실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

요약

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

초록

효율적인 면역 반응은 감염이나 부상의 사이트에 혈액 백혈구의 신속한 동원에 의존한다. 생체 내에서 백혈구의 이동을 조사하는 혈관 내피 세포와 백혈구의 transendothelial 마이그레이션 및 상호 작용의 분자 기초를 이해하는 데 매우 중요합니다. 하나의 강력한 접근 방식은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.

여기에서 우리는 거꾸로 공 초점 현미경 오렌지 염료 표지 호중구 주입 CX ₃ CR1 ^{GFP / 중량 마우스} IV에 영상 단핵구와 호중구을위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 영화는 모두 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 혈관에서 백혈구 행동의 분석을 허용 영상의 몇 시간이 30 분에서 모였다. 로컬 TLR2 / TLR1 효능 Pam3SK4과 혈관 염증을 유발하고 subseque을 모니터에 우리는 또한 단계를 설명호중구와 단핵구의 NT 모집.

제시된 기법은 또한 백혈구의 다른 개체군을 모니터링하고 다른 자극 또는 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 백혈구 보충 또는 거래에 관련 분자를 조사하는데 사용될 수있다.

서론

호중구와 단핵구는 지속적으로 혈액 순환 선천성 면역 체계의 세포이다. 부상이나 감염되면 염증 신호는 여기에 세포 면역 반응 ^1-3 시작, 손상 및 감염 조직으로 백혈구 diapedesis를 유도한다. 백혈구 동원의 신속성은 면역 반응의 긍정적 인 결과를 결정한다. 이러한 복잡한 프로세스는 백혈구에 연루 분자에 대한 통찰력을 얻을 .TO 순환 백혈구와 내피 ^1-3 사이의 접착제 접촉의 설립을 도와 염증이 내피 세포에 존재하는 특정 분자 (예를 들어, 셀렉틴, 내피 세포 결합 된 케모카인)에 의존 모집 캐스케이드, 그것은 세포의 모집 동력학을 시각화하고, 각 셀 / 인구의 동작을 추적하는 것이 중요하다. 효과적인 방법은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.

현재까지 콘텐츠 ">, 생체 내에 현미경을 사용하여 여러 가지 방식은 화상에 개발 된 맥관 ^4,5-. 예를 들어, 귀 진피 혈관 또는 생체 내에 공 촛점 현미경으로 장간막 정맥 촬상 뮤린 Ly6C ^낮은 단핵구 및 인간의 순찰 동작을 식별하는 데 사용 하였다 CD14는 정상 상태 조건 ^6-8 하에서 혈관의 내강 측에 CD16 ⁺ 단핵구

프로토콜

참고 : 동물 절차는 스위스 제네바에서 동물 관리의 기관 윤리위원회와 분할 한 수의학 사무소에 따라 수행되었다. 인증 번호 GE / 14분의 63.

골수에서 단일 세포 현탁액 1. 준비

1. 자궁 전위에 의해 희생 마우스 (구 8-12주). 70 % 에탄올로 뒷다리를 소독. 뒷다리에서 피부를 제거합니다.
2. 마우스 대퇴골과 경골을 해부하고 메스와 다리에서 조직을 제거합니다. PBS로 가득 배양 접시에 90 %의 에탄올과 장소 다리를 씻어.
3. 무릎 관절에 메스 분리와 대퇴골과 경골의 문화 후드, 깨끗한 조직에서. 뼈의 양쪽 끝을 잘라.
4. 50 ㎖에 23G 바늘과 준비 매체 (페놀 레드가없는 DMEM / F12, 1 %의 쥐 혈청)로 채워진 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 뼈에서 플러시 골수 튜브 나사. 섬세 23G 북동 통해 계대에 의해 세포 집합체를 중단edle과 1 ML의 주사기. 준비 배지 25 ml의 총 부피를 가져와.
5. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. 폐기 뜨는. 1 용액에 재현 탁 펠릿은 적혈구 용해 RBLC 버퍼 15 ㎖의 튜브 나사 (8.3 g NH ₄ CL, 증류수 1 L에 완전한 1g의 _{수 NaHCO3,....}

결과

원고를 쉽게 실시간으로 마취 된 마우스의 장간막 정맥 단구와 호중구의 동작을 모니터링하기위한 최적화 된 프로토콜을 설명한다. 37 ° C-온도 조절 챔버의 사용은, 마우스의 온도를 유지하기 위해 필수적으로 인해 또한 백혈구의 온도 의존 움직임이다. 마우스의 제조는도 1에 표시되는도 2는 현미경으로 보이는 모든 영역을 나타낸다. 전송 된 빛은 장간막 정맥 (빨간색 화살표) 및 동맥 (파란색 화살표)의 식별을 할 수 있습니다.

같은 영화 1, 영화 2와 ImageJ에 소프트웨어 생성 된 동영상 파일과 획득 된 영상의 치료. 3 표시에게 영화의 처음 지점에 대한 이미지 처리의 여러 단계를 그림 1. 영화 1은 정상 상태 조건에서 Ly6C ^낮은 단핵구의 순찰을 보여줍니다 이전에 해제로모든 호중구가 혈액에서 순환되는.......

토론

이 논문에서 설명하는 방법을 효율적으로 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 정맥에서 단핵구와 호중구의 행동을 연구하는 일관성있는 접근 방식을 제공한다.

준비의 중요한 단계는 PBS-젖은 조직과 소장의 고정입니다. 제대로 수행 한 경우, 장간막 혈관 멋지게 이미지 수집에 대한 커버 슬립에 노출되어있다. 이는 장간막 혈관에서 백혈구의 동작을 모니터링하는 관심 여러 필드의 선택을 가능하게한다.

우리의 프로토콜은 (1) 직접 모니터링 혈관에 염증을 유도하고, (2) 자극 이후에 이른 시점을 기록하고, (3)의 반응 속도를 따를 수 있도록, 실험 시작 전 장간막 혈관 exteriorization 포함 백혈구의 모집과 전 염증의 유도 후 동일 선박에 자신의 행동.

우리는 TRANSF더 많은 셀 (0.5-2x10 ⁶ / ⁶ 마우스 대 6-12x10).......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브	Beckton Dickinson	352058
10x CFI 플랜 아포크로맷 0.45    DT:4mm	Nikon
20x CFI 플랜 아포크로맷 VC 0.75 DT:1mm	니콘
세포 추적기 오렌지 CMRA 염료	생명 기술	C34551
EasySep 자석	줄기 세포 기술	18000
EasySep 마우스 호중구 농축 키트	줄기 세포 기술	19762
EDTA	시그마 알드리치	E6758
FCS	PAA	A15-042
잠수 오일 타입 A	니콘		어떤 점성 오일
라이프 박스 온도 제어 시스템	라이프 이미징
NaHCO3	시그마 알드리치	S5761
NH4Cl	시그마 알드리치	A9434
니콘 A1R 컨포칼 현미경	니콘	A1R	도립 현미경, 전동 x/y/z 스테이지, NIS 요소 소프트웨어
PBS	Life Technologies	D8537
페놀 레드 프리 DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	모든 페놀 레드 프리 배지는
에 재구성	PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms
		EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit

PBS 쥐 혈청 줄기 세포에 적합합니다. 조직 배양 접시 100 TPP 93100에 포함된 기술