레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

Summary

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

Abstract

우리는 과정 중에 타겟 레이저 조명 및 매칭 필터 고글 뇌 절편에서 전기 천공을 통하여 염료 흡수를 증가시키기 위해 전기적 및 압력 펄스의 시리즈를 사용하여 시험 관내 트레이서 주입 프로토콜을 결합하는 기술을 제시한다. 그 자체로 체외 전기의 기술 기술은 뇌의 특정 지역을 타겟팅에 대한 상대적으로 좋은 시각 제어를 얻을 수 있습니다. 레이저 형광 유전자 마커의 자극과 판독 대역 통과 필터 고글을 통해, 유전자 표지 세포 / 핵 및 형광 추적 염료의 배출을 선택할 수있는 연구자가 실질적으로 주사의 정확도를 높일 수 있습니다과 결합하여 관심 영역을 발견하고 더욱 효율적으로 주입 영역에서 염료 확산 / 흡수를 위해 제어함으로써. 또한, 레이저 조사에 의한 방법은 잠 neurocircuit 소정의 기능을 연구 할 수 있도록GFP 발현이 신경 세포의 개체군에 의해 표현 송신기의 유형에 연결된 경우에 소정 영역에 돌출 뉴런의 유형에 대한 정보를 iding.

Introduction

특정 신경 (마이크로) 회로를 정의하기 위해, 상기 하나의 회로는, 자신의 접속 패턴의 다양한 참여자를 발견함으로써 시작한다. 이제까지의 lesioning ^1을 통해 신경 해부학 추적 기술의 큰 다양성을 추적 neurofiber에 대한 월러의 게시가 설립되었습니다입니다. 1,971 ^5-6 발견으로 이들 기술 중 일부는 고정 된 조직 사후 ^2-4에 적용 할 수있는, 다른 라이브 뉴런 염료의 활성 전송에 의존한다. 후자는 또한 (주어진 돌기의 근원, 즉에 주입 영역으로부터. 면적 상기 돌출되는 뉴런 인 somata) 활성 역행 활용 방법을 구별 두 그룹으로 분할 될 수 있고, 활성 선행 성 (주입로를 주어진 투사의 대상, 즉. 축삭 돌기 및 레이블 뉴런) 수송의 축삭 터미널 지역. 또한, 어떤 경우에는 TRACER 재료는 다음 다른 경우에는 외식 뇌가 주입하는 동안, (생체 내 추적 주사에) 몇 일 또는 몇 주에 의해 주입을 생존과 인공 뇌척수액에 주입 후 몇 시간 동안 품어 살아있는 동물에 주입 (체외 추적 주사) .

이 프로토콜에서 우리는 생체 전기 기술 ^7-8에서

Protocol

1. 광학 유전자형

마우스 새끼 1. 광학 유전자형

1. 적합한 여기 파장의 레이저 포인터를 이용하여 각각의 형광 마커의 발현을 검사 (여기 기재된 실험에서 405 ㎚) 및 여기 파장을 차단하는 필터 고글 대응하지만, 발광 파장을 전달 (450 - 여기에 설명 된 실험에서 700 ㎚) . 헤드 또는 마우스 새끼의 척수의 뒤에 레이저 포인터를 가리 키 (도 1 참조). 눈과 레이저 빛에 피부의 긴 노출에 레이저를 빛나는하지 마십시오.

이전 동물 2. 광학 유전자형

1. 깊이 복강 내 주사 (120 ㎎ / ㎏ 체중)을 통해 펜 토바 비탈의 과다 복용으로 (여기에 설명 된 실험에서 P138에 세 P14) 마우스를 마취. 동물의 반사 신경을 확인하여 적절한 마취를 확인 (잠​​시 일의 끝을 꼬집어전자 귀 또는 뒷다리 중 하나는 귀 또는 다리)의 수축 반사를 유도합니다.
2. 참고 : 동물이 여전히 이상적으로 (즉, 그 중심은 여전히 박동) 살아 있기 때문에 펜 토바 비탈 (120 ㎎ / ㎏ 체중)의 과다 복용의 사용에도 불구하고 우리는 대신 안락사의 "깊은 마취"로 주입 절차를 참조 할 때 수술 및 관류이....

Results

레이저 포인터 레이저 고글은 신속하고 저렴 쓰레기에서 GFP 양성 동물 유전자형 할 수있는 방법 1 및도 2를 도시한다. 어린 마우스 새끼의 경우, 기술은 비 침습적 두개골 상부 피부 (- D도 1a)를 통해 동물의 뇌에서 GFP 라벨을 식별하는 데 사용될 수있다. 방출 된 형광은 적어도 최대 3 일 산후 (도 1C)에 피부와 새끼 마우스의 두개골을 통해 알 수있다. 절차는 우리의 녹색 형광 단백질 (GFP) 그림 1에 표시되어 신경 세포의 글라이신 하위 집단 (GlyT2-GFP)에 GFP를 발현하는 마우스 라인을 표시. 두꺼운 두개골과 피부 착색 이전 동물, GFP 라벨은 피부 및 뼈를 통해 덜 나타내며, 따라서 헤드 및 / 또는 목 피부는 광 유전자형 (도 2A) 전에 제거 될 필요가있다.

를 관류 한 후동물의 뇌는 꺼내어.......

Discussion

, 생체 내 추적 연구에 반대 체외 추적 전기의 일반적인 강도는 고가의 정위 (종종 전기 생리학) 장비를 포함하지 않는, 그것은 연구자에게 따라서 관심과의 뇌 영역에 더 접근 할 수 있다는 것입니다. 덱스 트란 아민 및 다른 트레이서의 사용에 대한 상세한 검토를 참조 (생체 트레이서 주사의 경우가 아닌 일 또는 주 - 또한, 뇌 이식편 필요한 생존 기간은 몇 시간 (4 일)에 걸쳐 Lanciego 및 Wouterlood 2011 년 ^22뿐만 아니라,로드 리 게스 - 콘트레라스, 등. 2008 년 ^23)에 의해 생체 내 주사에 그래서, 실패 주사가 빠르면 주입 절차를 수행하는 동안 등을 검출 할 수 있도록 또는 다음 날에, 늦어도 주입 파라미터를 적절히 조정할 수있다. 뇌 이식편 대 짧은 생존 기간도 <간의 작은 차이는 일반적으로 존재한다는 것을 의미EM> 효과 (염료가 선행 성 뉴런 또는 역행 주사.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S7653	달리 명시되지 않는 한 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 가져온 것입니다.
염화칼륨		P9333
인산칼륨 일염기성		P5655
인산나트륨 이염기성		S907
염화		M2670
염화		C5080
포도당		G7528
중탄산		S6297
아스코르브산		A4544
Myo-inositol		I5125
나트륨 피루브산		P2256
소 혈청 알부민		A2153	옵션, 추가 (면역)조직화학
Triton-X-100		X100	옵션, 추가 (면역)조직화학
폴리(에틸렌 글리콜), 8000 MW		P2139	옵션, 뇌 청소용
포름아미드	피셔 사이언티픽	F84	옵션, 뇌 청소용
콜레라톡신 서브유닛-b	분자 프로브	C-34776 (Alexa 555)
덱스트란 테트라메틸-로다민	분자 프로브	D-7162 (Alexa 555)
형광 Nissl	Invitrogen	N-21479 (파란색)	옵션
파라포름알데히드	Fisher Scientific	SF93
아가로스	인비트로겐	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech 제약	치명적 플러스
붕규산 유리 필라멘트	Harvard Apparatus	G150F-10
피펫 풀러	Zeitz Instruments, 독일	DMZ Universal Puller
관류 설정	맞춤형
레이저 포인터	laserpointerpro.com, 홍콩	HK-88007294 (405 nm)
필터/안전 고글	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, 스위스	Wild M3	고휘도 조명기(MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
MC Stimulus 소프트웨어가 설치된 PC	Multi Channel Sys-tems, 독일 (소프트웨어)
2채널 자극기	Multi Channel Sys-tems, 독일	STG-1002
자극 격리 장치	A.M.P.I., 이스라엘	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, 일본	YOU-1
Vibratome	Leica, 독일	VT1000S