스의 다양한 계통에 감염 될 수 있습니다. 상업 돼지 농장, 농업 박람회, 라이브 동물 시장 등 다양한 설정에서 돼지를 샘플링 현재 IAV 균주 순환의 포괄적 인 뷰를 제공하는 것이 중요하다. 이 돼지의 물리적 구속을 필요로하기 때문에 현재의 금 표준 도축 샘플링 기술 (비강 면봉 즉 컬렉션) 노동 집약적이다. 코 와이프 ​​동물없이 구속을 최소한으로 돼지의 주둥이에 걸쳐 직물의 조각을 문질러 포함한다. 코는 절차를 수행 할 간단하고 전문 수의사 또는 동물 취급 교육 인력을 필요로하지 않습니다 닦습니다. W비강 면봉보다 약간 덜 민감 hile은 바이러스 탐지 및 차단 속도는 코가 낮은 스트레스 샘플링 방법이 필요한 경우 개별 돼지를 샘플링하기위한 실행 가능한 대안을 쳐하게하기에 충분하다. 진행 프로토콜 가능한 코를 수집하기 위해 필요한 단계가 개인 돼지 닦아 윤곽선.

서론

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 국내 조류, 돼지, 인간을 포함하여 많은 종의 호흡기 질환을 유발한다. 인해 발생할 수있는 분할 IAV 게놈 빠른 바이러스 진화의 reassortment에 새로운 IAV 균주에 자주 등장. 돼지는 일반적으로 북미 신종 (H1N1, H1N2, H3N2) 사이에서 순환 IAV의 세 가지 주요 서브 타입은있다. (1) 여러 호스트 종 IAVs의 유전자 재 배열을위한 혼합 용기 역할을 할 수 종 있지만, 인간의 여러 IAV 소개는이 그 하위 유형 내에서 광범위한 IAV 다양성되었다. 돼지를 감염 IAVs의 2 급속한 진화는 인간, 조류 및 돼지 바이러스로부터 유전자 세그먼트를 포함하는 트리플 된 재조합 IAV 3는 미국에서 돼지들 사이에서 확산 된 1998 년부터 분명했다. 4 내부 유전자 그 트리플 재조합 체의 IAV에서 세그먼트는 현재 돼지를 감염 IAVs 가운데 매우 널리 남아있다. (5)

"> 전세계, IAV는 전형적인 임상 증상은 발열, 식욕 부진, 무기력, 기침을 포함하는 돼지의 호흡기 질환의 중요한 원인은, 콧물과 가난한 체중 증가 재채기, 호흡 고심한 흔적. IAV 어디 생식 농장을 뿌리는 것이 특히 비용이 많이 드는 될 수 있습니다 때문에 IAV 유도 발열과 약한 태어난 새끼 돼지에 오류가 기록되어있다. 6, 7을 미국 내에서 IAV는 일반적으로 상업 돼지 떼와 IAV 감염 돼지들 사이의 광범위한 항원 및 유전자 다양성과 계속 진화 검출이의 제어를 방해하고있다 바이러스. 8-11

트리플 된 재조합 북미 돼지의 혈통과 유라시아 조류 같은 돼지 혈통에서 유전자 세그먼트를 포함하는 돼지 혈통 IAV는 전 세계적으로 대유행 발생 때 2009 년에 실현 된 돼지의 유전자 재 배열로 인한 전염병 IAV 균주의 출현에 대한 공공 건강 문제 인간. 12 유행성 바이러스 (A (H1N1) pdm09)는 이후이발병 돼지와 재조합 된 IAV는 13, 14 균주 및이 새롭게 재조합 된 균주 중 일부는 인간에게 다시 전송하고있다. (15) 유전자 재 배열 이벤트 및 대유행 가능성이있는 새로운 IAV 균주의 출현 돼지 필수적으로 IAV 바이러스 순환의 적극적인 감시를 만드는의 주파수를, 특히 돼지 - 인간 인터페이스에서.

돼지 - 인간 인터페이스 IAV 양방향 종간 송신을 위해 중요하다. 인간 간 돼지 상업용 돼지의 생산에서 발생하는 송신 돼지 인구에 현재 존재 IAV 다이버 다량 담당한다. 농업 박람회는 미국에있는 사람과 돼지의 comingling 가장 큰 설정하고 변종 H3N2 IAV의 발발시, IAV의 인수 공통 전송을위한 사이트. 2012 년 15-21 알려진, 경우의 93 %는 참석을보고 일 농업 박람회 질환 발병하기 전에. 15 게놈 분석인수 공통 전송을 확인 인간 균주에 비해 전시 돼지에서 바이러스 균주의. IAV 감염 (21) 전시 돼지 종종 직접 진단 테스트의 필요성을 나타내는 질병, 21-23의 임상 증상을 표시하지 않습니다.

눈에 띄게 아픈 돼지의 샘플링은 혼자 성공적으로 돼지에 IAV의 유병률을 파악하지 않으며 돼지들 사이에서 신흥 IAV의 새로운 변종을 식별하는 데에 의존 할 수 없습니다. 활동 감시 IAV의 새로운 변종 돼지 및 돼지 및 공중 보건 모두 그들의 위협을 평가하기의 검출을위한 절대적으로 필요하다. 대부분의 IAV 감시 활동은 자발적 때문에 최소한의 파괴적인 방법이 필요하다. IAV가 돼지를 감염에 대한 세 가지 주요 도축 샘플 수집 절차는 다음과 같습니다 비강 면봉, 구강 유체 및 코 와이프. IAV 목록을 합성 섬유의 삽입을 감지하는 개별 돼지를 샘플링 현재 권장되는 방법으로 콧 구멍에 면봉을 밀고비강 분비물과 상피 세포를 수집 할 수 있습니다. (24, 25)를 돼지가 수동으로 또는 올무는 동물의 크기에 따라와 돼지를 억제해야이 절차, 훈련받은 사람의 팀을 피하려고 할 수 있기 때문에. (26)를 구속 과정에 대한 힘드는입니다 직원 및 돼지에 대한 스트레스. 경쟁 동물에 추가 스트레스의 인식이 감시 활동에 소유자가 저항 할 수 있도록 또한, 전시 돼지는 종종 박람회에서 여러 대회에 참여하고 있습니다.

80-100% IAV에 감염된 가축에 이르기까지 IAV 검출의 확률로, 구강 유체는 돼지의 인구 IAV의 분자 검출을위한 면봉을 비강에 인기있는 대안이되고있다. 27, 28는 또한, 경구 용 유체의 넓은 창을 제공 할 수있다 초기 감염 다음과 같은 비강 면봉보다 IAV 감지. 그러나, IAV 경구 유체로부터 분리 바이러스 분리 시도의 50 % IA 결과로 문제가 있었다V 복구. (29)

돼지에 IAV 감시 동안 비강 면봉 대신에 코 와이프를 사용하면 상기의 한계를 극복한다. 비강 와이프는 구속 스네어의 사용을 필요로하지 않고, 과정의 동물 또는 증인을 강조하지 않고 수행 될 수있다. 최소한의 기술 교육은 감시 샘플을 수집, 돼지 소유자를 포함한 비 수의학 전문가, 수 비강 잎사귀를 수집하기 위해 필요합니다. 코 와이프는 이전에 바이러스 (30)와 샘플링이 비 침습적 방법에 대한 자세한 프로토콜은 아래에 설명되어 검출 및 인플루엔자의 분리를위한 비강 면봉에 비교 하였다.

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프로토콜

다음 데이터의 수집에 사용 된 모든 돼지는 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 보호 된 (동물 사용 프로토콜 번호 2009A0134-R1).

1. 바이러스 성 전송 매체의 준비 및 시료 채취 튜브

  1. 정제수 900 ml의 뇌 심장 주입 37 g을 넣고 가열 70 ° C가 완전히 분말을 용해하는 동안 교반 막대와 자석 교반기로 충분히 혼합한다.
  2. 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브 국물. 국물까지 벤치 위에 차가운 실내 온도에 도달한다. 4 ° C에서 냉장 하룻밤 필요한 경우.
  3. 자기 교반 막대, 페니실린 G 나트륨 염 6.02 g의 실온에서 순수한 물 50 ㎖에 황산 스트렙토 마이신 10 g과 혼합하여 용해. 100 ㎖에 총 볼륨을 가지고 추가 정제수를 추가합니다. 멸균 병에 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰 멤브레인을 통해 솔루션을 필터.
  4. 무균는 냉각 뇌 심장 주입 국물로 필터링 된 페니실린과 스트렙토 마이신 솔루션을 추가하고 바이러스 수송 배지를 만들기 위해 철저하게 (교반 막대 또는 손으로 소용돌이 플라스크)를 섞는다.
  5. 바이러스는 무균 전송 매질의 pH를 테스트; 필요한 경우, 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 7.4 ± 0.2로 pH를 조정합니다.
  6. 장과 하몬 기재된 바와 같이, RRT-PCR에 의해 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질을 시험함으로써 바이러스 전송 매체의 품질 보증 테스트를 수행한다. (22)
  7. 8 ml의 용량 멸균 고밀도 폴리에틸렌 병에 바이러스 수송 배지 5 ㎖를 분배. 현장에서 사용하기위한 튜브에 라벨.
  8. 샘플 수집 할 때까지 -20 ℃에서 표준 냉동 박스에서 바로 사용할 수있는 튜브를 저장합니다.

돼지의 코 닦음 2. 컬렉션

  1. 컬렉션 샘플 직전에 튜브의 해당 번호를 해동; 한 바이알 샘플링 돼지 당 필요합니다. 룸에서 해동온도는 약 30 ~ 45 분 소요됩니다. 해동 유리 병 사용까지 얼음 팩에 냉정을 유지.
  2. 돈 적절한 개인 보호 장비를 상황에 의해 결정 (등 예 : 작업복, 부트 커버, 마스크, 귀마개,)로.
  3. 동물의 영역을 입력합니다. 필요한 경우, 작은 영역으로 돼지를 한정하지 않지만 억제 더 않습니다. 동물을 쉬고 환기하지 마십시오.
  4. 일회용 시험 장갑 한 켤레를 착용 할 것. 터치 돼지, 사람, 또는 무생물에 의해 장갑이 오염되지 않도록주의 할 것.
  5. (2를.에서 × 2.) 5.08 cm × 멸균 5.08 CM을 제거하기 위해 장갑을 낀 손을 사용하여면 거즈 패드의 래퍼에서. 멸균 거즈 패드는 가능하면 사용되어야한다. 개별 포장 거즈 패드는 패키지 당 두 거즈 패드로 감싸 그보다 사용하기 더 편리합니다.
  6. 한 손의 손가락이 샘플링 가능한 패드의 많은 노출과면 거즈 패드를 잡으십시오.
  7. 복용, 돼지의 주둥이에 걸쳐 거즈 패드를 닦아가능하면 별도의 관리는 외부 콧 구멍을 입력합니다. 같은 거즈 패드로 볼 수 비강 분비물 (약 1 ml)에 수집합니다.
  8. 같은 손을 사용하여, 바이러스 전송 매체를 포함하는 바이알에 배치를 용이하게하도록 자체적으로 거즈 패드를 접어.
  9. 다른 손을 사용하여 바이알로부터 캡을 제거하고, 바이알 내로 접혀 거즈 패드를 배치했다. 바이알을 다시 정리해 보면하고 거즈 패드와 바이러스 수송 배지의 혼합을 보장하기 위해 유리 병을 흔들어.
  10. 해당 콘센트에 장갑과​​ 장소를 제거합니다. 각 돼지 사이에 장갑을 변경합니다.
  11. 유리 병 식별자를 확인합니다. 기록 돼지 식별 번호, 나이, 성별, 임상 증상 및 연구자 필요하다고 인정하는 다른 음.
  12. 즉시 수집 후 샘플을 진정. 여러 동결 - 해동 사이클을 방지하기 위해 동결 전에 샘플의 분취 량을 고려한다. 즉시 수집 후 가능한 한 실험실 교통을위한 드라이 아이스에 샘플을 배치합니다. 유리 병에 보관 -80테스트가 시작 될 때까지 C를 °.

3. 탐지 인플루엔자의 바이러스 핵산

  1. 5 분 동안 37 ° C 건조 비드 용기에 샘플을 해동 한 후 20 ~ 30 분 동안 실온에서 벤치 위에 샘플을 해동 완료. 구슬에 여러 병의 동시 첨가는 목욕 가열하게됩니다; 주의 튜브를 과열하지으로 행사되어야한다.
  2. RNA 추출을위한 바이러스 수송 배지 100 μl를 제거합니다.
    1. 많은 수의 샘플로부터 RNA를 추출하기 위해 높은 처리량 (96 웰 플레이트 포맷) 자성 비드 플랫폼을 사용한다. (31)
  3. 빠른 검색 인플루엔자 바이러스 실시간 역전사의 PCR 분석을 사용합니다. (31)

인플루엔자 4. 분리 코 닦음에서 바이러스

  1. 섹션 3.1에서 상술 한 바와 같이 샘플을 해동
  2. (1,000 겐타 마이신 황산염과 해동 샘플을 치료μg의 / ㎖), 암포 테리 신 B (22.5 μg의 / ㎖), 카나마이신 설페이트 (325 μg의 / ㎖).
  3. Madin-다비 개 신장에 접종 (MDCK) 전술 한 바와 같이 상피 세포. (32)

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결과

이 방법의 성공적인 사용은 RRT-PCR은 어떤 환경 파편 샘플링 중에 픽업에서 RNA 추출 및 RRT-PCR 동안 내부 통제의 사용과 함께, 쇼 샘플은 PCR 억제제를 포함하지 않은 것으로 결과를 얻을 수 있습니다. 샘플 접종 후 바이러스 분리 우물은 샘플에서 볼 환경 찌꺼기가 없도록해야한다. PCR은 바이러스 핵산, 반드시 가능한 바이러스를 감지하기 때문에 PCR은 종종 바이러스 분리보다 높은 IAV 긍정적 인 비율을 산출 이해 RRT-PCR 결과 및 바이러스 분리 결과 사이의 합리적인 계약이있다.

결과 코 와이프가 IAV의 현재 황금 표준 샘플링 기법이다 면봉을 코 수있는 유용한 대안을 보여준다. 에드워즈 등이.이 연구에서 2013 년 동안 미국 농업 박람회에서 돼지에서 수집 된 주둥이 와이프와 비강 면봉의 비교를 수행, 돼지는 모두 코 샘플링했다면봉과 코 와이프와 샘플 RRT-PCR 및 바이러스 분리와 병렬로 테스트했다. 에드워즈는 등. 탐지 및 IAV...

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토론

폴리 에스테르로 만들어진 코 면봉을 사용하여 돼지에서 시료를 수집하는 것은 IAV 감시를 수행에 도움이 입증되었습니다; 그러나, 비강 면봉 절차의 사용은 억제 용 스네어의 사용으로 인해 필요한 감시 활동을 방해한다. 비강 와이프는 시료 채취시에 사람과 돼지의 스트레스를 최소화하기 위해 현재 돼지 샘플링 기법의 정제를 나타낸다. 이 방법은 개발 및 전시 돼지 설정에서 확인되었지만 돼지에 IAV의 도축 탐지가 필요한 경우, 그것은 쉽게 다른 상황에 적용 할 수 있습니다 (즉 상업 돼지, 라이브 동물 시장, 생물 의학 연구 등)

전술 한 바와 같이, 이러한 샘플링 방식의 주요 드라이버 전시 돼지 인구왔다. 농업 박람회 기간 동안, 돼지 소유자는 돼지의 전체 조성물을 기준으로 재무 상과 악명을 얻기 위해 경쟁한다. 일화 증거는 O, 돼지가 잘 표시되지 않는 경우 있음을 나타냅니다wners은 구속 및 샘플 수집하는 동안 돼지의 스트레스 수준에 속성 수 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 계약 번호에 따라 인플루엔자 연구 및 감시 우수 센터(CEIRS), 국립 알레르기 및 전염병 연구소, 국립 보건원, 보건 복지부의 연방 기금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다. HHSN272201400006C.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BBL Brain Heart InfusionBecton, Dickinson and Company211059
Penicillin G Sodium SaltMP Biomedicals, LLC0211945371500 u/mg
스트렙토마이신 설페이트AMRESCO LLC0382
Gentamicin SolutionMediatech, Inc.30-005-CR50 mg/ml
Amphotericin B SolutionFisherS 24 25250 ug/ml
Kanamycin SulfateTeknovaK21055000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax SystemTPP Techno Plastic Products AG 99150
Nalgen 진단 병Thermo Scientific342002-9025HDPE 흰색 PP 클로저
Dermacea 거즈 스폰지, 8 플라이Covidien4412115.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) 
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참고문헌

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