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방법 논문

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

6.4K 조회수

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DOI:

10.3791/53328

⸱

2016년 5월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

이 논문에서

요약

우리는 암의 광음향 이미징을 위해 금 나노막대를 포함하는 세포 운반체의 준비 및 타당성을 보여줍니다.

초록

금 나노 막대는 종양에 집에 근적외선 창, 낮은 세포 독성 및 잠재적 인 자신의 강렬한 광 흡수 덕분에 같은 광열 절제와 암의 광 음향 이미징 생물 의학 응용 프로그램의 범위 매력적이다. 그러나 종양에 자신의 배달은 여전히​​ 문제가 남아있다. 혁신적인 접근 방법은 체외에서 금 나노 막대로 로딩 될 수있다 종양 관련 식세포의 친 화성의 착취로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 준비와 금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 광 음향 검사에 대해 설명합니다. PEG 화 금 나노로드는 양이온 프로파일을 달성하기 위해, 사차 암모늄 화합물로 변형된다. 일반 배양 접시에서 쥐의 대 식세포와의 접촉에서 이러한 입자는 세포 내 이입 소포에 다량 흡수를 받아야 발견된다. 이어서 이들 세포를 확인하기 위해 사용된다 biopolymeric 하이드로 겔에 포함되는 음향 변환의 안정성입자의 세포 차량에 자신의 포함에 유지됩니다. 우리는이 결과는 종양 플라즈몬 입자를 제공하는 새로운 전략의 개발을위한 새로운 영감을 제공 할 수 있음을 확신합니다.

서론

지난 10 년간, 금 나노로드, 나노 쉘과 같은 다양한 nanocages 플라즈몬 입자 의치 광학 1, 2, 3, 4의 응용 프로그램에 대한 상당한 관심을 받고있다. 표준 금 나노에 저촉이 새로운 입자는 몸을 통해 깊은 광학 침투 및 내인성 구성 요소 1 이상의 높은 광학 대비를 제공하는 근적외선 (NIR) 창에 끌어 들여. 이 기능은 광 음향 (PA) 이미징 및 암의 광열 절제와 같은 혁신적인 애플리케이션에 대한 관심을 자극하고있다. 그러나, 몇 가지 문제는 이들 입자의 임상 침투를 억제. 예를 들면, 광학적 활성은 8 그 과열을 유도하고 photoinstability 5, 6, 7에서 더 많은 구형 프로파일을 향해 기능적 형상을 수정하는 경향 9. 과학적 논쟁을 지배하는 또 다른 문제는 종양에 자신의 전신 전달합니다. 특히, 금 나노 막대는 향상된 침투성 및 보존 및 악성 마커의 특정 프로브와 활용의 용이성을 표시 종양을 전면적으로 퍼지다에 이상적 크기를 결합합니다. 따라서, 혈류로 직접 분사에 대한 이들의 제조가 가능한 방식 10, 11, 12, 13로 인식한다. 입자의 대부분이 단핵 식세포 시스템 10, 11, 12에 의하여 촬영 해짐 그러나,이 경로는 문제가 남아있다. 또 다른 관심사는 본체 (14)를 통해 순환 후의 입자의 생화학 광 안정성이다. 입자가 콜로이드 안정성 및 집계를 잃을 때, 자신의 플라즈몬 기능 및 열 전달 역학 플라즈몬 커플 링 (15)으로 고생 할 수있다, 16, 17 및 18 개를 크로스 과열.

최근 종양 관련 식세포의 친 화성을 ​​악용 할 수있는 개념은 스마트 대체 19, 20, 21로 떠오르고있다. 이 세포를 감지하고 높은 특이성과 종양을 전면적으로 퍼지다 수있는 타고난 능력을 보유. 따라서, 하나의 관점에서는, 환자에서 이러한 세포를 분리 관내 금 나노로드로로드하고 전달을 담당하는 셀룰러 자동차로 사용하는 목적으로, 환자에게 다시 주입 할 수있다. 또 다른 이점은 생물학적 인터페이스가 시험 관내에서 구성 될 것이기 때문에, 입자의 광학 생화학 적 안정성을 더 제어 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 광학 조영제 이러한 세포 차량의 성능은 중요한 분석이 필요합니다.

이 작품에서, 우리는 준비와 cellul의 중요한 문제에 대해 설명암의 PA 이미징을위한 금 나노 막대를 포함 아칸소 차량. PEG 화 금 나노로드는 혈장 막 (23), (24)과의 상호 작용을 촉진 할 것으로 예상된다 양이온 프로파일을 달성하기 위해, 급 암모늄 화합물 (22)로 변형된다. 이 입자들은 희망 생물학적 기능 대부분을 방해하지 않고, 대부분의 세포 종류에서 효율적이고 불특정 흡수를 겪는다. 쥐의 대 식세포는 최대 꽉 세포 내 이입 소포 내에 국한 될 셀 당 많은 000, 200 등의 양이온 금 나노로드에로드됩니다. 이 구성은 때문에이 소포 내부 플라즈몬 커플 링 및 크로스 과열의 위협의 우려를 발생한다. 따라서, 대 식세포는 입자의 PA 전환의 안정성의 대부분은 세포 내 이입 소포로 성장 매체에서 전송에 유지되어 있는지 확인하기 위해, 생체 조직을 모방 biopolymeric 하이드로 겔에 포함된다. Effectiv전자 측정 기준 PA 촬상 즉각적인 관심 조건 하에서 PA 변환의 안정성을 측정하기 위해 밖으로 일된다. 재 형성 임계 값은 10 Hz에서의 전형적인 반복률 50 레이저 펄스의 트레인 후에 광 불안정성의 바로 시작에서 설정된다.

우리는이 결과는 종양 플라즈몬 입자를 제공하는 새로운 전략의 개발을위한 모멘텀을 제공 할 것으로 확신한다.

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프로토콜

참고 : 금 나노 막대의 모든 농도는 명목 금 몰 농도의 관점에서 표현된다. 다른 작품과의 비교를 위해, 1 M 금은 대략 우리의 경우, 20 μM 금 나노 막대에 대응 있습니다.

양이온 금 나노 막대의 1. 준비

참고 :..이 방법은 Ratto 등 (26)에 따라 Nikoobakht 등 (25)에 의해 도입 및 적응 프로토콜에 따라, 아스 코르 빈산와 HAuCl 4의 촉매 환원에 의한 세트 리모 늄 브로마이드 (CTAB) 캡핑 된 금 나노 막대의 합성으로 시작한다. 다음 이러한 금 나노로드가 폴리에틸렌 글리콜의 조합에 의해, 혈장 멤브레인보다 생체 적합성 및 친 화성을 ​​얻기 위해 수정 된 10, 11, 27, 28 가닥 4 급 암모늄 화합물 22.

  1. concentratio 24 ㎖의 CTAB 덮인 금 나노 막대를 정화이 원심 분리의 사이클 (12,000 XG, 30 분) 및 경사 450 μM 금의 n은. 초기 볼륨 죽은 볼륨의 비율이 프로토콜의 모든 원심 분리 단계는 약 1/200 이하 있는지 확인합니다. 세척 용액으로 500 μM 수성 CTAB를 사용하여 최종적으로 500 μM C​​TAB와 0.005 % (v / v)의 폴리 소르 베이트 20을 함유하는 pH가 5에서 6 ml의 100 mM의 아세테이트 버퍼에 입자를 전송합니다.
  2. 30 ㎕의 10 mM의 수성 알파 - 메 톡시, 오메가 머 캅토, 폴리 (에틸렌 글리콜) (MW ~ 5000)를 첨가하고, 37 ° C에서 30 분 동안 반응 떠난다.
  3. 디메틸 설폭 사이드에서 N, N, N 트리메틸 암모늄 브로마이드 및 37 ° C에서 24 시간 동안 휴식 떠나 - 30 μL 100 밀리미터 (11 Mercaptoundecyl)를 추가합니다.
  4. 다음으로, 네 개의 원심 분리의 사이클 (12,000 XG, 30 분) 및 경사 이러한 입자를 물에 18 ml의 0.005 % (v / v)의 폴리 소르 베이트 20을 추가하고 정화. 세정액으로서 물을 0.005 % (V / V) 폴리 소르 베이트 20을 사용하여 최종 pH를 2.4 ml의 멸균 PBS로 입자를 전송할7.4. 금의 공칭 최종 농도는 4.5 mm이다.

금 나노 막대와 쥐 대 식세포의 2.로드

  1. J774A.1 DMEM과 10 % 소 태아 혈청, 1mM의 글루타민, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 배지 보충 단핵구 / macrophagic 세포주를 사용한다. 플레이트 (5) 5 내지 60 × 10 mm 직경의 네 개의 배양 접시에 세포 분리시 subconfluent되도록 그들을 24 시간 동안 성장하는 것을 허용한다 (단계 2.2 참조).
    1. 프로토콜을 통해, 표준 배양 조건 (37 ℃로, 5 % CO 2, 95 % 공기 및 100 % 상대 습도)하에 세포를 유지한다. 세포를 조작하는 층류 캐비닛과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.
  2. 24 시간 후, 키토산 필름에 포함되는 양이온 성 금 나노 막대와 세포를로드하고 그들을 준비 :
    1. 입자가 세포에 의해 흡수되도록하기 위해서는, 4.5 추가 분취각각 페트리 접시에 PBS에 mM의 Au로 양이온 금 나노로드 (100)의 Au μM의 최종 농도를 달성하기 위해서. 24 시간 동안 배양에서 배양 접시를 남겨주세요.
    2. 다음에, 그 좋은 조건으로 업로드 확인하기 위해 광학 현미경으로 세포를 관찰한다. 세포는 정상적인 형태와 어두운 세포 내 소포의 수를 전시한다. 다음 단계 (적어도 2 × 106 세포)에 대한 세포의 적당한 양을 달성하기 위해, 두 개의 배양 접시에서 그 병합 스크레이퍼로 세포를 분리 및 제거하도록 (120 XG 6 분) 원심 양이온 금 나노 막대의 초과. 휴대 펠릿은 거의 검은 보일 것입니다.
    3. 2 ml의 PBS에서 펠렛을 중단하고 BURKER 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. 원심 2 × 106 세포 (120 XG 6 분), 실온에서 십분 PBS 포름 알데히드 (/ V W)을 2 ml의 3.6 % 그들의 펠릿 수정을 포함하는 현탁액. 마지막으로, centrifugat하여 펠렛을 세 번 씻어이온 정착액을 제거하기 위해 (120 XG 6 분). 세척 용액으로 PBS를 사용합니다.

키토산 필름으로 대 식세포의 3 매설

주 : 키토산 26, 27, 28의 특유한 특성, (29)는 양이온 금 나노로드로 염색 대 식세포를 함유하는 생체 모방 팬텀을 생성 시키는데 이용된다. 같은 아가로 오스와 같은 다른 하이드로 겔에 대해, 키토산은 PA 현미경 6 중요 훨씬 강하고 얇은 필름을 할 수 있습니다. 이러한 팬텀의 제작은 이전 프로토콜 (29), (30), 다음 (30)에 규정 된 일부 수정 31에 따라 수행된다.

  1. 산성화 (아세트산을 첨가하여 pH를 4.5 수득)과 점성이 3 %를 준비 저분자 키토산 (/ V W) (평균 MW 120 kDa의) 용액은, 철저하게 혼합그것은 40 ° C에서 24 시간 동안 균질화 할 수 있습니다.
  2. 다음에, 키토산 용액 500 μL와 양이온 금 나노로드 (2 × 106 세포)를 함유하는 뮤린 대 식세포를 섞는다.
  3. ~ 50 μm의 두께를 얻기 팬텀 1.91 cm 2 폴리스티렌 주형에 혼합물 250 mg을 붓고 24 시간 동안 질소 기류하에을 탈퇴 할 수있다. 그 후, 가교 결합을 유도하기 위해, 500 ㎕의 1 M NaOH로 이러한 샘플들을 처리하고, 초순수 10 ㎖로 헹구고.

광 음향 변환의 안정성 4. 테스트

주 : PA 변환의 안정성 REF 6에서 설명 수제 설치와 PA 실험에 의해 조사 하였다.

  1. 플레이트의 바닥으로부터 ~ 5mm의 거리를 유지하기 위하여, 배양 접시에 침지 플라스틱 홀더를 사용하여 예를 들어 탈 이온수에서 대 식세포를 함유하는 키토산 막을 일시. 마이크로 미터 XY 스테이지에이 판을 넣어샘플의 위치를​​ 제어하기 위해서이다.
  2. 2500 - 400의 파장 범위 YAG 레이저하십시오 Q 스위치 Nd를 3 차 고조파에 의해 펌핑 광 파라 메트릭 발진기로부터, 예를 들어 금 나노로드 (의 길이 플라즈몬 밴드 공진 ~ 5 나노초 펄스 폭을 가진 레이저 빔을 집중 ~ 300 ㎛의 스팟 직경을 막면에 수직 인 5 내지 나노초의 펄스 지속 시간).
    1. 조정 레이저 플루 언스를 레이저 출입구 앞의 감쇠기를 놓고 플루 언스 변동 에너지 측정기 (예를 들면, 초전 검출기)에 레이저 빔의 일부를 초점을 모니터링하는 빔 스플리터를 사용한다. 정렬하는 동안 엠제이 / 펄스 당 cm 2 1 ~ 아래의 광 플루 언스을 유지한다. 레이저를 켤 때마다 적절한 레이저 안전 안경을 사용합니다.
  3. 필름 표면의 오프 페트리 접시 ~ 2mm로하고 번역 마이크로 미터를 사용하여 그 위치를 조정 - 초음파 트랜스 듀서 (20 MHz의 하나의 주파수 범위)을 찍어및 회전 스테이지가 막으로부터 방출 된 PA 신호를 최대화한다.
  4. 샘플 6에 손상을주지 않는 프로브 플루 언스 F LO를 결정합니다 :
    1. 1 엠제이 / 최소 500 펄스에 대한 펄스 당 cm 2 주위 플루 언스에서 시료의 임의의 지점을 조사. 각 펄스를 들면, 오실로스코프 에너지 미터의 초음파 변환기 및 레이저 플루 언스에서 해당 PA 신호를 획득. F LO 시험으로 평균 플루 언스의 이름을 지정합니다.
    2. 펄스 수의 함수로서 피크 - 투 - 피크 진폭으로서 PA 신호의 세기를 계산한다. 레이저 강도 변동 평형 추가하기 위해, F LO 시험 자체 플루 언스의 비율을 각각 PA 신호의 크기를 정상화. 펄스 수의 함수로서 정규화 된 PA 강도의 추이를 분석하고 시간이 지남에 따라 그 안정성을 확인.
    3. 불안정성의 경우, 반복 F LO의 낮은 값으로 4.4.3에 4.4.1 단계 시험입니다. 안정성의 손실이 발생 될 때까지 안정성의 경우, 높은 ~ 10 % F LO 재판의 값을 반복한다. 안정성을 보장 F LO 재판의 두 번째로 높은 값으로 프로브 플루 언스 F LO를 설정합니다.
  5. 재편 임계 플루 언스를 측정 :
    1. 샘플의 또 다른 임의의 지점을 선택하고 F LO 500 펄스 이상 평균 PA 강도 (I LO a를) 프로브.
    2. F LO보다 큰 공칭 플루 언스를 설정하고 50 펄스를 제공합니다. F의 EXC으로 평균 플루 언스의 이름을 지정합니다.
    3. 다시 한 번 F LO 500 펄스 이상 평균 PA 강도 (I LO의 B)를 조사. 비율 R = I LO의 B / I LO을 계산합니다. 통일 아래의 R 값은 시료의 광학 특성의 돌이킬 수없는 변화의 증거를 제공합니다.
    4. 필름을 이동하는 XY 스테이지 마이크로 미터를 사용하여 변경 poin랜덤 샘플 t. 반복 주위와 화합의 위, 아래 R의 몇 가지 값을 가질 수 있도록, F EXC의 다른 값으로 4.5.4에 4.5.1 단계를 반복합니다. 15 점은 적당하다.
    5. F의 EXC의 함수로서 플롯 R 및 R 통계적 불확실성 초과 한 상이하기 시작할 때 그 값으로 고쳐 번째 한계 플루 언스 F를 식별한다. (6)

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결과

여기에서, 암의 PA 이미징을위한 금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 가능성은 프로토콜의 일반적인 결과와 함께 표시됩니다.

도 1의 TEM 이미지는 단계 2. 입자의 TEM 영상 및 용 셀의 제조는 다른 17 설명한 후 1 단계 후의 입자 및 셀룰러 차량의 일반적인 모양을 나타낸다. 양이온 금 나노 막대는 정상적인 형태를 유지 식세포에서 대규모 축적을받을. 입자가 세포 내 이입 소포 내에 단단히 밀폐 것으로 밝혀졌다.

도 2a는 양이온 금 나노로드 함유 식세포 광 투과 이미지를 표시하고,이 현미경 사진에 의해 입증 된 바와 같이 3 단계 이후에, 키토산 팬텀에 분산 키토...

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토론

종양 관련 대 식세포를 대상으로하는 개념은 암 34, 35, 36을 방지 할 수있는 강력한 개념으로 부상하고있다. 여기에, 대신 자신의 멸망,이 세포는 자신의 친 화성의 착취에 의해, 종양에 금 나노 막대를 가지고 세포 차량으로 채용된다. 이 관점은 입자의 사려 깊은 디자인, 세포 및 특성에 자신의 통합이 필요합니다. 우리는 양이온 금 나노 막대로드 쥐의 대 식세포의 광 안정성이 자신의 플라즈몬 커플 링 및 크로스 과열이 중요하지 않은 것을 의미한다 세포 내 이입 소포 내의 입자의 감금, 고생하지 않는 것으로 나타났습니다. 우리는 PEG 가닥과 금 나노와 같은 오프 공명있는 모양의 발생 빈도는 약 (자신의 직경 17 (nm의 10 정도) 한 열 확산 길이에 대해 너무 밀착로 얻을 수있는 입자를 방지 가설 30 nm의각각 플라즈몬 커플 링 및 크로스 과열, 5 나노초)입니다.

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 부분적으로 ERANET + 프로젝트 LU를 거품과 BI-TRE의 프레임 내에서 Regione 토스와 유럽 공동체에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드시그마-알드리치H6269금 나노막대를 합성하기 위해
금(III) 염화 삼수화물시그마-알드리치520918금 나노막대를 합성하기 위해
질산은시그마-알드리치S6506금 나노막대를 합성하기 위해
L-아스코르브산시그마-알드리치A5960금 나노막대를 합성하기 위해
수소화붕소나트륨시그마-알드리치금 나노시드를 합성하기 위해
MeO-PEG-SHIris BiotechPEG1171금 나노로드를 PEGylate합니다. 분자량은 약 5,000Da입니다.
아세트산시그마-알드리치320099PEGylate 금 나노로드를 수용하고 키토산
나트륨 아세테이트시그마-알드리치S8750PEGylate 금 나노로드
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-트리메틸암모늄 브로마이드시그마-알드리치7333054차 암모늄 화합물로 금 나노로드를 변형하려면
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치27685511-mercaptoundecyl) -N, N, N< / em>-trimethylammonium bromide
Polysorbate 20Sigma-AldrichP2287PEGylated gold nanorods
PBSLonzaBE17-516F세포로 배양하기 전에 금 나노로드를 현탁시키고 세포의 펠릿을 처리하려면
J774a.1ATCCTIB-67Monocyte/macrophage murine cell line
DMEMLonzaBE12-707F세포 배양 배지
FBSLonzaDE14-801F세포 배양 배지에 추가
-글루타민LonzaBE17-605E세포 배양 배지에 추가
니실린/스트렙토마이신LonzaDE17-602E세포 배양 배지에 추가
트리 접시NEST705001세포 배양 접시
세포 스크레이퍼EuroCloneES7018세포를 분리하기 위해
포름 알데히드Fluka47630세포를 수정하기 위해
키토산, 저분자시그마 - 알드리44886975-85 % 탈아세틸화. 분자량은 약 120,000Da입니다.
수산화 나트륨시그마 알드리치306576키토산을 불용화하고 하이드로 겔
폴리스티렌 세포 배양 플레이트NEST702011키토산 하이드로 겔을 제조하기위한 금형으로 사용
Continuum, Santa Clara, USA세 번째 고조파에 의해 펌핑 된 광학 파라 메트릭 발진기Surelite OPO plus광음향 테스트를위한 광학 여기 소스
초전기 감지기 Gentec, Quebec, CanadaQE8SP광음향 테스트를 위한 광학 플루언스를 모니터링하려면
사전 증폭 바늘 수중청음기Precision Acoustic, Dorset, UK모델 1mm 센서 직경 및 1-20MHz 주파수 범위광음향 신호를 측정합니다
(L 페 페량 를 생성하기 위해 Q- 스위치 Nd : YAG 레이저 의.

참고문헌

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