난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다. 여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
상피난소암(EOC)은 미국에서 부인과 악성 종양으로 인한 주요 사망 원인입니다. 사망률은 여성의 75%가 이미 전이가 있는 말기 질환 진단에 기인합니다. EOC는 미만성 및 널리 퍼진 복강내 전이가 특징입니다. 세포는 복막강과 망막을 둘러싸고 있는 중피의 원발성 종양 앵커에서 떨어져 나와 복막 복수가 있는 상태에서 다초점 전이를 일으킵니다. 우리 실험실의 노력은 EOC 전이성 성공을 조절하는 요인에 대한 보다 자세한 이해를 목표로 합니다. 그러나 전이성 종양 부담을 정량화하는 것은 복막 전체에 병변의 수가 많고 크기가 작으며 광범위하게 분포되어 있기 때문에 중요한 기술적 도전입니다. 여기에서는 in vivo 다중 스펙트럼 이미징과 결합된 적색 형광 단백질(RFP)로 표지된 세포를 사용하여 EOC 전이를 분석하는 방법을 설명합니다. RFP 표지된 종양 세포의 복강내 주입 후, 희생 시간까지 매주 마우스를 이미지화합니다. 이때 복막강이 수술로 노출되고 장기가 현장에서 영상화됩니다. 그런 다음 절개된 장기를 라벨이 부착된 투명 템플릿에 놓고 생체 외에서 이미지화합니다. 다중 스펙트럼 불혼화를 사용하여 이미지 처리 중 조직 자동 형광을 제거하면 상대적 종양 부담을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 전이를 억제하여 전체 생존을 향상시킬 수 있는 화합물을 평가하기 위한 치료 연구를 포함한 다양한 응용 분야에서 유용합니다.
서론
상피 난소 암 (EOC)는 2015 년 미국에서 추정 된 21,290 새로운 진단 및 약 14,180 사망자 1 부인과 악성 종양으로 인한 사망의 가장 흔한 원인이다. 여성의 대부분 (> 75 %) 말기 질환으로 진단 (단계 III 또는 IV) 확산 - 내 복막 전이와 예후을 특징으로한다. 첫 번째 라인 화학 요법 다음 복강 질병의 재발은 일반적이며 사망률 2,3의 주요 원인을 나타냅니다. EOC는 직접 이웃 복막 기관에 기본 종양에서뿐만 아니라 해리로 확장 또는 단일 세포 또는 다세포 집계로 기본 종양 표면에서 세포의 발산을 모두 포함하는 독특한 메커니즘에 의해 전이를. 그들은 분리 - 유도 아폽토시스 4 레지스트 상기 세포를 복강 내로 흘려된다. 창고 종양 세포가 복막 림프 배수와 t을 차단으로 복막 복수의 축적은, 일반적이다umors는 혈관 투과성을 변경 성장 인자 생산. 이들은 앵커 복수 널리 보급 보조 병변 3,5- 생산 증식 그러자 흘렸다 종양 세포의 일부는, 소장, 간, 복막 및 장간막 포함한 복막 기관 및 구조물의 표면에 부착. 혈행 성 전이는 드물다. 따라서, 임상 관리는 일반적으로 (아무리 작은) 모든 눈에 보이는 종양의 절제로 정의 "최적의 용적 축소"를 포함하는 종양 감축 수술, 구성하지 않습니다. 전체 cytoreduction 전반적인 생존 -6,7- 상당한 증가와 연관된 식별 병변 제거 <0.5 cm의 과제와 관련된다.
작은 동물 모델은 예후 바이오 마커 및 신규 화학 요법 또는 병용 요법 방식의 테스트의 식별에서뿐만 아니라 질병의 진행에 대한 우리의 이해를 개선 난소 암 연구의 유틸리티를 입증했다. 기본으로난소 암 발생과 전이의 사이트는 복강가, EOC 전이의 동 소성 모델은 복강 질환의 분석 및 특성을 포함한다. 화상 종양 세포의 능력이 최근 개선되었지만, 심지어 단일 세포 수준에서 여전히 EOC의 전이성 종양 부담을 정량화에 상당한 어려움이 존재한다. 이러한 문제로 인해 수, 크기 및 전이성 병변의 해부학 적 위치로 발생한다. 또한, 정상 숙주 세포를 구별하는 라벨 암세포에 대한 필요성이 존재한다. 이전의 연구는 항체 기반 프로토콜 라벨 또는 루시페라아제 8,9 종양 세포의 형질 전환을 이용했다. 암세포를 직접 형광 표식은 제 1997 10 Chishima 동료에 의해보고되었다. 형광 라벨 암전 (11, 12)를 추적하기 위해 외인성 기질의 첨가를 필요로 정교한 종양 세포 특이성을 제공하는 더 효율적인 수단을 제공하지 않는다 .
여기서 우리는 뮤린 ID8 난소 암 세포 (13)와 면역 능력 C57 / BL6 마우스를 적색 형광 단백질 (RFP)로 이루어지는 동계 동 소성 이종 이식 모델을 사용 전이성 질환의 정량 분석 용 광학 이미징 방법 -tagged 설명한다. 우리는 상대 종양 부담 정량화하는 새로운 방법은 조직의 자동 형광의 제거로 생체 내 및 생체 이미징의 결합을 보여줍니다. 이 접근법은 난소 암 기관 특이 전이 특정 유전자, 성적인 또는 미세 환경 변형 및 / 또는 치료 방법의 효과를 평가하기위한 연구에 활용 가능성이있다.
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프로토콜
모든 생체 연구는 노트르담 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인과 여성 C57 / BL6J 마우스를 사용 하였다.
1. 쥐 난소 암 세포 배양
- 다음과 같이 ID8 뮤린 난소 암 세포 배양액을 4 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 1 L 5 NG / ㎖ 나트륨 셀레 나이트.
- RFP 및 선별 마커 (블라스트 유전자)를 발현하는 렌티 바이러스 상업적 조달 입자를 사용하여 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하는 ID8 뮤린 난소 암 세포를 형질 도입 13. 녹색 형광 단백질이 사용되지만, 약한 형광 신호를 제공 할 수 있습니다.
- 직전 전달에, 배양 세포를 50 - 70 % 최종 1 ml의 폴리 브렌 (5 μg의 / ㎖를 포함 합류하고 (페니실린 / 스트렙토 마이신)없이 신선한 매체를 추가집중).
- 조심스럽게 피펫 RFP-렌티 바이러스 (20 μL)는 접시에 적가하고 72 시간 동안 37 ℃로 배양한다. 매체를 제거하고 24 시간 동안 새로운 배지와 배양한다. 배양 배지 (5 μg의 / ㎖)로 블라스트를 첨가하여 형질 도입 된 세포의 선택을 시작하고, 형광 현미경 (그림 1)을 사용하여 적혈구를 모니터링.
- 배양 조직 배양 접시에 약 106 개 세포를 파종하고, 세포 단층이 합류 할 때까지 광학 현미경을 이용하여 가시화 일일 ID8 매체에 RFP 표지 된 세포.
- 융합은, 트립신 (0.25 %, 3 분)를 사용하여 세포를 수확하고, 세포가 분리 될 때까지 37 O C의 배양기에 플라스크를 반환하는 경우.
- 혈청을 함유 ID8 배지 6 mL를 트립신을 중화. 최대 피펫과 접시의 바닥에 대한 아래로, 다음 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 2 분 동안 1,200 RPM에서 원심 분리는 다음 GL을 사용한 매체 대기음엉덩이 피펫.
- 부드럽게 따뜻한 PBS 6 ㎖에 재현 탁 이상 1.5로 원심 분리하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 세포를 씻으십시오. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 PBS에 재현 탁. 주입 할 때까지 따뜻한 세포 (37 O를 C)를 유지합니다.
2. 복강 내 ID8 세포의 주입 및 생체 이미징
- 복강 내 (IP) 주입을 통해 천만 세포의 총 따뜻한 ID8-PBS 용액 2 ml로 각각의 마우스를 주입한다. 종양 세포는 매주 라이브 영상과 함께 약 10 주 동안 생체 내에서 성장 할 수 있습니다.
- 즉시 (0.5 L / 분, O 2 유량에 2.5 % 유량) 이소 플루오 란을 사용하여 각각의 마우스를 마취 한 다음 마우스의 무게 및, 그 후 주입 매주 다음. 주 : 마우스하지 종양 부담 정량적 측정 아니라 연구에 걸쳐 마우스 개체 실제 진행하는 일반적인 수단으로 칭량 하였다. 마우스는 무게TS는 자신의 기존의 가중치와 비교 하였다.
- 이소 플루오 란 챔버에 배치하여 쥐를 마취. 절차 전반에 걸쳐 2.5 % 유량 이소 플루오 란에 노출 코 콘에 마우스 머리를 배치하여 스캔하는 동안 일정한 마취를 유지한다.
- 검은 머리는 형광 신호의 감쇠 원인이됩니다, 각 마우스의 몸통과 복부에 머리를 제거하는 제모 크림을 사용합니다. 마우스는 제모 크림의 도포 후 따뜻한 물로 목욕을하고 RT 종이 타월로 건조된다.
- 마취 동안, 작은 동물 광학 이미징 시스템을 이용하여 각각의 마우스의 전신 스캔. 각 시점에서 일대의 모든 마우스를 스캔합니다. 다음 두 단계 프로토콜 (그림 2A)를 사용합니다 :
- 1 단계에서, 형광 표지 (RFP) 종양 세포를 관찰 440 내지 460 nm 인, (4)의 여기 필터를 사용하여 5 개의 이미지를 수집하는 멀티 스펙트럼 획득을 실행할80 내지 520 nm의 파장이 540 nm, 600 nm 인 발광 필터. 15 초 표준 노출, 2 × 2 비닝 (binning), 160mm의 FOV, 1.1 F 정지 다음 인수 매개 변수를 사용합니다.
- 2 단계에서, 전체 동물을 관찰 오픈 여기 필터 (흰색 빛), 오픈 방출 필터, 2 × 2 비닝 (binning) 0.2 초 표준 노출과 16cm의 FOV를 사용하여 반사 이미지를 획득한다. 참고 : 실제 촬상 시간 ~ 1 분이다.
3. 마우스 해부 및 이미지 인식
- 실시간 이미징 (복부 팽만에 의해 입증되는 바와 같이) 복수의 광범위한 복강 질환 동물 전시 축적 감소 또는 체중 20 % 이상, 혼수 또는 고통의 다른 징후의 이득의 존재를 표시하면, CO (2)를 이용하여 각각의 마우스를 안락사 마취 경추 탈구시켰다.
- 뾰족한 dissectio를 사용하여 마우스의 복부 정중선을 따라 전방으로 피부를 잘라n 개의 가위, 흉곽의 바닥에 허벅지의 상단에서. 전용 스킨 층 (그림 2Bi)을 극복하기 위해 세심한주의를 기울입니다. 조심스럽게 복막 벽을 뚫지해야되고, 복막 조직으로부터 피부를 구분합니다.
- 피부의 두 플랩을 만들 수 흉곽의 바닥과 허벅지의 상단 양쪽 옆으로 잘라 날카로운 해부 가위를 사용하여 (그림 2B II, III).
- 오픈 피부 플랩과의 복부 측면에 각 마우스 (복강이 아래로 향하도록) 뽑아 놓고 작은 동물 광학 이미징 시스템 사용 현장에서의 장기와 각 마우스를 스캔 (그림 3A를, B).
- 2.4.1.-2.4.2에 설명 된 것과 같은 이미지 획득 파라미터를 사용한다.
- 간, 복막 / 췌장, 위, 다이어프램, 소장, 대장, 좌우 복막 난소 kidne 포함한 개별 복강 장기를 추출하여 마우스를 해부 계속YS, 장간막 지방 패드.
- 관찰 열거하고, 각 기관에 보이는 종양을 기록한다. 각 종양의 직경을 측정하는 캘리퍼스를 사용한다.
- 매체로 2 5mm와 같은 대형보다 5mm 사이에 작은으로 직경이 2mm보다 종양이 덜 지정합니다.
- 장기 스캔 템플릿 각 기관에 대해 소정의 위치를 식별합니다 (그림 4)에서 장기를 놓습니다. 촉촉한 기관을 유지하기 위해 PBS를 사용합니다.
- 작은 동물 광학 이미징 시스템 (그림 3C, D)를 사용하여 기관의 각 시트를 스캔합니다.
- 단계 2.4에 기재된 것과 같은 화상 획득 파라미터를 사용한다.
- 스캔 한 후, 10 % 포름 알데히드의 장소 기관은 조직학에 대한 후속 처리를 가능하게합니다.
제 종양 부담 4. 정량전자 형광 이미지
- 각 멀티 스펙트럼 스캔 자동 형광의 양을 감소시키기 위해, 먼저 작은 동물 촬상 시스템에 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 파일을 unmix.
- 생체 스펙트럼 파일에서, Autofluor 다음 : 먼저 RFP로드 혼합하지 않은 이미지 창에서 생체 레드 파일에서와 Unmix을 선택합니다.
- 16 비트 티파니 (눈금) 형식으로 .bip 파일을 내 보냅니다.
- (현장에서 장기와 생체 장기 다음 전체 마우스 본체) ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다.
- ImageJ에있는 기관 스캔 템플릿 파일의 16 비트 .TIFF 파일을 열> 파일 열기를 사용합니다.
- 이미지> 조정에서> 밝기 / 대비, 최소 0으로 값을 표시하고, 최대 35,353에 값을 표시 한 후 아래 설정을 선택이미지> 조회 테이블, 레드 핫을 선택합니다. 참고 : 다양한 동물 모델은 서로 다른 휘도 레벨을 필요로하지만, 소정의 연구에 걸쳐 일관된 휘도를 유지하는 것이 중요하다.
- 자유형 선택 도구를 사용하여 각 장기 주변의 관심 선택 (ROI)의 자유 형태의 영역을 그리 각 장기의 면적을 계산하기 위해 측정 도구 (CTRL + M)를 사용한다; 스프레드 시트의 각 장기의 면적을 기록한다.
- 각 기관 주위에 그려진 ROI으로, 오른쪽 ROI 내에서 클릭 만 기관을 포함하는 복제를 선택합니다.
- 임계 값> 조정> 이미지에서 개별 기관 보면서, ONL 선택 + 1200의 낮은 임계 값 레벨과 + 1700의 상위 임계 값 레벨에 이미지의 임계 값을 설정하는 선택y를 가장 밝은 형광 영역과 어두운 배경을 선택 확인; 확인을 선택합니다. 참고 : 이전에 밝은 영역이 분석 단계 선택되도록 위 그림과 같이 이미지가 ImageJ에있는 임계 값 슬라이더의 수동 조작이 필요할 수 있습니다. 다른 질병 모델 다른 임계 제한을 필요로하지만, 소정의 연구에 걸쳐 일관되는 임계 레벨을 유지하는 것이 중요하다.
- 분석에서> 크기 변경, 입자 분석 (픽셀 ^ 2) 10 무한대에가보기로 선택합니다 개요 만 "결과 표시"를 선택하고 지역과이 밝은 지역의 원시 통합 밀도를 모두 측정 할 확인을 클릭하여 확인 간주 종양.
- 표면적의 값과 표시 각 종양 선택 원시 집적 밀도를 녹음 장기 표면 영역을 포함하는 동일한 스프레드의 결과 표.
- 분석에서> 도구> 교정 바, 기관의 이미지에 교정 규모 줄을 추가합니다. 참고 :이 예에서, 이것은 위 오른쪽, 검은 색으로 채우기 색, 흰색의 라벨 색상, 5 레이블의 수, 0으로 소수 자릿수, 12 글꼴 크기 및 확대로 위치를 변경하여 이루어졌다 4.0 인자와 굵은 텍스트를 가능하게한다.
- 파일에서> 다른 이름으로 저장 ...하는 .TIFF 및 .JPEG로 몽타주를 저장합니다.
- .JPEG 기관의 파일 다음 삽입 아래> 텍스트 상자를 엽니 다> 파일 열기를 사용하여 , 장기의 세 각 행 아래의 텍스트 상자를 만들어 장기 라벨을 추가 할 수 있습니다.
- 마우스 번호의 순서로 ImageJ에의 전신 스캔의 16 비트 티파니 각 파일을 엽니 다> 파일 열기를 사용합니다.
- 0 값을 표시하고, 최대 + 35,353에 값을 표시 한 다음 이미지에서> 조회 테이블, 레드 핫을 선택 이미지에서>,> 밝기 / 대비를 조정 최소를 설정하는 선택합니다.
- 파일에서> 다른 이름으로 저장 ...,가. 티파니와 .JPEG로 몽타주를 저장합니다.
5. 데이터 분석
- 각 마우스의 각 장기에 대한 각각 종양 선택 영역 원시 집적 밀도를 추가하고 각 마우스의 총 장기 종양 영역을 기록한다.
- 기록 된 영역과 원시 integrat을 정상화해당 기관 표면적 (표 1)에 의해 총 종양 면적 총 원료의 통합 밀도 값을 나눔으로써, 각 장기의 크기에 대한 ED 밀도 값.
- 계산하고 정규화 종양 표면 영역과 상기 정규화 된 원시 집적 밀도 값 모두의 평균 플롯 (도 5a를, B).
- 시각적으로 전이 병변에 대한 각 기관의 검사시 육안으로 볼 수 있던 종양을 계산하여 얻은 이들의 평균 값을 비교합니다.
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결과
난소 암의 전이 메커니즘은 다수의 작은 (<2mm) 병변을 포함한 다양한 크기의 수많은 병변 이루어진 고도로 확산 복강 내 전이를 특징으로한다. 따라서, RFP 표지 된 종양 세포의 경우 (도 1) 및 광학 이미징 수동 계산 병변의 크기를 측정하는 다른 방법을 제공한다. 시간에 따른 종양 부담의 개발은 매주 복수의 존재 가능성을 측정하는 마우스 복부 둘레의 측정 중량에 의해 결정될 수있다. 생체 내 광 이미징 종양 부담 (도 2)을 평가하기 위해 상보적인 방식을 제공한다. 난소 암이 복강에 여러 사이트와 사이트 별 전이의 분자 드라이버 전이를 현재 알려져 있지 않다. 전체 종양 부담 판정 이외에, 다음주의 희생 박리 평가 및 부위 특이 PA를 정량화하기 위해 수행 될 수있다전이 tterns. 따라서, 각 장기의 생체 외 평가 (그림 3C, D)과
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토론
면역 된 마우스에서 수행되어야 인간 난소 암 세포를 사용하는 연구와 대조적으로,이 프로토콜은 상술 한 면역 C57 / BL6 마우스와 뮤린 동계 난소 암 세포를 이용한다. 이 종양 진행 및 전이 면역 침윤의 잠재적 역할에 대한 평가를 가능하게하지만, 복부의 표면에 검은 머리카락의 존재는 이미징 덜 민감 렌더링한다. 탈모의 사용은 촬상 전에 모발 화상 취득 향상을 제거하지만, 시간 소모적 특히 길이 촬상을 요구하는 실험이다한다. 털 '누드'마우스는이 프로토콜에서 사용될 수 있고, 제모 기반 제모를 필요로하지 않는다. 또한, 누드 마우스는 면역 체계 기능 부족하므로 역시 면역계의 기여도 분석받지 않는 상기 실험에서, 인간 난소 암 세포의 증식을 평가하기 위해 이용 될 수있다.
또한 intraper 깊이 주목해야한다광학 형광 이미징은 일반적으로 5mm보다 큰 깊이에 종양을 감지하지 않으므로 itoneal 종양은 또한, 기술적 과제를 제시한다. 또한, 복수의 유체의 유...
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공개 사항
이 문서는 브루 커 BIOSPIN 후원 모드의 전 임상 영상에 특별한 문제의 일부입니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)/국립암연구소(National Cancer Institute)의 연구 보조금 RO1CA109545 및 RO1CA086984 지원되었으며, Leo and Ann Albert Charitable Trust(MS 측)의 상을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 변형 독수리 매체 | Corning | 10-014-CM | |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 10437-028 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | |||
| 인슐린-트랜스페린-아셀렌산나트륨 매체 보충제 | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme 소동물 이미징 시스템 | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral 소프트웨어 | Bruker Corp | ||
| 적색 형광 단백질을 사용한 렌티바이러스 입자 | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| 트립신 | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 탈모 크림 (예: Nair Hair Remover Lotion) | 약국에서 구매 | 해당 없음 | |
| ImageJ 소프트웨어 | http://imagej.nih.gov/ij/ | 다운로드 | |
| 해부 도구(집게) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| 해부 도구(가위) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
참고문헌
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